CN102898322A - 一种化合物及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种化合物，其分子式为C₃₆H₃₄N₂O₁₀，分子量为654，且其结构式如下：

Description

一种化合物及其制法和用途

【技术领域】

本发明属于医药卫生及食品化工领域，具体涉及具有保肝护肝和抗炎镇痛作用及可用于预防和治疗急慢性肝炎、胆囊炎、胃炎、疼痛及其相关疾病的一种化合物及其制法和用途。

【背景技术】

肝脏是动物体内的解毒器官和重要的代谢场所。受环境污染、生活习惯和药物等各方面影响，肝病已成为严重危险人类健康的常见传染病、多发病之一，各种有害因素所致肝损伤可表现为肝坏死、脂肪肝、胆汁郁滞、肝纤维化等。根据其病因可分为病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、药物中毒性肝炎、遗传代谢性肝病和其他感染因子引起的肝炎。我国是世界上乙肝患者最多的国家，全国约有1.2亿人携带乙肝病毒，其中慢性乙肝患者约3000万例，每年有35万人死于慢性乙肝相关疾病。肝病的防治是一个全球性的严峻课题。目前针对肝炎肝病治疗仍以化学药物为主，其对病毒性肝炎特别是慢性肝炎的防治尚无明确疗效，且毒副作用大；天然的药物有茯苓多糖、甘草酸二胺、水飞蓟素等，但仍难以根治发病机制复杂多变的肝炎。因此，肝病的防治和新药开发非常重要，特别是从自然界寻求毒副作用更小的天然产物更有意义和前景。

自然界中存在了一类化合物：吐昔酸(truxillic acid)和吐星酸(truxinic acid)及其衍生物，迄今为止该类化合物发现数量较少，仍以合成居多。研究表明，α-吐昔酸和β-吐星酸及其衍生物均表现出较强的抗炎和镇痛活性，且毒性非常小，如4,4-Dihydroxy-α-truxillic Acid具有良好的抗炎活性，作用强于洛索洛芬钠和双氯芬酸钠(Yu-Ming CHI,et al.Anti-inflamma tory Activity of 4,4-Dihydroxy-α-truxillic Acid.Biol.Pharm.Bull.2006,29(3):489-493)，其衍生物Incarvillateine抗炎镇痛活性更强，且福尔马林试验中镇痛作用强于吗啡(Yu-Ming CHI,etal.Antinociceptive Activities ofα-Truxillic Acid and β-TruxinicAcid Derivatives.Biol.Pharm.Bull.2006,29(3):580-584)。有的还具有降压活性，如caracsandiamide，有的作为神经肌肉阻滞剂已在临床使用，如曲库碘铵(cyclobutonium)。有人预测α-吐昔酸的双氮四元衍生物将是一类极富潜力和希望的M2mAChR受体抑制剂(M Krauze-Baranows ka.Truxillicand truxinic acids-occurrence in plant kingdom.Acta PoloniaePharmaceutica.2002,59(5):403-410)。可见吐昔酸或吐星酸衍生物可能会发展成为一种新型抗炎镇痛药物，用于肝炎等疾病的防治。

鸡骨草为豆科植物相思子属广州相思子(Aburs cantoniensis Hance)和毛鸡骨草(Abrus mollis Hance)的干燥全株；其性凉味甘淡，功能利湿退黄，清热解毒，疏肝止痛；用于湿热黄疸，胁肋不舒，胃脘胀痛，乳痈肿痛；临床用于治疗急慢性肝炎、肝硬化腹水、胆囊炎、乳腺炎、风湿痹痛、蛇伤、小便刺痛、小儿疳积、疥疮等病症，还可用作夏季清凉饮料。两广民间历来用鸡骨草来治疗黄疸病，主要分布于广东、广西、湖南、福建和海南等地，由于在治疗传染性肝炎方面具有显著疗效，从民间草药使用发展到中成药制剂，广泛应用于临床，现有鸡骨草冲剂、复方鸡骨草片、鸡骨草丸等剂型。文献研究表明，鸡骨草有效成分具有保肝护肝、抗炎、免疫调节、改善高血脂症、抗菌、抗病毒等作用。国内外对鸡骨草的化学成分研究表明主要含黄酮类、皂苷类、生物碱(如腺嘌呤、腺嘌呤核苷、相思子碱、下箴刺桐碱、红豆碱、胆碱)、蒽醌类、有机酸、色原酮类化合物、氨基酸和多糖等。然而迄今为止，尚未从鸡骨草中发现一种吐昔酸衍生物的新化合物。

【发明内容】

本发明的目的在于针对以上所述现有技术存在的不足，提供从常用中药鸡骨草中分离出来的2个具有生物活性的同分异构体化合物（命名为鸡骨草甲素和鸡骨草乙素），从而显著提高中药鸡骨草的开发利用价值和经济效益。

本发明的另一目的是提供上述化合物（鸡骨草甲素和鸡骨草乙素）的制法。

本发明的第三目的是提供上述化合物（鸡骨草甲素和鸡骨草乙素）在保肝护肝和抗炎镇痛作用及其在预防和治疗急慢性肝炎、胆囊炎、胃炎、疼痛及其相关疾病的用途。

为了实现上述目的，本发明是这样实现的：一种化合物，其分子式为C₃₆H₃₄N₂O₁₀，分子量为654，且其结构式如下：

一种化合物，其分子式为C₃₆H₃₄N₂O₁₀，分子量为654，且其结构式如下：

一种化合物的制法，包括鸡骨草以溶剂法提取，经浓缩、醇沉、柱层析分离及重结晶后分别得到鸡骨草甲素和乙素，具体由以下步骤制备得到：

①以水溶性溶剂作为提取溶剂提取中药鸡骨草原料，将提取液浓缩至相当于每毫升含原药材0.05～20g的溶液，得到提取浓缩液。其中所述的水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇或者丙酮中的一种溶剂或一种以上溶剂组成的任意混合溶剂。

②将上述①步骤得到的浓缩液进行过滤（可以是离心过滤)，将滤液(上清液)上样于层析柱，以水和体积比浓度为40～50%乙醇或甲醇水溶液洗脱至洗脱液接近无色(弃去)，无色的判断是滴加三乙胺溶液颜色未变深，再用含体积比50%以上乙醇或甲醇水溶液或pH>7的碱性水溶性溶剂洗脱，收集洗脱液，减压回收至干，得到含有鸡骨草甲素和有鸡骨草乙素的粗品。其中所述滤液(上清液)可以先进行醇沉或水沉处理浓缩后再上样于层析柱。其中所述层析柱选自聚酰胺树脂柱或大孔吸附树脂柱；所述pH>7的碱性水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇或丙酮的一种溶剂或一种以上溶剂组成混合溶剂，其中调pH值>7的碱可以选自氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、三乙胺、三丁胺或三乙醇胺。

③将②步骤得到的含鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的粗品,上反相硅胶层析柱，以梯度流动相进行梯度层析分离，收集各分离液，用HPLC于波长275nm检测，合并保留时间一致的分离液，分别减压回收至干，分别用少量水溶性溶剂溶解，结晶，先后分别得到鸡骨草乙素和鸡骨草甲素。其中所述的反相硅胶层析柱选自反相硅胶为C₁₈、C₈、C₄的一种或一种以上的任意混合物。所述梯度流动相选自体积比100:0变化到0:100的水:乙醇、水:丙酮、水:甲醇或水:乙腈；所述的水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇、丙酮的一种溶剂或一种以上的溶剂组成的任意混合溶剂;所述的HPLC条件为150mm*4.6mm的5μm的C18色谱柱，流动相为甲醇-0.1%甲酸或乙酸或磷酸或三氟乙酸水溶液在0～20分钟中甲醇由20%变化到95%，流速为1.0ml/min，保留时间在8.9min为鸡骨草乙素，保留时间在10.1min处为鸡骨草甲素。

一种化合物的制法，由以下步骤制备得到：

①以水溶性溶剂作为提取溶剂提取中药鸡骨草原料，将提取液浓缩得到提取浓缩液；

②将①的浓缩液用正相硅胶拌匀后干燥或将浓缩液进行醇沉或水沉浓缩后再用适量正相硅胶拌匀后干燥，上样于正相硅胶层析柱，用梯度有机溶剂进行层析分离，收集收集体积比80:20变化到20:80的分离液，减压回收至干，得到提取物，用适量水溶解后上样于聚酰胺或大孔树脂层析柱，以水和体积比浓度为的40～50%乙醇或甲醇水溶液洗脱至洗脱液接近无色(弃去)，滴加三乙胺溶液颜色未变深，再用含体积比浓度为50%以上乙醇或甲醇水溶液或pH>7的碱性水溶性溶剂洗脱，收集洗脱液，减压回收至干，得到含有鸡骨草甲素和鸡骨草乙素粗品；其中所述的梯度有机溶剂选自有机溶剂A(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇的一种或一种以上的溶剂组成的任意混合溶剂)与有机溶剂B(丙酮、乙醇、甲醇的一种或一种以上的溶剂组成的任意混合溶剂)按体积比100:0变化到20:80；

③将②步骤得到的鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的粗品,上反相硅胶层析柱，以梯度流动相进行梯度层析分离，收集各分离液，用HPLC于波长275nm检测，合并保留时间一致的分离液，分别减压回收至干，分别用水溶性溶剂溶解，结晶，先后分别得到鸡骨草乙素和鸡骨草甲素。

其中得到的鸡骨草甲素和鸡骨草乙素再经精制过程，再经精制过程为将鸡骨草乙素和鸡骨草甲素分别上反相硅胶层析柱，以梯度流动相进行梯度层析分离，收集各分离液，合并保留时间一致的分离液，分别减压回收至干，用水溶性溶剂溶解，结晶；或者将鸡骨草甲素和鸡骨草乙素以水溶性溶剂进行溶解处理，重结晶，即得到纯度更高的鸡骨草甲素和鸡骨草乙素；其中所述水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈的一种溶剂或一种以上溶剂任意组成混合溶剂。

所述的化合物鸡骨草甲素和鸡骨草乙素为药学上可接受的载体。

所述的化合物可以用于单独或联合或与其他中药或中药提取物或中药有效部位或化学合成药物与药学上可接受的赋性剂或辅料共同制备药物组合物，食品添加剂、保健食品。

所述的化合物具有保肝护肝和抗炎镇痛作用及在制备预防和治疗急慢性肝炎、胆囊炎、胃炎、疼痛及其相关疾病药物中的应用。

所述的化合物在于急慢性肝炎、胆囊炎、胃炎、疼痛及其相关疾病包括：病毒性肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎、酒精性肝损伤、脂肪肝、胆囊炎、胃溃疡、支气管炎、鼻炎、关节炎、头痛、胃痛、癌痛等。

本发明进一步提出所属的中药鸡骨草可以是豆科相思子属植物毛鸡骨草(Abrus mollis Hance)及鸡骨草(Abrus cantoniensis Hance)的全株，优选为毛鸡骨草叶和鸡骨草叶。

本发明的鸡骨草甲素和鸡骨草乙素可以作为药物活性成分制备成各种临床药物制剂，其中含有有效量的鸡骨草甲素和（或）鸡骨草乙素及药学上可接受的载体。还可以单独或联合或与其他中药或中药提取物或中药有效部位或化学合成药物与药学上可接受的赋性剂或辅料共同制备药物组合物。

上述各种药物组合物均可采用药剂学的常规方法制备成各种剂型，如片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸、缓释剂、口服液、袋泡剂等口服制剂及注射剂等胃肠外给药剂型，食品添加剂或者保健食品等。

药理试验表明，本发明的鸡骨草甲素和鸡骨草乙素具有显著的保肝护肝和抗炎镇痛作用。鸡骨草甲素和鸡骨草乙素可以作为活性成分制备预防和治疗急慢性肝炎、胆囊炎、胃炎、疼痛及其相关疾病药物；可应用于治疗与预防急慢性肝炎、胆囊炎、胃炎、疼痛及其相关疾病；急慢性肝炎、胆囊炎、胃炎、疼痛及其相关疾病包括病毒性肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎、酒精性肝损伤、脂肪肝、胆囊炎、胃溃疡、支气管炎、鼻炎、关节炎、头痛、胃痛或者癌痛等。

【具体实施方式】

下面将通过实施例对本发明做进一步描述，但本发明并不限于实施例所述范围。

一种化合物，其分子式为C₃₆H₃₄N₂O₁₀，分子量为654，且其结构式如下：

化学名称为(2S,2'S)-2,2'-(((1R,2R,3S,4S)-2,4-双(4-羟基苯基)环丁烷二羰基)双(脲二基))双(3-(4-羟基苯基)丙酸)[(2S,2'S)-2,2'-(((1R,2R,3S,4S)-2,4-bis(4-hydroxyphenyl)cyclobutanedicarbonyl)bis(azanediyl))bis(3-(4-hydroxyphenyl)propanoicacid)]，命名为鸡骨草甲素(abrusamide A)。

结构鉴定：

鸡骨草甲素为白色至淡黄色结晶粉末，易溶于甲醇、乙醇、乙腈，微溶于水；UV：226nm，278nm。Positive-ESI-MS m/z：655.2234[M+H]⁺、677.2112[M+Na]⁺，结合NMR-¹³C谱、¹H谱信息推断化合物的分子式为C₃₆H₃₄N₂O₁₀。¹H NMR(500MHz，MeOD)δppm：7.00(1H each,d,J=8.5Hz,H-2″,6″,2′″,6′″)，6.96(1H each,d,J=8.5Hz,H-2,6,2′,6′)，6.70(1H each,d,J=8.5Hz,H-3,5,3′,5′)，6.61(1H each,d,J=8.5Hz,H-3″,5″,3′″,5′″)，4.55(1H each,dd,J=4,9Hz,H-8″,8′″)，3.48(1H each,dd,J=5.5,9Hz,H-7,7′)，3.10(1H each,dd,J=4,14Hz,H-7″,7′″)，3.07(1H each,dd,J=5.5,9Hz,H-8,8′)，2.84(1H each,dd,J=9,14Hz,H-7″,7′″)。¹³C NMR(125MHz，MeOD)δppm：176.989(C-9″,9′″)，174.406(C-9,9′)，157.270(C-4,4′)，157.015(C-4″,4′″)，134.006(C-1,1′)，131.368(C-2″,6″,2′″,6′″)，129.894(C-1″,1′″)，129.136(C-2,6,2′,6′)，116.330(C-3,5,3′,5′)，116.151(C-3″,5″,3′″,5′″)，56.996(C-8″,8′″)，48.194(C-8,8′)，46.838(C-7,7′)，37.607(C-7″,7′″)。

鸡骨草甲素的结构鉴定：白色至淡黄色结晶粉末。其紫外光谱吸收特征表明含苯环结构(226nm，278nm)。由高分辨质谱(Positive-ESI-MSm/z：655.2234[M+H]⁺、677.2112[M+Na]⁺)推断该化合物的分子式为C₃₆H₃₄N₂O₁₀(分子量为654.2213)。从化合物的核磁共振氢谱和碳谱只能推断存在两个酪氨酸和木质素单元，结合分子式可以推断该化合物应该是对称结构。由δ7.00(2H,d,J=8.5Hz),δ6.61(2H,d,J=8.5Hz),δ4.55(1H,dd,J=4,9Hz),δ3.10(1H,dd,J=4,14Hz),δ2.84(1H,dd,J=9,14Hz)结合其碳谱推断出2个酪氨酸骨架。去除2个酪氨酸骨架，其余的氢谱和碳谱数值也类似于酪氨酸或对香豆酸结构，其中存在一个重要的不同之处是缺少了对香豆酸的反式烯质子，根据碳谱数据，该2个质子应该是饱和的；结合核磁共振数据和分子量，除2个酪氨酸，剩余结构式C₁₈H₁₄O₄这是对香豆酸去掉一个羟基的两倍，具2个酰基团、环丁烷环和2个4-羟基苯基。从生物合成途径角度来看，这种酰基团可能是由2个对香豆酸通过[2+2]环加成反应成吐昔酸型(7.8′，8.7′)或吐星酸型(7.7′，8.8′)结构。根据丁基质子化学位移、偶合模式和HMBC、HSQC、NOESY图谱，推断出化合物为吐昔酸型而不是吐星酸型，通过NOES Y谱可以得到：H-8″与H-8存在相关，H-8′与H-8′″存在相关，H-8与H-7、H-6′（H-2′）存在相关，H-8′与H-7′、H-6（H-2）存在相关。最后，通过HMBC图谱中碳氢远程相关，羰基信号δ176.989，174.406和饱和碳信号δ37.607与H质子δ4.55(1H,dd,J=4,9Hz)相关，推断出与9(9′)酰基相连接的是酪氨酸的氨基。综合上述解析，得出该化合物的结构为(2S,2'S)-2,2'-(((1R,2R,3S,4S)-2,4-双(4-羟基苯基)环丁烷二羰基)双(脲二基))双(3-(4-羟基苯基)丙酸))[(2S,2'S)-2,2'-(((1R,2R,3S,4S)-2,4-bis(4-hydroxypheny l)cyclobutanedicarbonyl)bis(azanediyl))bis(3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid)]。

一种化合物，其分子式为C₃₆H₃₄N₂O₁₀，分子量为654，且其结构式如下：

化学名称为(2S,2'S)-2,2'-(((1S,2S,3S,4S)-2,4-双(4-羟基苯基)环丁烷二羰基)双(脲二基))双(3-(4-羟基苯基)丙酸))[(2S,2'S)-2,2'-(((1S,2S,3S,4S)-2,4-bis(4-hydroxypheny l)cyclobutanedicarbonyl)bis(azanediyl))bis(3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid)]，命名为鸡骨草乙素(abrusamide B)。

鸡骨草乙素：淡棕色结晶粉末，易溶于甲醇、乙醇、乙腈，微溶于水；UV：226nm，278nm。Positive-ESI-MSm/z：655.2316[M+H]⁺、677.2137[M+Na]⁺，结合NMR-¹³C谱、¹H谱信息推断化合物的分子式为C₃₆H₃₄N₂O₁₀。¹H NMR(500MHz，DMSO)δppm：6.97(1H each,d,J=8.5Hz,H-2″,6″,2′″,6′″)，6.85(1Heach,d,J=8.5Hz,H-2,6,2′,6′)，6.63(1H ea ch,d,J=8.5Hz,H-3,5,3′,5′)，6.59(1H each,d,J=8.5Hz,H-3″,5″,3′″,5′″)，4.38(1H each,m,J=4,9.5Hz,H-8″,8′″)，3.48(1H each,t,J=9Hz,H-7,7′)，2.95(1H each,dd,J=4,14Hz,H-7″,7′″)，2.88(1H each,t,J=9Hz,H-8,8′)，2.75(1H each,dd,J=9.5,14Hz,H-7″,7′″)。¹³CNMR(125MHz，DMSO)ppm：173.220(C-9″,9′″)，171.700(C-9,9′)，155.807(C-4,4′)，155.674(C-4″,4′″)，132.236(C-1,1′)，130.023(C-2″,6″,2′″,6′″)，127.809(C-1″,1′″)，127.251(C-2,6,2′,6′)，114.886(C-3,5,3′,5′)，114.869(C-3″,5″,3′″,5′″)，54.048(C-8″,8′″)，48.889(C-8,8′)，41.126(C-7,7′)，35.773(C-7″,7′″)。

鸡骨草乙素的结构鉴定：淡棕色结晶粉末。其紫外光谱吸收特征与鸡骨草甲素一致，表明含苯环结构(226nm，278nm)。由高分辨质谱(Positive-ESI-MS m/z：655.2316[M+H]⁺、677.2137[M+Na]⁺)推断该化合物的分子式为C₃₆H₃₄N₂O₁₀(分子量为654.2213)。从化合物的核磁共振氢谱和碳谱推断鸡骨草乙素与鸡骨草甲素为同分异构体，其差异主要在碳(7，8，7′，8′)的位移值及其氢(7，8，7′，8′)的偶合常数，化合物1的氢(7，8，7′，8′)的偶合常数有两个J=5.5Hz，9Hz，而化合物2的氢(7，8，7′，8′)只有一个偶合常数J=9Hz，表明鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的丁基质子的空间构型不一样，可推断出鸡骨草乙素的绝对构型，由NOES Y谱进一步证实了鸡骨草乙素的构型：H-8″与H-8存在相关，H-8′与H-8′″存在相关，H-8与H-2（H-6′）存在相关，H-8′与H-6（H-2′）存在相关，但H-7(H-7′)与H-2、H-6、H-2′、H-6′无相关。综合上述解析，得出该化合物的结构为(2S,2'S)-2,2'-(((1S,2S,3S,4S)-2,4-双(4-羟基苯基)环丁烷二羰基)双(脲二基))双(3-(4-羟基苯基)丙酸))[(2S,2'S)-2,2'-(((1S,2S,3S,4S)-2,4-bis(4-hydroxyphenyl)cyclobutanedicarbonyl)bis(azanediyl))bis(3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid)]。

本发明所述的化合物鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的制法包括：

(1)鸡骨草甲素和鸡骨草乙素提取、分离、精制：取鸡骨草适量以溶剂法提取，经浓缩、醇沉、柱层析分离及重结晶后的鸡骨草甲素和鸡骨草乙素。

(2)鸡骨草甲素和乙素的结构鉴定：经核磁共振谱、质谱、紫外光谱等鉴定，证实为鸡骨草甲素和鸡骨草乙素。

一种化合物鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的制法，其步骤包括：

①以水溶性溶剂作为提取溶剂提取中药鸡骨草原料，将提取液浓缩至相当于每毫升含原药材0.05～20g的溶液，得到提取浓缩液。其中所述的水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇或丙酮的一种溶剂或一种以上的溶剂组成的任意混合溶剂。

②上述①步骤得到的浓缩液过滤(可以是离心过滤)去除沉淀物质或粉末药渣使滤液澄清，将滤液(上清液)上样于层析柱或将滤液(上清液)先进行醇沉或水沉处理浓缩至相当于每毫升含原药材0.1～30g的溶液后再上样于层析柱，以水和体积比浓度为的40～50%乙醇或甲醇水溶液洗脱至洗脱液接近无色(弃去)，接近无色的判断标准可以是滴加三乙胺溶液颜色未变深，再用含体积比浓度为50%以上乙醇或甲醇水溶液或pH>7的碱性水溶性溶剂洗脱，收集洗脱液，减压回收至干，得到含有鸡骨草甲素和鸡骨草乙素粗品。其中，所述的层析柱选自聚酰胺树脂柱或大孔吸附树脂柱,所述pH>7的碱性水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇或丙酮的一种溶剂或一种以上溶剂组成混合溶剂，其中调pH值>7的碱可以选自氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、三乙胺、三丁胺或三乙醇胺。其中的层析用聚酰胺树脂的规格可选自30-60目、60-100目、100-200目、200目等以上的各种孔径，其中的大孔吸附树脂为聚苯乙烯骨架的极性或非极性大孔吸附树脂，可选自D101型、HPD100型、HPD200型、AB-8型或D401型。

③上述②步骤得到的含鸡骨草甲素和鸡骨草乙素粗品,上反相硅胶层析柱，以梯度流动相进行梯度层析分离，收集各分离液，用HPLC于波长275nm检测，合并保留时间一致的分离液，分别减压回收至干，用适量水溶性溶剂溶解，结晶，先后分别得到鸡骨草乙素和鸡骨草甲素。其中所述的层析柱选自反相硅胶C₁₈、C₈、C₄的一种或一种以上的任意混合物。所述梯度流动相选自体积比为100:0变化到00:100的水:乙醇、水:丙酮、水:甲醇或水:乙腈；所述的水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇、丙酮的一种溶剂或一种以上的溶剂组成的任意混合溶剂；所述的HPLC条件为150mm*4.6mm的5μm的C18色谱柱，流动相为甲醇-0.1%甲酸或乙酸或磷酸或三氟乙酸水溶液在0～20分钟中甲醇由20%变化到95%，流速为1.0ml/min，保留时间在8.9min为鸡骨草乙素，保留时间在10.1min处为鸡骨草甲素。

一种化合物鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的制法，可以通过包括以下步骤制备：

②将上述步骤①得到的提取浓缩液，用适量正相硅胶拌匀后干燥或将浓缩液进行醇沉或水沉浓缩后再用适量正相硅胶拌匀后干燥，上样于正相硅胶层析柱，用梯度有机溶剂进行层析分离，收集分离液，减压回收至干，得到提取物，用少量水溶解后上样于聚酰胺或大孔树脂层析柱，以水和体积比浓度为的40～50%乙醇或甲醇水溶液洗脱至洗脱液接近无色(弃去)，滴加三乙胺溶液颜色未加深，再用含体积比浓度为50%以上乙醇或甲醇水溶液或pH>7的碱性水溶性溶剂洗脱，收集洗脱液，减压回收至干，得到含有鸡骨草甲素和鸡骨草乙素粗品。其中所述的梯度有机溶剂选自有机溶剂A(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇的一种或一种以上的溶剂组成的任意混合溶剂)与有机溶剂B(丙酮、乙醇、甲醇的一种或一种以上的溶剂组成的任意混合溶剂)按体积比100:0变化到20:80。

③上述②步骤得到的鸡骨草甲素和鸡骨草乙素粗品,上反相硅胶层析柱，以梯度流动相进行梯度层析分离，收集各分离液，用HPLC于波长275nm检测，合并保留时间一致的分离液，分别减压回收至干，用少量水溶性溶剂溶解，结晶，先后分别得到鸡骨草乙素和鸡骨草甲素；其中，所述的反相硅胶层析柱选自反相硅胶为C₁₈、C₈、C₄的一种或一种以上的任意混合物。所述的梯度流动相选自体积比100:0变化到0:100的水:乙醇、水:丙酮、水:甲醇或水:乙腈；所述的水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇、丙酮的一种溶剂或一种以上的溶剂组成的任意混合溶剂；所述的HPLC条件为150mm*4.6mm的5μm的C18色谱柱，流动相为甲醇-0.1%甲酸或乙酸或磷酸或三氟乙酸水溶液在0～20分钟中甲醇由20%变化到95%，流速为1.0ml/min，保留时间在8.9min为鸡骨草乙素，保留时间在10.1min处为鸡骨草甲素。

上述方法得到的鸡骨草甲素和乙素再经精制过程，便能得到纯度更高的鸡骨草甲素和乙素。所述的精制方法为与步骤③同样的层析方法纯化，或者将鸡骨草甲素和鸡骨草乙素以水溶性溶剂进行溶解处理，重结晶，即得到纯度更高的鸡骨草甲素和鸡骨草乙素。其中所述水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈的一种溶剂或一种以上溶剂组成的任意混合溶剂。

实施例1

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的制备

取（毛）鸡骨草叶药材500g，加体积比浓度为50%乙醇回流提取2次，合并提取液，减压回收至无醇味或适量，离心过滤，得上清液A。将上清液A上样于以处理好的聚酰胺或大孔树脂柱吸附后，依次用去离子水、体积比浓度为50%乙醇、体积比浓度为95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液，减压蒸干，残渣用少量水溶解,上C₁₈反相硅胶层析柱，以体积比浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的甲醇水溶液进行梯度层析分离，收集各分离液，减压回收至干，残渣用适量水和甲醇溶解，放置，先后分别析出鸡骨草乙素和鸡骨草甲素，分别用甲醇和水重结晶，分别得鸡骨草甲素和鸡骨草乙素。

实施例2

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的制备

取（毛）鸡骨草叶药材500g，加水或95%乙醇回流2次，合并提取液，减压回收至适量，加入适量乙醇或水至含醇量50%沉淀处理，浓缩至适量，得浓缩液B。将浓缩液B上样于以处理好的聚酰胺或大孔树脂柱吸附后，依次水、体积比浓度为50%乙醇、pH10氨水溶液洗脱，收集pH10氨水溶液洗脱液，减压蒸干，残渣用少量水溶解,上C₁₈反相硅胶层析柱，以体积比浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的甲醇水溶液进行梯度层析分离，收集各分离液，减压回收至干，残渣用适量水和甲醇溶解，放置，先后分别析出鸡骨草乙素和鸡骨草甲素，分别用甲醇和水重结晶，分别得鸡骨草甲素和鸡骨草乙素。

实施例3

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的制备

实例1所得的上清液A或实施例2所得的浓缩液B，用适量正相硅胶拌匀后干燥，上样于正相硅胶层析柱，分别用氯仿、正丁醇、正丁醇-乙醇(50:50)进行层析分离，收集正丁醇，正丁醇-乙醇(50:50)分离液，分别减压回收至干，合并残渣，加适量水溶解，上样于已处理好的聚酰胺或大孔树脂柱吸附后，依次水、体积比浓度为45%的乙醇、体积比浓度为95%乙醇溶液洗脱，收集95%乙醇洗脱液，减压蒸干，残渣用少量水溶解,上C₁₈反相硅胶层析柱，以体积比浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的乙醇水溶液进行梯度层析分离，收集各分离液，减压回收至干，残渣用水和乙醇溶解，放置，先后分别析出鸡骨草乙素和鸡骨草甲素，分别用甲醇和水重结晶，分别得鸡骨草甲素和鸡骨草乙素。

实施例4

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的制备

实例1所得的上清液A或实施例2所得的浓缩液B，用适量正相硅胶拌匀后干燥，上样于正相硅胶层析柱，分别用氯仿、氯仿-甲醇(20:80)进行层析分离，收集氯仿-甲醇(20:80)分离液，减压回收至干，合并残渣，加适量水溶解，上样于以处理好的聚酰胺或大孔树脂柱吸附后，依次水、体积比浓度为50%的乙醇、75%乙醇、pH9氨水溶液洗脱，收集体积比浓度为75%的乙醇和pH9氨水溶液洗脱液，减压蒸干，残渣用少量水溶解,上C₁₈反相硅胶层析柱，以体积比浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的乙醇水溶液进行梯度层析分离，收集各分离液，减压回收至干，残渣用水和乙醇溶解，放置，先后分别析出鸡骨草乙素和鸡骨草甲素，分别用甲醇和水重结晶，分别得鸡骨草甲素和鸡骨草乙素。

实施例5

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的制备

实例1所得的上清液A或实施例2所得的浓缩液B，用适量正相硅胶拌匀后干燥，上样于正相硅胶层析柱，分别用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇(20:80)进行层析分离，收集乙酸乙酯-甲醇(20:80)分离液，分别减压回收至干，合并残渣，加适量水溶解，上样于以处理好的聚酰胺或大孔树脂柱吸附后，依次水、体积比浓度为50%的乙醇、pH11氨水溶液洗脱，收集pH 11氨水溶液洗脱液，减压蒸干，残渣用少量水溶解,上C₁₈反相硅胶层析柱，以体积比浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的乙醇水溶液进行梯度层析分离，收集各分离液，减压回收至干，残渣用水和乙醇溶解，放置，先后分别析出鸡骨草乙素和鸡骨草甲素，分别用甲醇和水重结晶，分别得鸡骨草甲素和鸡骨草乙素。

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素对L-02人正常肝细胞的毒性作用

取处于对数生长期的人系L-02肝细胞，用胰酶消化后，调整细胞悬液密度为1×10⁶/mL，以10%小牛血清的RPMI1640培养基均匀接种于96孔培养板中，每孔100μL(边缘孔用无菌PBS填充)。5%CO2，37℃孵育培养24h后，弃去培养液，分别加入12.5，25，50，100，200，400，600，800μg·ml^-1的鸡骨草甲素或鸡骨草乙素，每组设4个复孔，另设正常对照孔和调零孔，5%CO₂，37℃孵育12h后各孔加入20μL 0.5%的MTT，37℃避光培养4h。终止培养，小心弃上清液，各孔加入100μL DMSO，混匀，振荡器振荡1min，使结晶物充分溶解。酶标仪在波长570nm处测定其吸光度(A)值，以A间接反映L-02肝细胞在培养孔中的增殖密度。以正常组细胞存活率为100%，A其余组与A正常组相除计算细胞存活率。结果如下表：

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素对L-02细胞的毒性作用

注：*表示P<0.05vs正常对照组

结果显示，鸡骨草甲素和鸡骨草乙素推测在500μg/ml以下对L-02细胞存在促进增殖的作用，在400μg/ml时其促进增殖的作用最强。但随着浓度的增加其显现出一定的毒性，在800μg/ml时，细胞存活率约为85%，且其加样浓度已达到极限，其对肝细胞的LD₅₀无法计算达到。故总体结果表明该化合物的毒性很低。

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素对四氯化碳致L-02细胞肝损伤的保护作用

将对数生长期的L-02肝细胞以1×10⁴个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μL。实验分4组:CCl₄损伤组、药物保护组、正常对照组和调零组(只加培养液，终浓度5%，不接种细胞)，每组设6个复孔。前三组按培养12h时，吸弃各组培养液，正常对照组加入培养液，损伤组加入CCl₄损伤液，药物保护组分别加入三种相应浓度的含CCl₄损伤液的鸡骨草甲素或鸡骨草乙素含药培养液。继续培养8h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养4h后，吸弃孔内液体，加入100μL DMSO，37℃作用20min，置全自动酶标仪振动后测定各孔光密度值(测试波长为570nm)，各平行孔取均值后计算细胞活性:细胞活性(%)=(OD实验组/OD正常组)×100%(以空白组OD调零)。结果见下表：

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素对CCL₄致L-02细胞肝损伤保护作用

注：*表示P<0.05vs正常对照组；Δ表示P<0.05vsCCL₄损伤组

结果显示：各保护组(同时加入CCL₄和鸡骨草甲素或乙素药物组)，即500ug/ml、250ug/ml、125ug/ml药物保护组的细胞存活率均高于CCL₄损伤组，且均存在显著性差异。实验表明，鸡骨草甲素和乙素对CCL₄致L-02细胞肝损伤模型具有显著的保护作用。

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素对乙醇致L-02细胞肝损伤的保护作用

将对数生长期的L-02肝细胞以1×10⁴个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100μL。实验分4组:乙醇损伤组、药物保护组、正常组和调零组(只加培养液，终浓度5%，不接种细胞)，每组设6个复孔。前三组按培养12h时，吸弃各组培养液，正常组加入培养液，损伤组加入100mmol·L^-1乙醇损伤液，药物保护组分别加入3种相应浓度的含100mmol·L^-1乙醇损伤液的鸡骨草甲素或鸡骨草乙素含药培养液。继续培养8h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养4h后，吸弃孔内液体，加入100μL DMSO，37℃作用20min，置全自动酶标仪振动后测定各孔光密度值(测试波长为570nm)，各平行孔取均值后计算细胞活性:细胞活性(%)=(OD实验组/OD正常组)×100%(以空白组OD调零)。结果见下表：

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素对乙醇致L-02细胞肝损伤保护作用

注：*表示P<0.05vs正常组；Δ表示P<0.05vs乙醇损伤组

结果显示：各保护组(同时加入乙醇和鸡骨草甲素或鸡骨草乙素药物组)，即500ug/ml、250ug/ml、125ug/ml药物保护组的细胞存活率均高于乙醇损伤组，且均存在显著性差异。实验表明，鸡骨草甲素和鸡骨草乙素对乙醇致L-02细胞肝损伤模型具有显著的保护作用。

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素对KM小鼠免疫性肝损伤的影响

将40只体重18-22g的KM小鼠随机分为4组：空白对照组、模型组、鸡骨草甲素给药组（2mg/kg）、鸡骨草乙素给药组（2mg/kg），每组10只。其中正常对照组尾静脉注射0.2ml/20g的灭菌生理盐水，其余4组小鼠尾静脉注射活卡介苗（BCG）0.2ml/20g(约5×10⁷个/20g)，次日起，各药物组按上述剂量给药，正常对照组和模型组均尾静脉注射等体积的灭菌生理盐水，连续12d。除正常对照组外，12d后尾静脉注射脂多糖（LPS）(10μg/20g)，10h后处每组眼部取血，分离血清，测定ALY和AST指标。

鸡骨草甲素和乙素对小鼠免疫性肝损伤的影响结果（mean±SD，n=10）

注：*表示P<0.05vs空白对照组；Δ表示P<0.05vs模型组

上表结果表明，模型组能明显引起小鼠严重肝损伤，小鼠血清中ALT和AST活性明显身高，鸡骨草甲素和鸡骨草乙素2mg/kg可显著降低卡介苗联合脂多糖引起的ALT和AST升高作用。

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素抗炎镇痛试验

福尔马林诱导试验：该实验能较好的模拟临床慢性疼痛，是一种重要的慢性疼痛模型。实验可分为两个时相，分别是注射福尔马林后0-10min内和20-30min，这两个时相引起的疼痛机制不同。第1时相，是刺激伤害性感受器引起的直接效应，能被中枢性镇痛药如吗啡抑制。第2时相，是由前列腺素部分介导的炎症反应，能被非类固醇类抗炎剂、类固醇和中枢性镇痛药抑制。

实验步骤：取KM小鼠（25±5g左右）随机分成4组(鸡骨草甲素给药组、鸡骨草乙素给药组，阳性对照组（消炎痛），空白对照组)，每组10只，不喂食10小时，所有的小鼠用黄色染料标记。给药组和阳性对照组分别按照剂量40mg/kg（0.5%吐温-80盐水配置成浓度）腹腔注射给药20μl，空白对照组按照0.2mg/10g的比例注射生理盐水，注射30分钟后在小鼠右后爪足背皮下注射1.0%福尔马林（0.9%生理盐水）20μl，观察3-分钟，用秒表分别记录注射福尔马林后0-10min(第1时相)和15-30min(第2时相)小鼠舔、咬右爪的时间长度（sec），并累积各相对数据作为各相的评价指标。统计和分析比较如下表所示：

福尔马林诱导试验结果（mean±SD，n=10）

*表示与对照组比较具有显著性（P<0.05）

由上表结果表明，鸡骨草甲素和鸡骨草乙素具有显著的抗炎镇痛作用。

鸡骨草甲素和乙素对水杨酸钠诱发KM小鼠急性胃炎的影响

取小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只，分为空白对照组（生理盐水）、阳性组（甲氰咪胍2mg/kg）、鸡骨草甲素给药量组（鸡骨草甲素2mg/kg）和鸡骨草乙素给药组（2mg/kg）。试验前分别灌胃不同剂量试药、生理盐水连续5d，3次／d，末次给药前24h禁食，末次给药90min后，灌胃20mmol·L-1水杨酸钠100mg/kg，4h后处死取胃，胃内注入10％甲醛8m1，15min后剖检观察胃炎发生情况，计分并计算溃疡抑制率。无胃炎发生计0分：局部充血，轻度炎症计2分；严重充血，局部炎症明显计4分；全胃可见弥漫性炎症变化计6分，结果见下表。

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素对水杨酸钠诱发小鼠急性胃炎影响结果（mean±SD，n=10）

*表示与空白对照组比较具有显著性（P<0.05）

上表结果表明，鸡骨草甲素和乙素分别对水杨酸钠诱发急性胃炎溃疡有明显的抑制作用，与空白组比较，差异显著(P<0.05)。

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素对KM小鼠脂肪肝的影响

将40只小鼠随机分为空白对照组、模型组、鸡骨草甲素给药组（2mg/kg）、鸡骨草乙素给药组（2mg/kg）。正常饲养1周适应后开始造模。每天上午给模型组、鸡骨草甲素和乙素组小鼠分别灌胃自制的脂肪乳剂1mL/100g，空白组灌胃等量蒸馏水。每天下午给药组分别灌鸡骨草甲素2mg/kg和鸡骨草乙素2mg/kg，空白组和模型组灌喂等容量的蒸馏水。21天后，停止灌胃1天，禁食12小时，处死，取出肝脏，在同部位取0.5g进行匀浆，测定肝TC、TG的含量。

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素对小鼠脂肪肝的影响结果（mean±SD，n=10）

注：*表示P<0.05v s空白对照组；Δ表示P<0.05v s模型组

上表结果表明，鸡骨草甲素和鸡骨草乙素具有明显的抗脂肪肝作用。

实施例6

鸡骨草甲素片或鸡骨草乙素片

由以下组分组成：鸡骨草甲素或鸡骨草乙素20g，淀粉46g，淀粉浆（占总重量的10％）适量，糊精14g，蔗糖8g，硬脂酸镁2g。共制成1000片。

制法:将鸡骨草甲素或鸡骨草乙素与41g淀粉、14g糊精和8g蔗糖混匀，加淀粉浆搅拌使成软材，用14目筛制粒，80～90℃通风干燥，干粒加入硬脂酸镁和5g淀粉，整粒，混匀，压片，即得。

实施例7

鸡骨草甲素胶囊或鸡骨草乙素胶囊

由以下组分制成:将鸡骨草甲素或鸡骨草乙素20g与20g淀粉和210g微分纤维素混匀，喷乙醇40ml，搅拌均匀，制成颗粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒，即得。

每粒250mg，含鸡骨草甲素或者鸡骨草乙素10mg。

实施例8

鸡骨草甲素和鸡骨草乙素缓释片

制法：称取40%HPMC、硬脂酸5%、24.5%微晶纤维与30%原料药鸡骨草甲素或乙素充分混匀，过80目筛两次，用10%聚乙烯吡咯烷酮的乙醇溶液作粘合剂，24目筛湿法制粒，60℃鼓风烘干约30min，取出用20目筛整粒，加入0.5%硬脂酸镁混匀后，压制成1000片，片重约160mg，压力8～10kg。

实施例9

注射用鸡骨草甲素或鸡骨草乙素

将鸡骨草甲素或鸡骨草乙素与碳酸钠的无菌混合制成注射用粉末，按平均装量计算，含鸡骨草甲素或鸡骨草乙素应为标示量的95.0%～105.0%。

实施例10

添加鸡骨草甲素或者鸡骨草乙素的解酒护肝茶饮料

配方：葛花20%，陈皮5%，菊花20%，淡竹叶20%，五味子15%，甘蔗汁19.95%，鸡骨草甲素和/或者鸡骨草乙素0.05%。

制法：将葛花、陈皮、菊花、淡竹叶、五味子用水提取2次，滤过，合并滤液，加入甘蔗汁和鸡骨草甲素和/或者鸡骨草乙素，加饮用水至100%，灭菌，灌装，即得具有护肝解酒作用的鸡骨草甲素和/或者鸡骨草乙素茶饮料。

实施例11

添加鸡骨草甲素或鸡骨草乙素的护肝解酒保健品

配方：葛根200g、淡竹叶200g、菊花200g、槐花200g、鸡蛋花200g、五味子200g、白茅根200g、维生素C 5g、牛磺酸5g，鸡骨草甲素和/或者鸡骨草乙素50mg，淀粉适量，滑石粉适量。

制法：将葛根、淡竹叶、菊花、槐花、鸡蛋花、五味子、白茅根用10倍水煎煮2次，每次2小时，合并提取液，浓缩成浸膏，加入维生素C、牛磺酸和鸡骨草甲素（乙素）混匀，再加适量淀粉制成软材，制粒，干燥，整粒，压片，即得具有解酒保肝作用的鸡骨草甲素（乙素）保健品。

根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需要说明的是，以上的实施例仅仅是为了举例说明本发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种化合物，其特征在于，分子式为C₃₆H₃₄N₂O₁₀，分子量为654，且其结构式如下：

2.一种化合物，其特征在于，分子式为C₃₆H₃₄N₂O₁₀，分子量为654，且其结构式如下：

3.根据权利要求1或2所示的一种化合物的制法，其特征在于，包括如下步骤：

①以水溶性溶剂作为提取溶剂提取中药鸡骨草原料，将提取液浓缩，得到提取浓缩液；

②将上述①步骤得到的浓缩液进行过滤，将滤液上样于层析柱，以水和体积比浓度为40～50%乙醇或甲醇水溶液洗脱至洗脱液接近无色，再用含体积比50%以上乙醇或甲醇水溶液或pH>7的碱性水溶性溶剂洗脱，收集洗脱液，减压回收至干，得到含有鸡骨草甲素和有鸡骨草乙素的粗品；或者所述滤液先进行醇沉或水沉处理浓缩后再上样于层析柱；

③将②步骤得到的含鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的粗品,上反相硅胶层析柱，以梯度流动相进行梯度层析分离，收集各分离液合并保留时间一致的成分的分离液，分别减压回收至干，用水溶性溶剂溶解，结晶，先后分别得到鸡骨草乙素和鸡骨草甲素。

4.根据权利要求1或2所示的一种化合物的制法，其特征在于，包括如下步骤：

①以水溶性溶剂作为提取溶剂提取中药鸡骨草原料，将提取液浓缩得到提取浓缩液；

②将步骤①的浓缩液用正相硅胶拌匀后干燥或将浓缩液进行醇沉或水沉浓缩后再用适量正相硅胶拌匀后干燥，上样于正相硅胶层析柱，用梯度有机溶剂进行层析分离，收集体积比80:20变化到20:80的分离液，减压回收至干，得到提取物，用适量水溶解后上样于聚酰胺或大孔树脂层析柱，以水和体积比浓度为的40～50%乙醇或甲醇水溶液洗脱至洗脱液接近无色，再用含体积比浓度为50%以上乙醇或甲醇水溶液或pH>7的碱性水溶性溶剂洗脱，收集洗脱液，减压回收至干，得到含有鸡骨草甲素和鸡骨草乙素粗品；

③将②步骤得到的鸡骨草甲素和鸡骨草乙素的粗品,上反相硅胶层析柱，以梯度流动相进行梯度层析分离，收集各分离液，合并保留时间一致的成分的分离液，分别减压回收至干，用水溶性溶剂溶解，结晶，先后分别得到鸡骨草乙素和鸡骨草甲素。

5.根据权利要求3或4所示的一种化合物的制法，其特征在于，①步骤中所述的水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇或者丙酮中的一种溶剂或一种以上溶剂组成的任意混合溶剂；②步骤中，所述层析柱选自聚酰胺树脂柱或大孔吸附树脂柱；所述pH>7的碱性水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇或丙酮的一种溶剂或一种以上溶剂组成混合溶剂，其中调pH值>7的碱可以选自氨水、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、三乙胺、三丁胺或三乙醇胺；③步骤中，所述的反相硅胶层析柱选自反相硅胶为C₁₈、C₈、C₄的一种或一种以上的任意混合物。所述的梯度流动相选自体积比100:0变化到0:100的水:乙醇、水:丙酮、水:甲醇或水:乙腈；所述的水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇、丙酮的一种溶剂或一种以上的溶剂组成的任意混合溶剂；所述的HPLC条件为150mm*4.6mm的5μm的C18色谱柱，流动相为甲醇-0.1%甲酸或乙酸或磷酸或三氟乙酸水溶液在0～20分钟中甲醇由20%变化到95%，流速为1.0ml/min，保留时间在8.9min为鸡骨草乙素，保留时间在10.1min处为鸡骨草甲素。

6.根据权利要求3或4所示的一种化合物的制法，其特征在于，其中得到的鸡骨草甲素和鸡骨草乙素再经精制过程，再经精制过程为将鸡骨草乙素和鸡骨草甲素分别上反相硅胶层析柱，以梯度流动相进行梯度层析分离，收集各分离液，合并保留时间一致的成分的分离液，分别减压回收至干，用水溶性溶剂溶解，结晶；或者将鸡骨草甲素和鸡骨草乙素以水溶性溶剂进行溶解处理，重结晶，即得到纯度更高的鸡骨草甲素和鸡骨草乙素；其中所述水溶性溶剂选自水、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈的一种溶剂或一种以上溶剂任意组成混合溶剂。

7.根据权利要求1或2所示的一种化合物，其特征在于，所述的化合物用于单独或联合或与其他中药或中药提取物或中药有效部位或化学合成药物与药学上可接受的载体，以及赋性剂或辅料共同制备药物组合物、食品添加剂或者保健食品。

8.根据权利要求1或2所示的一种化合物，其特征在于，在保肝护肝和抗炎镇痛的预防和治疗中的应用及在治疗和预防急慢性肝炎、胆囊炎、胃炎及疼痛及其相关疾病中的应用。

9.根据权利要求1或2所示的一种化合物，其特征在于，用于预防和治疗病毒性肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎、酒精性肝损伤、脂肪肝、胆囊炎、胃溃疡、支气管炎、鼻炎、关节炎、头痛、胃痛或癌痛。