CN109803977B - 核酸产品及其施用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明部分地涉及核酸，包括编码蛋白质的核酸；包含核酸的治疗剂和化妆品；用于递送核酸到细胞、组织、器官和患者的方法；使用核酸诱导细胞表达蛋白质的方法；用于转染、基因编辑和重新编程细胞的方法、试剂盒和装置；以及使用这些方法、试剂盒和装置生成的细胞、生物体、治疗剂和化妆品。
Description
优先权
本申请要求2016年8月17日提交的美国临时专利申请号 62/376,209和2017年5月22日提交的美国临时专利申请号62/509,350 的优先权。上述专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
发明领域
本发明部分地涉及用于产生核酸并将所述核酸递送到细胞、组织、器官和患者的方法、组合物和产品；用于在细胞、组织、器官和患者中表达蛋白质的方法；以及使用这些方法、组合物和产品产生的细胞、治疗剂和化妆品。
电子提交的文本文件的描述
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式经由EFS-Web 提交并且由此以引用的方式整体并入本文。2017年8月17日创建的所述ASCII拷贝被命名为FAB-010PC_ST25，并且大小为2.32MB。
背景技术
合成RNA和核酸治疗剂
核糖核酸(RNA)在原核细胞和真核细胞中普遍存在，其中其以信使RNA的形式编码遗传信息，以转运RNA的形式结合并转运氨基酸，以核糖体RNA的形式将氨基酸组装成蛋白质，并以微小RNA 和长非编码RNA的形式执行包括基因表达调控的许多其他功能。 RNA可以通过包括直接化学合成和体外转录的方法通过合成方式制造，并且可以施用到患者用于治疗用途。然而，先前描述的合成RNA 分子是不稳定的并且在人细胞中触发有效的先天免疫应答。此外，先前未描述用于在体内将核酸高效非病毒递送到患者、器官、组织和细胞的方法。现有合成RNA技术和用于递送核酸的方法的许多缺点使得它们不合治疗或美容用途的需要。
细胞重新编程和基于细胞的疗法
可以通过将细胞暴露于特定的细胞外诱因和/或通过特异性蛋白质、微小RNA等的异位表达来重新编程细胞。虽然先前已经描述了若干重新编程方法，但是大多数依赖于异位表达的方法需要引入外源 DNA，其可能带有突变风险。已经报道基于直接递送重新编程蛋白的无DNA的重新编程方法。然而，这些方法对于商业用途而言效率太低且不可靠。此外，已经描述基于RNA的重新编程方法(参见，例如 Angel.MIT Thesis.2008.1-56；Angel等人，PLoS ONE.2010.5,107； Warren等人，Cell Stem Cell.2010.7,618-630；Angel.MITThesis.2011. 1-89；以及Lee等人，Cell.2012.151,547-558；所有这些的内容都以引用的方式并入本文)。然而，现有的基于RNA的重新编程方法在对成年细胞执行时是缓慢的，不可靠的且低效的，需要多次转染(产生显著的开支和出错的机会)，可以仅重新编程有限数量的细胞类型，可以仅将细胞重新编程为有限数量的细胞类型，需要使用免疫抑制剂，并且需要使用包括血液源性HSA和人成纤维细胞供给者的多种人源组分。先前公开的基于RNA的重新编程方法的许多缺点使得它们不合研究、治疗或美容用途的需要。
基因编辑
若干天然存在的蛋白质含有可以识别特异性DNA序列的DNA 结合结构域，例如锌指(ZF)和转录激活因子样效应物(TALE)。含有这些DNA结合结构域中的一个或多个和FokI内切核酸酶的裂解结构域的融合蛋白可以用于在细胞中DNA的所需区域中产生双链断裂(参见，例如，美国专利申请公开号US 2012/0064620、美国专利申请公开号US 2011/0239315、美国专利号8,470,973、美国专利申请公开号 US 2013/0217119、美国专利号8,420,782、美国专利申请公开号US 2011/0301073、美国专利申请公开号US 2011/0145940、美国专利号 8,450,471、美国专利号8,440,431、美国专利号8,440,432和美国专利申请公开号2013/0122581，所有这些的内容都以引用的方式并入本文)。其他基因编辑蛋白包括聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR) 相关蛋白。然而，目前用于基因编辑细胞的方法是低效的并且带有不受控制地诱变的风险，使得它们不合研究、治疗或美容用途的需要。先前尚未探索用于无DNA基因编辑体细胞的方法或用于同时或依次基因编辑和重新编程体细胞的方法。此外，先前尚未探索用于直接基因编辑患者细胞(即，体内)的方法，并且这类方法的开发受限于可接受的靶标的缺乏，递送低效，一种或多种基因编辑蛋白的低效表达，一种或多种表达的基因编辑蛋白的低效基因编辑，这部分地归因于 DNA结合结构域的结合不良，过度的脱靶效应，部分地归因于FokI 裂解结构域的非定向二聚化和DNA结合结构域的特异性差，以及其他因素。最后，先前尚未探索基因编辑在抗细菌、抗病毒和抗癌治疗中的用途。
因此，仍然需要用于产生核酸并将其递送到细胞、组织、器官和患者的改进的方法和组合物。
发明内容
本发明部分地提供用于将核酸递送到细胞、组织、器官和患者的组合物、方法、制品和装置；用于诱导细胞表达蛋白质的方法；用于产生这些组合物、方法、制品和装置的方法、制品和装置；以及使用这些组合物、方法、制品和装置产生的组合物和制品(包括细胞、生物体、化妆品和治疗剂)。与先前报道的方法不同，本发明的某些实施方案提供小剂量的核酸以在人中实现显著且持久的蛋白质表达。
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗代谢病症的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的编码生长分化因子15 (GDF15)或内皮细胞特异性分子1(ESM1)的合成RNA的步骤，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，所述代谢病症选自I型糖尿病、II型糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖症、血脂异常、高胆固醇血症、高血糖症、高胰岛素血症、高血压、肝细胞病(hepatosteaotosis)如非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)和非酒精性脂肪酸肝病(NAFLD)、癌症、与脂质代谢受损相关的疾病或病症、与肾功能受损相关的疾病或病症、与肝功能受损相关的疾病或病症、与肺功能受损相关的疾病或病症、血管或心血管疾病或病症、肌肉萎缩、炎症和呼吸道疾病。
在各个实施方案中，与肾功能受损相关的疾病或病症选自慢性肾病、急性肾损伤、肾病、糖尿病性肾病、肾衰竭和肾纤维化。
在各个实施方案中，血管或心血管疾病或病症选自冠状动脉疾病、心肌病、高血压、心房颤动、先兆子痫、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、心力衰竭、急性心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、肌肉萎缩、高血压性心室肥大、高血压性心肌病、缺血性心脏病、心肌梗塞、腹主动脉瘤、血块、深静脉血栓形成、静脉淤血症、静脉炎和静脉曲张。
在各个实施方案中，与未治疗的受试者相比，治疗引起受试者中天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)或葡萄糖水平中的一种或多种的降低。
在各个实施方案中，与未治疗的受试者相比，治疗引起受试者中的脂质动员增加。
在各个实施方案中，施用是皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、门静脉内、直肠内、吸入或局部施用。
在一些方面，本发明涉及一种用于调节GDF15的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的编码GDF15的合成RNA的步骤，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，与未治疗的受试者相比，调节引起受试者中 ALT、AST或葡萄糖水平中的一种或多种的降低。
在各个实施方案中，与未治疗的受试者相比，调节引起受试者中的脂质动员增加。
在各个实施方案中，施用是皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、门静脉内、直肠内、吸入或局部施用。
在各个实施方案中，调节引起受试者中GDF15的量增加。
在各个实施方案中，调节引起受试者中GDF15的量减少。
在一些方面，本发明涉及一种用于调节ESM1的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的编码ESM1的合成RNA的步骤，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，与未治疗的受试者相比，调节引起受试者中 ALT、AST或葡萄糖水平中的一种或多种的降低。
在各个实施方案中，与未治疗的受试者相比，调节引起受试者中的脂质动员增加。
在各个实施方案中，施用是皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、门静脉内、直肠内、吸入或局部施用。
在各个实施方案中，调节引起受试者中ESM1的量增加。
在各个实施方案中，调节引起受试者中ESM1的量减少。
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗肝脏病症的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的编码生长分化因子15 (GDF15)或内皮细胞特异性分子1(ESM1)的合成RNA的步骤，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸；并且所述治疗降低受试者中脂肪肝、NAFLD、NASH、炎症、肝炎、纤维化、肝硬化和肝细胞癌中的一种或多种。
在各个实施方案中，与未治疗的受试者相比，治疗引起受试者中 AST、ALT或葡萄糖水平中的一种或多种的降低。
在各个实施方案中，与未治疗的受试者相比，治疗引起受试者中的脂质动员增加。
在各个实施方案中，施用针对肝脏。
在各个实施方案中，施用是门静脉内注射。
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗弗里德里希氏共济失调 (Friedrich’sAtaxia)的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的(a)编码能够在FXNA(SEQID NO:582)中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成RNA和/或(b)编码能够在FXNB(SEQ IDNO:583) 中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成RNA的步骤，其中所述合成 RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。在各个实施方案中，所述治疗包括向有需要的受试者施用有效量的(a)编码能够在FXNA(SEQ ID NO:582)中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成 RNA和(b)编码能够在FXNB(SEQ ID NO:583)中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成RNA。
在各个实施方案中，施用针对心脏。
在各个实施方案中，施用是经由导管进行。
在各个实施方案中，治疗减轻以下中的一种或多种：肌肉无力、失去协调、视力障碍、听力障碍、言语不清、脊柱侧凸、足部畸形(pes cavus deformity of foot)、糖尿病和选自一种或多种心房颤动、心动过速和肥厚性心肌病的心脏病症。
在各个实施方案中，基因编辑蛋白选自CRISPR/Cas9、TALEN 和锌指核酸酶。
在各个实施方案中，基因编辑蛋白包含：(a)DNA结合结构域和 (b)核酸酶结构域。DNA结合结构域包含多个重复序列，并且这些重复序列中的至少一个包含氨基酸序列：LTPvQVVAIAwxyzGHGG (SEQ ID NO:629)并且长度在36个氨基酸和39个氨基酸之间，其中：“v”为Q、D或E；“w”为S或N；“x”为H、N或I；“y”为D、A、I、 N、G、H、K、S或空；并且“z”为GGKQALETVQRLLPVLCQD(SEQ ID NO:630)或GGKQALETVQRLLPVLCQA(SEQ ID NO:631)。核酸酶结构域包含核酸酶的催化结构域。
在各个实施方案中，核酸酶结构域能够与另一个核酸酶结构域形成二聚体。
在各个实施方案中，核酸酶结构域包含蛋白质的催化结构域，所述催化结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:632。
在一些方面，本发明涉及一种用于减少炎症的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的编码过氧化物歧化酶3(SOD3)或 IFKB的合成RNA的步骤，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，炎症与肺部疾病或病症相关。
在各个实施方案中，肺部疾病或病症选自石棉沉滞症、哮喘、支气管扩张、支气管炎、慢性咳嗽、慢性阻塞性肺病(COPD)、普通感冒、哮吼、囊性纤维化、汉坦病毒、特发性肺纤维化、流感、肺癌、大流行性流感、百日咳、胸膜炎、肺炎、肺栓塞、肺高血压、呼吸道合胞病毒(RSV)、结节病、睡眠呼吸暂停、肺活量测定、婴儿猝死综合征(SIDS)和肺结核。
在各个实施方案中，炎症与肺部感染相关。
在各个实施方案中，肺部感染由细菌、真菌、原生动物、多细胞生物、微粒或病毒引起。
在各个实施方案中，合成RNA通过吸入施用。
在各个实施方案中，炎症与败血症相关。
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗α-1抗胰蛋白酶(A1AT) 缺乏症的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的(a)编码能够在A1AT_A(SEQ ID NO:584)中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成RNA和/或(b)编码能够在A1AT_B(SEQ ID NO:585)中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成RNA的步骤，其中所述合成RNA 包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。在各个实施方案中，治疗包括向有需要的受试者施用有效量的(a)编码能够在 A1AT_A(SEQ ID NO:584)中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成 RNA和(b)编码能够在A1AT_B(SEQ ID NO:585)中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成RNA。
在各个实施方案中，施用针对肝脏。
在各个实施方案中，施用是门静脉内注射。
在各个实施方案中，治疗校正受试者的肝细胞中的Z突变。
在各个实施方案中，治疗降低受试者的肝细胞中聚合的Z蛋白积聚。
在各个实施方案中，治疗增加功能性A1AT的分泌和/或血清水平。
在各个实施方案中，治疗减轻慢性咳嗽、肺气肿、COPD、肝衰竭、肝炎、肝肿大、黄疸和肝硬化中的一种或多种。
在各个实施方案中，基因编辑蛋白选自CRISPR/Cas9、TALEN 和锌指核酸酶。
在各个实施方案中，基因编辑蛋白包含：(a)DNA结合结构域和 (b)核酸酶结构域。DNA结合结构域包含多个重复序列，并且这些重复序列中的至少一个包含氨基酸序列：LTPvQVVAIAwxyzGHGG (SEQ ID NO:629)并且长度在36个氨基酸和39个氨基酸之间，其中：“v”为Q、D或E；“w”为S或N；“x”为H、N或I；“y”为D、A、I、 N、G、H、K、S或空；并且“z”为GGKQALETVQRLLPVLCQD(SEQ ID NO:630)或GGKQALETVQRLLPVLCQA(SEQ ID NO:631)。核酸酶结构域包含核酸酶的催化结构域。
在各个实施方案中，所述核酸酶结构域能够与另一个核酸酶结构域形成二聚体。
在各个实施方案中，核酸酶结构域包含蛋白质的催化结构域，所述催化结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:632。
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗α-1抗胰蛋白酶(A1AT) 缺乏症的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的编码A1AT的合成RNA的步骤，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，施用针对肝脏。
在各个实施方案中，施用是门静脉内注射。
在各个实施方案中，治疗校正受试者的肝细胞中的Z突变。
在各个实施方案中，治疗降低受试者的肝细胞中聚合的Z蛋白积聚。
在各个实施方案中，治疗增加功能性A1AT的分泌和/或血清水平。
在各个实施方案中，治疗减轻受试者症状中的一种或多种。
在一些方面，本发明涉及一种用于逆转细胞中α-1抗胰蛋白酶 (A1AT)缺乏的方法。所述方法包括以下步骤：(a)获得包含缺陷A1AT 基因的细胞和(b)使所述细胞与编码A1AT的合成RNA接触，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)获得步骤(b) 中接触的细胞；以及(d)向有需要的受试者施用所述细胞。
在各个实施方案中，施用针对肝脏。
在各个实施方案中，施用是门静脉内注射。
在一些方面，本发明涉及一种用于逆转细胞中α-1抗胰蛋白酶 (A1AT)缺乏的方法。所述方法包括以下步骤：(a)获得包含缺陷A1AT 基因的细胞和(b)使所述细胞与编码能够在A1AT_A(SEQ ID NO: 584)中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成RNA和编码能够在A1AT_B(SEQ ID NO:585)中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成 RNA中的一种或两种接触，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)获得步骤(b) 中接触的细胞；以及(d)向有需要的受试者施用所述细胞。
在各个实施方案中，施用针对肝脏。
在各个实施方案中，施用是门静脉内注射。
在各个实施方案中，基因编辑蛋白选自CRISPR/Cas9、TALEN 和锌指核酸酶。
在各个实施方案中，基因编辑蛋白包含：(a)DNA结合结构域和(b)核酸酶结构域。DNA结合结构域包含多个重复序列，并且这些重复序列中的至少一个包含氨基酸序列：LTPvQVVAIAwxyzGHGG (SEQ ID NO:629)并且长度在36个氨基酸和39个氨基酸之间，其中：“v”为Q、D或E；“w”为S或N；“x”为H、N或I；“y”为D、A、I、 N、G、H、K、S或空；并且“z”为GGKQALETVQRLLPVLCQD(SEQ ID NO:630)或GGKQALETVQRLLPVLCQA(SEQ ID NO:631)。核酸酶结构域包含核酸酶的催化结构域。
在各个实施方案中，所述核酸酶结构域能够与另一个核酸酶结构域形成二聚体。
在各个实施方案中，核酸酶结构域包含蛋白质的催化结构域，所述催化结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:632。
在一些方面，本发明涉及一种用于调节BMP7的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的编码BMP7的合成RNA的步骤，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，调节引起受试者中BMP7的量增加。
在各个实施方案中，调节引起受试者中BMP7的量减少。
在各个实施方案中，调节引起细胞内碱性磷酸酶活性增加。
在各个实施方案中，编码BMP7的合成RNA包含编码BMP7信号肽的序列。
在各个实施方案中，BMP7信号肽包含序列SEQ ID NO:597。
在各个实施方案中，施用针对肝脏。
在各个实施方案中，施用是门静脉内注射。
在各个实施方案中，施用治疗糖尿病性肾病。
在各个实施方案中，施用治疗肝纤维化。
在各个实施方案中，施用针对肾脏。
在各个实施方案中，施用是通过静脉内或皮内进行。
在各个实施方案中，施用治疗肾病。
在各个实施方案中，肾病为糖尿病性肾病。
在各个实施方案中，调节引起受试者中尿白蛋白的水平降低。
在一些方面，本发明涉及一种用于调节免疫检查点分子的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的编码免疫检查点分子的合成 RNA的步骤，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗受试者的方法，其包括施用编码靶向免疫检查点分子基因的基因编辑蛋白的合成RNA的步骤。
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗受试者的方法，其包括以下步骤：(a)获得包含免疫检查点分子基因的细胞和(b)使所述细胞与编码能够在所述免疫检查点分子基因中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成RNA接触，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)获得步骤(b) 中接触的细胞；以及(d)向有需要的受试者施用所述细胞。
在各个实施方案中，基因编辑蛋白选自CRISPR/Cas9、TALEN 和锌指核酸酶。
在各个实施方案中，基因编辑蛋白包含：(a)DNA结合结构域和 (b)核酸酶结构域。DNA结合结构域包含多个重复序列，并且这些重复序列中的至少一个包含氨基酸序列：LTPvQVVAIAwxyzGHGG (SEQ ID NO:629)并且长度在36个氨基酸和39个氨基酸之间，其中：
“v”为Q、D或E；“w”为S或N；“x”为H、N或I；“y”为D、A、 I、N、G、H、K、S或空；并且“z”为GGKQALETVQRLLPVLCQD(SEQ ID NO:630)或GGKQALETVQRLLPVLCQA(SEQ ID NO:631)。核酸酶结构域包含核酸酶的催化结构域。
在各个实施方案中，核酸酶结构域能够与另一个核酸酶结构域形成二聚体。
在各个实施方案中，核酸酶结构域包含蛋白质的催化结构域，所述催化结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:632。
在各个实施方案中，免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、 CTLA-4、ICOS、LAG3、OX40、OX40L和TIM3。
在各个实施方案中，免疫检查点分子是PD-1。
在各个实施方案中，施用刺激或增强受试者中的免疫应答。
在各个实施方案中，施用抑制或降低受试者中的免疫应答。
在各个实施方案中，受试者患有癌症。
在各个实施方案中，受试者患有自体免疫疾病。
在各个实施方案中，施用是皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、门静脉内、直肠内、吸入或局部施用。
在各个实施方案中，调节引起受试者中PD-1的量增加。
在各个实施方案中，调节引起受试者中PD-1的量减少。
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗癌症的方法，其包括以下步骤：(a)从受试者中分离细胞，所述细胞是免疫细胞或造血细胞； (b)使分离的细胞与有效量的编码嵌合抗原受体(CAR)的合成RNA 接触，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸；以及(c)向所述受试者施用所述细胞。
在各个实施方案中，免疫细胞是T细胞。
在一些方面，本发明涉及一种用于制备嵌合抗原受体(CAR)T细胞的方法，其包括以下步骤：(a)从受试者中获得细胞和(b)使所述细胞与编码能够产生双链断裂以产生用于CAR插入的安全港基因座 (safe harbor locus)的基因编辑蛋白的合成RNA接触，其中所述合成 RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，其中所述基因编辑蛋白选自CRISPR/Cas9、 TALEN和锌指核酸酶。
在各个实施方案中，基因编辑蛋白包含：(a)DNA结合结构域和 (b)核酸酶结构域。DNA结合结构域包含多个重复序列，并且这些重复序列中的至少一个包含氨基酸序列：LTPvQVVAIAwxyzGHGG (SEQ ID NO:629)并且长度在36个氨基酸和39个氨基酸之间，其中：“v”为Q、D或E；“w”为S或N；“x”为H、N或I；“y”为D、A、I、 N、G、H、K、S或空；并且“z”为GGKQALETVQRLLPVLCQD(SEQ ID NO:630)或GGKQALETVQRLLPVLCQA(SEQ ID NO:631)。核酸酶结构域包含核酸酶的催化结构域。
在各个实施方案中，核酸酶结构域能够与另一个核酸酶结构域形成二聚体。
在各个实施方案中，核酸酶结构域包含蛋白质的催化结构域，所述催化结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:632。
在一些方面，本发明涉及一种用于增加嵌合抗原受体(CAR)T细胞的持久性的方法，其包括使所述嵌合抗原受体(CAR)T细胞与编码端粒酶的合成RNA接触的步骤，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗皮肤伤口的方法，其包括向受试者施用有效量的编码白细胞介素22(IL22)的合成RNA的步骤，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，施用针对表皮系统的细胞群。
在各个实施方案中，细胞群包含表皮细胞、基底膜细胞、真皮细胞和/或皮下组织细胞中的一种或多种。
在各个实施方案中，细胞群是表皮细胞，并且包含角质层、透明质层、颗粒层、棘层和/或生发层的细胞中的一种或多种。
在各个实施方案中，细胞群是真皮细胞，并且包含来自乳头状区和网状区的细胞中的一种或多种。
在各个实施方案中，施用是通过皮下注射、皮内注射、真皮下注射、肌肉内注射或局部施用进行。
在各个实施方案中，施用是皮内注射到真皮或表皮中的一种或多种。
在各个实施方案中，有效量为每约10cm2或更小、或约5cm2或更小、或约1cm2或更小、或约0.5cm2或更小、或约0.2cm2或更小的治疗面积约10ng至约5000ng。
在各个实施方案中，每约10cm2或更小、或约5cm2或更小、或约1cm2或更小、或约0.5cm2或更小、或约0.2cm2或更小的治疗面积施用约10ng、或约20ng、或约50ng、或约100ng、或约200ng、或约300ng、或约400ng、或约500ng、或约600ng、或约700ng、或约800ng、或约900ng、或约1000ng、或约1100ng、或约1200ng、或约1300ng、或约1400ng、或约1500ng、或约1600ng、或约1700 ng、或约1800ng、或约1900ng、或约2000ng、或约3000ng、或约 4000ng、或约5000ng的合成RNA。
在各个实施方案中，调节引起受试者中IL22的量增加。
在各个实施方案中，调节引起受试者中IL22的量减少。
在各个实施方案中，有效量的合成RNA使用覆盖受试者的受影响区域的针阵列施用。
在各个实施方案中，在施用后机械按摩治疗区域。
在各个实施方案中，在施用后使治疗区域暴露于电脉冲。
在各个实施方案中，电脉冲在约10V和约200V之间持续约50 微秒至约1秒。
在各个实施方案中，电脉冲由多电极阵列在治疗区域周围产生。
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗代谢病症的方法，其包括施用编码靶向缺陷基因的基因编辑蛋白的合成RNA的步骤，其中所述施用通过门静脉内注射进行。
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗代谢病症的方法，其包括以下步骤：(a)获得包含缺陷基因的细胞和(b)使所述细胞与编码能够在所述缺陷基因中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成RNA接触，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。在各个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(c)获得步骤(b)中接触的细胞；以及(d)通过门静脉内注射向有需要的受试者施用所述细胞。
在各个实施方案中，基因编辑蛋白选自CRISPR/Cas9、TALEN 和锌指核酸酶。
在各个实施方案中，基因编辑蛋白包含：(a)DNA结合结构域和 (b)核酸酶结构域。DNA结合结构域包含多个重复序列，并且这些重复序列中的至少一个包含氨基酸序列：LTPvQVVAIAwxyzGHGG (SEQ ID NO:629)并且长度在36个氨基酸和39个氨基酸之间，其中：“v”为Q、D或E；“w”为S或N；“x”为H、N或I；“y”为D、A、I、 N、G、H、K、S或空；并且“z”为GGKQALETVQRLLPVLCQD(SEQ ID NO:630)或GGKQALETVQRLLPVLCQA(SEQ ID NO:631)。核酸酶结构域包含核酸酶的催化结构域。
在各个实施方案中，核酸酶结构域能够与另一个核酸酶结构域形成二聚体。
在各个实施方案中，核酸酶结构域包含蛋白质的催化结构域，所述催化结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:632。
在各个实施方案中，代谢病症选自碳水化合物代谢病症、氨基酸代谢病症、尿素循环病症、脂肪酸代谢病症、卟啉代谢病症、溶酶体贮积症、过氧化物酶体生物发生病症以及嘌呤或嘧啶代谢病症。
在各个实施方案中，代谢病症为碳水化合物代谢病症，并且其中疾病为半乳糖血症并且缺陷基因任选为GALT、GALK1或GALE；其中疾病为特发性果糖尿症并且缺陷基因任选为KHK；其中疾病为遗传性果糖不耐症并且缺陷基因任选为ALDOB；其中疾病为I型糖原贮积病并且缺陷基因任选为G6PC、SLC37A4或SLC17A3；其中疾病为II型糖原贮积病并且缺陷基因任选为GAA；其中疾病为III 型糖原贮积病并且缺陷基因任选为AGL；其中疾病为IV型糖原贮积病并且缺陷基因任选为GBE1；其中疾病为V型糖原贮积病并且缺陷基因任选为PYGM；其中疾病为VI型糖原贮积病并且缺陷基因任选为PYGL；其中疾病为VII型糖原贮积病并且缺陷基因任选为PYGM；其中疾病为IX型糖原贮积病并且缺陷基因任选为PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG1或PHKG2；其中疾病为XI型糖原贮积病并且缺陷基因任选为SLC2A2；其中疾病为XII型糖原贮积病并且缺陷基因任选为ALDOA；其中疾病为XIII型糖原贮积病并且缺陷基因任选为EN 01、EN02或EN03；其中疾病为0型糖原贮积病并且缺陷基因任选为 GYS1或GYS2；其中疾病为丙酮酸羧化酶缺乏症并且缺陷基因任选为PC；其中疾病为丙酮酸激酶缺乏症并且缺陷基因任选为PKLR；其中疾病为转醛醇酶缺乏症并且缺陷基因任选为TALD01；其中疾病为磷酸丙糖异构酶缺乏症并且缺陷基因任选为TPI1；其中疾病为果糖二磷酸酶缺乏症并且缺陷基因任选为FBP1；其中疾病为高草酸尿症并且缺陷基因任选为AGXT或GRHPR；其中疾病为己糖激酶缺乏症并且缺陷基因任选为HK1；其中疾病为葡萄糖-半乳糖吸收不良并且缺陷基因任选为SLC5A1；或者其中疾病为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症并且缺陷基因任选为G6PD。
在各个实施方案中，代谢病症为氨基酸代谢病症，其中疾病为尿黑酸尿症并且缺陷基因任选为HGD；其中疾病为天冬氨酰基葡萄糖胺尿症并且缺陷基因任选为AGA；其中疾病为甲基丙二酸血症并且缺陷基因任选为MUT、MCEE、MMAA、MMAB、MMACHC、 MMADHC或LMBRD1；其中疾病为枫糖尿病并且缺陷基因任选为 BCKDHA、BCKDHB、DBT或DLD；其中疾病为高胱氨酸尿症并且缺陷基因任选为CBS；其中疾病为酪氨酸血症并且缺陷基因任选为 FAH、TAT或HPD；其中疾病为三甲基胺尿症并且缺陷基因任选为 FM03；其中疾病为哈特纳普病(Hartnup disease)并且缺陷基因任选为 SLC6A19；其中疾病为生物素酶缺乏症并且缺陷基因任选为BTD；其中疾病为鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症并且缺陷基因任选为OTC；其中疾病为氨甲酰基磷酸合酶I缺乏症并且缺陷基因任选为CPS1；其中疾病为瓜氨酸血症并且缺陷基因任选为ASS或SLC25A13；其中疾病为高精氨酸血症并且缺陷基因任选为ARG1；其中疾病为高同型半胱氨酸血症并且缺陷基因任选为MTHFR；其中疾病为高甲硫氨酸血症并且缺陷基因任选为MAT1A、GNMT或AHCY；其中疾病为高赖氨酸血症并且缺陷基因任选为AASS；其中疾病为非酮性高甘氨酸血症并且缺陷基因任选为GLDC、AMT或GCSH；其中疾病为丙酸血症并且缺陷基因任选为PCCA或PCCB；其中疾病为高脯氨酸血症并且缺陷基因任选为ALDH4A1或PRODH；其中疾病为胱氨酸尿症并且缺陷基因任选为SLC3A1或SLC7A9；其中疾病为二羧酸氨基酸尿症并且缺陷基因任选为SLC1A1；其中疾病为2型戊二酸血症并且缺陷基因任选为ETFA、ETFB或ETFDH；其中疾病为异戊酸血症并且缺陷基因任选为IVD；或者其中疾病为2-羟基戊二酸尿症并且缺陷基因任选为L2HGDH或D2HGDH。
在各个实施方案中，代谢病症为尿素循环的病症，其中疾病为 N-乙酰谷氨酸合酶缺乏症并且缺陷基因任选为NAGS；其中疾病为精氨基琥珀酸尿症并且缺陷基因任选为ASL；或者其中疾病为精氨酸血症并且缺陷基因任选为ARG1。
在各个实施方案中，代谢病症为脂肪酸代谢病症，其中疾病为链非常长的酰基-辅酶A脱氢酶缺乏症并且缺陷基因任选为ACADVL；其中疾病为长链3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶缺乏症并且缺陷基因任选为HADHA；其中疾病为中链酰基-辅酶A脱氢酶缺乏症并且缺陷基因任选为ACADM；其中疾病为短链酰基-辅酶A脱氢酶缺乏症并且缺陷基因任选为ACADS；其中疾病为3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶缺乏症并且缺陷基因任选为HADH；其中疾病为2,4二烯酰基-辅酶A 还原酶缺乏症并且缺陷基因任选为NADK2；其中疾病为3-羟基-3- 甲基戊二酰基-辅酶A裂解酶缺乏症并且缺陷基因任选为HMGCL；其中疾病为丙二酰基-辅酶A脱羧酶缺乏症并且缺陷基因任选为 MLYCD；其中疾病为全身性原发性肉毒碱缺乏症并且缺陷基因任选为SLC22A5；其中疾病为肉毒碱-酰基肉毒碱转位酶缺乏症并且缺陷基因任选为SLC25A20；其中疾病为肉毒碱棕榈酰基转移酶I缺乏症并且缺陷基因任选为CPT1A；其中疾病为肉毒碱棕榈酰基转移酶II 缺乏症并且缺陷基因任选为CPT2；其中疾病为溶酶体酸脂肪酶缺乏症并且缺陷基因任选为LIPA；或者其中疾病为戈谢病(Gaucher's disease)并且缺陷基因任选为GBA。
在各个实施方案中，代谢病症为卟啉代谢病症，其中疾病为急性间歇性卟啉病并且缺陷基因任选为HMBS；其中疾病为冈瑟病 (Gunther disease)并且缺陷基因任选为UROS；其中疾病为迟发性皮肤卟啉病(porphyria cutanea tarda)并且缺陷基因任选为UROD；其中疾病为肝红细胞生成性卟啉病并且缺陷基因任选为UROD；其中疾病为遗传性粪卟啉病并且缺陷基因任选为CPOX；其中疾病为多样性卟啉病并且缺陷基因任选为PPOX；其中疾病为红细胞生成性原卟啉病并且缺陷基因任选为FECH；或者其中疾病为氨基乙酰丙酸脱水酶缺乏性卟啉病并且缺陷基因任选为ALAD。
在各个实施方案中，代谢病症为溶酶体贮积症，其中疾病为法伯病(Farberdisease)并且缺陷基因任选为ASAH1；其中疾病为克拉伯病 (Krabbe disease)并且缺陷基因任选为GALC；其中疾病为半乳糖唾液酸沉积症并且缺陷基因任选为CTSA；其中疾病为法布瑞病(fabry disease)并且缺陷基因任选为GLA；其中疾病为辛德勒病(Schindlerdisease)并且缺陷基因任选为NAGA；其中疾病为GM1神经节苷脂贮积症并且缺陷基因任选为GLB1；其中疾病为泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)并且缺陷基因任选为HEXA；其中疾病为桑德霍夫病(Sandhoff disease)并且缺陷基因任选为HEXB；其中疾病为GM2神经节苷脂贮积症AB变体并且缺陷基因任选为GM2A；其中疾病为尼曼-匹克病 (Niemann-Pickdisease)并且缺陷基因任选为SMPD1、NPC1或NPC2；其中疾病为异染性脑白质营养不良并且缺陷基因任选为ARSA或 PSAP；其中疾病为多种硫酸酯酶缺乏症并且缺陷基因任选为SUMF1；其中疾病为贺勒氏综合征(Hurler syndrome)并且缺陷基因任选为IDUA；其中疾病为亨特综合征(Hunter syndrome)并且缺陷基因任选为IDS；其中疾病为沙费利波综合征(Sanfilippo syndrome)并且缺陷基因任选为SGSH、NAGLU、HGSNAT或GNS；其中疾病为莫奎欧氏综合征(Morquio syndrome)并且缺陷基因任选为GALNS或 GLB1；其中疾病为马洛托-拉米氏综合征(Maroteaux-Lamy syndrome) 并且缺陷基因任选为ARSB；其中疾病为Sly综合征并且缺陷基因任选为GUSB；其中疾病为唾液酸贮积症并且缺陷基因任选为NEU1、NEU2、NEU3或NEU4；其中疾病为I细胞疾病并且缺陷基因任选为 GNPTAB或GNPTG；其中疾病为IV型粘脂贮积症并且缺陷基因任选为MCOLN1；其中疾病为婴儿神经元蜡样脂褐质贮积症并且缺陷基因任选为PPT1或PPT2；其中疾病为詹比二氏病 (Jansky-Bielschowskydisease)并且缺陷基因任选为TPP1；其中疾病为巴特病(Batten disease)并且缺陷基因任选为CLN1、CLN2、CLN3、 CLN5、CLN6、MFSD8、CLN8或CTSD；其中疾病为A型库夫斯病 (Kufsdisease)并且缺陷基因任选为CLN6或PPT1；其中疾病为B型库夫斯病并且缺陷基因任选为DNAJC5或CTSF；其中疾病为α-甘露糖苷贮积症并且缺陷基因任选为MAN2B1、MAN2B2或MAN2C1；其中疾病为β-甘露糖苷贮积症并且缺陷基因任选为MANBA；其中疾病为岩藻糖苷贮积症并且缺陷基因任选为FUCA1；其中疾病为胱氨酸病并且缺陷基因任选为CTNS；其中疾病为致密性成骨不全症并且缺陷基因任选为CTSK；其中疾病为萨拉病(Salla disease)并且缺陷基因任选为SLC17A5；其中疾病为婴儿游离唾液酸贮积病并且缺陷基因任选为SLC17A5；或者其中疾病为达农病(Danon disease)并且缺陷基因任选是LAMP2。
在各个实施方案中，代谢病症是过氧化物酶体生物发生病症，其中疾病为泽尔韦格综合征(Zellweger syndrome)并且缺陷基因任选是 PEX1、PEX2、PEX3、PEX5、PEX6、PEX12、PEX14或PEX26；其中疾病为婴儿雷夫叙姆病(Infantile Refsum disease)并且缺陷基因任选为PEX1、PEX2或PEX26；其中疾病为新生儿肾上腺脑白质营养不良并且缺陷基因任选为PEX5、PEX1、PEX10、PEX13或PEX26；其中疾病为1型RCDP并且缺陷基因任选为PEX7；其中疾病为哌可酸血症并且缺陷基因任选为PAHX；其中疾病为过氧化物酶缺失症并且缺陷基因任选为CAT；其中疾病为1型高草酸尿症并且缺陷基因任选为AGXT；其中疾病为酰基-辅酶A氧化酶缺乏症并且缺陷基因任选为ACOX1；其中疾病为D-双功能蛋白质缺乏症并且缺陷基因任选为HSD17B4；其中疾病为二羟基丙酮磷酸酰基转移酶缺乏症并且缺陷基因任选为GNPAT；其中疾病为X-连锁的肾上腺脑白质营养不良并且缺陷基因任选为ABCD1；其中疾病为a-甲基酰基-辅酶A消旋酶缺乏症并且缺陷基因任选为AMACR；其中疾病为2型RCDP并且缺陷基因任选为DHAPAT；其中疾病为3型RCDP并且缺陷基因任选为AGPS；其中疾病为成人雷夫叙姆病-1并且缺陷基因任选为 PHYH；或者其中疾病为mulibrey侏儒症(mulibrey nanism)并且缺陷基因任选为TRIM37。
在各个实施方案中，代谢病症是嘌呤或嘧啶代谢的病症，其中疾病为莱施-尼汉综合征(Lesch-Nyhan syndrome)并且缺陷基因任选为 HPRT；其中疾病为腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症并且缺陷基因任选为APRT；其中疾病为腺苷脱氨酶缺乏症并且缺陷基因任选为ADA；其中疾病为1型腺苷单磷酸脱氨酶缺乏症并且缺陷基因任选为 AMPD1；其中疾病为腺苷酸琥珀酸裂解酶缺乏症并且缺陷基因任选为ADSL；其中疾病为二氢嘧啶脱氢酶缺乏症并且缺陷基因任选为 DPYD；其中疾病为米勒综合征(Miller syndrome)并且缺陷基因任选为DHODH；其中疾病为乳清酸尿症并且缺陷基因任选为UMPS；其中疾病为嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症并且缺陷基因任选为PNP；或者其中疾病为黄嘌呤尿症并且缺陷基因任选为XDH、MOCS1或MOCS2、 GEPH。
在一些方面，本发明涉及一种用于调节甲状腺素运载蛋白(TTR) 的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的编码TTR的合成RNA 的步骤，其中所述合成RNA包含一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在各个实施方案中，调节引起受试者中TTR的量增加。
在各个实施方案中，调节引起受试者中TTR的量减少。
在各个实施方案中，调节引起淀粉样蛋白病、老年性系统性淀粉样变性病(SSA)、家族性淀粉样蛋白多发性神经病(FAP)和家族性淀粉样蛋白心肌病(FAC)中的一种或多种的治疗。
在各个实施方案中，非规范核苷酸对于嘧啶在选自2C、AC和 5C位置的位置处具有一处或多处取代，或者对于嘌呤在选自6C、7N 和8C位置的位置处具有一处或多处取代。
在各个实施方案中，非规范核苷酸包括任选以占非规范核苷酸的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或100％的量的以下各物中的一种或多种：5-羟基胞苷、5-甲基胞苷、 5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-甲氧基胞苷、假尿苷、 5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-甲酰基尿苷、 5-甲氧基尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-羟甲基假尿苷、5- 羧基假尿苷、5-甲酰基假尿苷和5-甲氧基假尿苷。
在各个实施方案中，至少约50％的胞苷残基是非规范核苷酸，并且其选自5-羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5- 甲酰基胞苷和5-甲氧基胞苷。
在各个实施方案中，至少约75％或至少约90％的胞苷残基是非规范核苷酸，并且非规范核苷酸选自5-羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷和5-甲氧基胞苷。
在各个实施方案中，至少约20％的尿苷、或至少约40％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约90％的尿苷残基是非规范核苷酸，并且非规范核苷酸选自假尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-甲酰基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-羟甲基假尿苷、5-羧基假尿苷、5-甲酰基假尿苷和 5-甲氧基假尿苷。
在各个实施方案中，至少约40％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约90％的尿苷残基是非规范核苷酸，并且非规范核苷酸选自假尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-甲酰基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-羟甲基假尿苷、5-羧基假尿苷、5-甲酰基假尿苷和5-甲氧基假尿苷。
在各个实施方案中，至少约10％的鸟嘌呤残基是非规范核苷酸，并且非规范核苷酸任选为7-去氮鸟苷。
在各个实施方案中，合成RNA含有不超过约50％的7-去氮鸟苷代替鸟苷残基。
在各个实施方案中，合成RNA不含非规范核苷酸代替腺苷残基。
在各个实施方案中，合成RNA包含5'帽结构。
在各个实施方案中，合成RNA 5'-UTR包含Kozak共有序列。
在各个实施方案中，合成RNA 5'-UTR包含增加体内RNA稳定性的序列，并且5'-UTR可包含α-珠蛋白或β-珠蛋白5'-UTR。
在各个实施方案中，合成RNA 3'-UTR包含增加体内RNA稳定性的序列，并且3'-UTR可以包含α-珠蛋白或β-珠蛋白3'-UTR。
在各个实施方案中，合成RNA包含3'聚(A)尾。
在各个实施方案中，合成RNA 3'聚(A)尾的长度为约20个核苷酸至约250个核苷酸。
在各个实施方案中，合成RNA的长度为约200个核苷酸至约5000个核苷酸。
在各个实施方案中，合成RNA的长度为约500个核苷酸至约 2000个核苷酸，或约500个核苷酸至约1500个核苷酸，或约500个核苷酸至约1000个核苷酸。
在各个实施方案中，合成RNA通过体外转录制备。
在各个实施方案中，有效量的合成RNA作为一次或多次含有约 10ng至约5000ngRNA的注射施用。
在各个实施方案中，有效量的合成RNA作为一次或多次各自含有不超过约10ng、或不超过约20ng、或不超过约50ng、或不超过约100ng、或不超过约200ng、或不超过约300ng、或不超过约400 ng、或不超过约500ng、或不超过约600ng、或不超过约700ng、或不超过约800ng、或不超过约900ng、或不超过约1000ng、或不超过约1100ng、或不超过约1200ng、或不超过约1300ng、或不超过约1400ng、或不超过约1500ng、或不超过约1600ng、或不超过约1700ng、或不超过约1800ng、或不超过约1900ng、或不超过约2000 ng、或不超过约3000ng、或不超过约4000ng、或不超过约5000ng 的注射施用。
在各个实施方案中，有效量的合成RNA作为一次或多次各自含有约10ng、或约20ng、或约50ng、或约100ng、或约200ng、或约300ng、或约400ng、或约500ng、或约600ng、或约700ng、或约800ng、或约900ng、或约1000ng、或约1100ng、或约1200ng、或约1300ng、或约1400ng、或约1500ng、或约1600ng、或约1700 ng、或约1800ng、或约1900ng、或约2000ng、或约3000ng、或约 4000ng、或约5000ng的注射施用。
在各个实施方案中，有效量的合成RNA包含一种或多种脂质以增强细胞对RNA的摄取。
在各个实施方案中，有效量的合成RNA包含阳离子脂质体制剂，并且脂质任选地选自表1。
在各个实施方案中，受试者为人。
在各个实施方案中，有效量的合成RNA约每周施用，持续至少 2周。
在各个实施方案中，有效量的合成RNA约每隔一周施用，持续至少1个月。
在各个实施方案中，有效量的合成RNA每月或约每隔一个月施用。
在各个实施方案中，有效量的合成RNA施用至少2个月、或至少4个月、或至少6个月、或至少9个月、或至少1年。
在一些方面，本发明涉及一种包含有效量的任何本文公开的方面或实施方案中使用的合成RNA的组合物。
在一些方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含任何本文公开的方面或实施方案的组合物和药学上可接受的赋形剂。
在一些方面，本发明涉及任何本文公开的方面或实施方案的组合物或药物组合物在治疗本文所述的疾病或病症方面的用途。
在一些方面，本发明涉及任何本文公开的方面或实施方案的组合物或药物组合物在制造用于治疗本文所述的疾病或病症的药物方面的用途。
在各个方面，本发明基于人受试者中核酸药物的安全且有效的剂量和施用参数的惊人发现。在一些方面，提供一种用于递送核酸药物的方法，其包括向有需要的人受试者施用有效剂量的核酸药物。在各个实施方案中，核酸药物包含含有一种或多种非规范核苷酸的RNA(亦称“修饰的RNA”)。在其他实施方案中，有效剂量是足以明显增加人受试者中由核酸药物编码的蛋白质的量和/或明显避免人受试者中的免疫反应的量，其中免疫反应任选地由先天免疫系统介导。
在一些方面，提供一种用于在哺乳动物受试者的细胞群中表达所关注的蛋白质的方法，其包括向所述细胞施用包含有效剂量的编码所关注的蛋白质的RNA的非病毒转染组合物，其中所述转染组合物以允许所述蛋白质在所述细胞中表达至少约6小时至约5天而没有明显细胞毒性的量施用。在一些实施方案中，RNA含有一种或多种避免明显细胞毒性的非规范核苷酸。
在一些实施方案中，有效剂量为约100ng至约5000ng(例如，约或不超过约100ng、或200ng、或300ng、或400ng、或500ng、或 600ng、或700ng、或800ng、或900ng、或1000ng、或1100ng、或1200ng、或1300ng、或1400ng、或1500ng、或1600ng、或1700 ng、或1800ng、或1900ng、或2000ng、或3000ng、或4000ng、或5000ng)。在其他实施方案中，有效剂量小于约100ng。在某些实施方案中，有效剂量为约10ng至约100ng(例如，约或不超过约10 ng、或20ng、或30ng、或40ng、或50ng、或60ng、或70ng、或 80ng、或90ng、或100ng)。
在一些实施方案中，有效剂量为约1.4ng/kg至约30ng/kg(例如，约或不超过约1.4ng/kg、或2.5ng/kg、或5ng/kg、或10ng/kg、或 15ng/kg、或20ng/kg、或25ng/kg、或30ng/kg。在其他实施方案中，有效剂量小于约1.5ng/kg。在某些实施方案中，有效剂量为约0.14ng/kg至约1.4ng/kg(例如，约或不超过约0.14ng/kg、或0.25ng/kg、或0.5ng/kg、或0.75ng/kg、或1ng/kg、或1.25ng/kg、或1.4ng/kg)。
在一些实施方案中，有效剂量为约350ng/cm2至约7000 ng/cm2(例如，约或不超过约350ng/cm2、或500ng/cm2、或750ng/cm2、或1000ng/cm2、或2000ng/cm2、或3000ng/cm2、或4000ng/cm2、或5000ng/cm2、或6000ng/cm2、或7000ng/cm2)。在其他实施方案中，有效剂量小于约350ng/cm2。在某些实施方案中，有效剂量为约 35ng/cm2至约350ng/cm2(例如，约或不超过约35ng/cm2、或50 ng/cm2、或75ng/cm2、或100ng/cm2、或150ng/cm2、或200ng/cm2、或250ng/cm2、或300ng/cm2、或350ng/cm2。
在一些实施方案中，有效剂量为约0.28皮摩尔至约5.7皮摩尔(例如，约或不超过约0.28皮摩尔、或0.5皮摩尔、或0.75皮摩尔、或1 皮摩尔、或2皮摩尔、或3皮摩尔、或4皮摩尔、或5皮摩尔、或 5.7皮摩尔)。在其他实施方案中，有效剂量小于约0.28皮摩尔。在某些实施方案中，有效剂量为约0.028皮摩尔至约0.28皮摩尔(例如，约或不超过约0.028皮摩尔、或0.05皮摩尔、或0.075皮摩尔、或0.1 皮摩尔、或0.15皮摩尔、或0.2皮摩尔、或0.25皮摩尔、或0.28皮摩尔)。
在一些实施方案中，有效剂量为约0.004皮摩尔/kg至约0.082皮摩尔/kg(例如，约或不超过约0.004皮摩尔/kg、或0.01皮摩尔/kg、或0.02皮摩尔/kg、或0.03皮摩尔/kg、或0.04皮摩尔/kg、或0.05皮摩尔/kg、或0.06皮摩尔/kg、或0.07皮摩尔/kg、或0.08皮摩尔/kg、或0.082皮摩尔/kg)。在其他实施方案中，有效剂量小于约0.004皮摩尔/kg。在某些实施方案中，有效剂量为约0.0004皮摩尔/kg至约0.004 皮摩尔/kg(例如，约或不超过约0.0004皮摩尔/kg、或0.001皮摩尔/kg、或0.002皮摩尔/kg、或0.003皮摩尔/kg、或0.004皮摩尔/kg)。
在一些实施方案中，有效剂量为约1皮摩尔/cm2至约20皮摩尔/ cm2(例如，约或不超过约1皮摩尔/cm2、或2皮摩尔/cm2、或3皮摩尔/cm2、或4皮摩尔/cm2、或5皮摩尔/cm2、或6皮摩尔/cm2、或7 皮摩尔/cm2、或8皮摩尔/cm2、或9皮摩尔/cm2、或10皮摩尔/cm2、或12皮摩尔/cm2、或14皮摩尔/cm2、或16皮摩尔/cm2、或18皮摩尔/cm2、或20皮摩尔/cm2)。在其他实施方案中，有效剂量小于约1 皮摩尔/cm2。在某些实施方案中，有效剂量为约0.1皮摩尔/cm2至约1皮摩尔/cm2(例如，约或不超过约0.1皮摩尔/cm2、或0.2皮摩尔/cm2、或0.3皮摩尔/cm2、或0.4皮摩尔/cm2、或0.5皮摩尔/cm2、或0.6皮摩尔/cm2、或0.7皮摩尔/cm2、或0.8皮摩尔/cm2、或0.9皮摩尔/cm2、或1皮摩尔/cm2)。
在各个实施方案中，核酸药物以药学上可接受的制剂施用，所述制剂包括适合于以下一种或多种的制剂：注射(例如皮下注射、皮内注射(包括真皮或表皮)、真皮下注射、肌肉内注射、眼内注射、玻璃体内注射、关节内注射、心内注射、静脉内注射、硬膜外注射、鞘内注射、门静脉内注射、肿瘤内注射)和局部施用和/或施用到外皮系统 (例如，以下一种或多种：表皮(任选选自角质层、透明层、颗粒层、棘层和生发层)、基底膜、真皮(任选地选自乳头状区域和网状区域)、皮下组织和结膜)和/或施用到眼睛(例如，以下一种或多种：角膜、巩膜、虹膜、晶状体、角膜肢体、视神经、脉络膜、睫状体、前段、前房和视网膜)。
在各个实施方案中，核酸药物与一种或多种脂质一起配制以增强细胞对核酸药物的摄取，所述脂质任选地选自表1。在其他实施方案中，核酸药物与一种或多种纳米粒子，任选的脂质或聚合物纳米粒子一起配制，以增强细胞对核酸药物的摄取，增强蛋白质表达的持续时间，或以其他方式增强核酸药物的安全性和/或功效。
在各个实施方案中，核酸药物局部施用，任选地通过皮下注射、皮内注射、表皮下注射和肌肉内注射中的一种或多种途径施用，并且将有效剂量施用到约4mm2至约1000mm2(例如，约或不超过约4 mm2、或5mm2、或10mm2、或25mm2、或50mm2、或75mm2、或100mm2、或125mm2、或150mm2、或200mm2、或500mm2、或1000mm2)的表面区域。
在各个实施方案中，核酸药物以治疗方案施用，任选地与本文所述的额外剂或辅助疗法一起施用，并且施用是约每周一次至约每24 周一次(例如，约或不超过约每周一次、或每2周一次、或每3周一次、或每4周一次、或每5周一次、或每6周一次、或每7周一次、或每8周一次、或每9周一次、或每9周一次、或每9周一次、或每 9周一次、或每10周一次、或每11周一次、或每12周一次、或每 13周一次、或每14周一次、或每15周一次周、或每20周一次、或每24周一次)。在其他实施方案中，核酸药物以治疗方案施用，任选地与本文所述的额外剂或辅助疗法一起施用，并且施用是约每天一次至约每周一次(例如，约或不超过约每天一次、或每2天一次、或每3 天一次、或每4天一次、或每5天一次、或每6天一次、或每周一次)。
在各个实施方案中，核酸药物包含含有一种或多种非规范核苷酸的RNA，任选地对于嘧啶在2C和/或4C和/或5C位置具有一处或多处取代，或对于嘌呤在6C和/或7N和/或8C位置具有一处或多处取代。在各个实施方案中，非规范核苷酸是包括例如以下各物的本文所述的非规范核苷酸中的一种或多种：5-羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-甲氧基胞苷、假尿苷、5- 羟基尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基假尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羟甲基假尿苷、5-羧基尿苷、5-羧基假尿苷、5-甲酰基尿苷、 5-甲酰基假尿苷、5-甲氧基尿苷和5-甲氧基假尿苷。另外，包含一种或多种非规范核苷酸的RNA可以具有以下各物中的一种或多种：包含Kozak共有序列的5'-UTR、包含增加体内RNA稳定性的序列的 5'-UTR或3'-UTR(例如，α-珠蛋白或β-珠蛋白5'-UTR或α-珠蛋白或β- 珠蛋白3'-UTR)和长度为约20个核苷酸至约250个核苷酸(例如，长度为约20、或约30、或约40、或约50、或约60、或约70、或约80、或约90、或约100、或约110、或约120、或约130、或约140、或约 150、或约160、或约170、或约180、或约190、或约200、或约210、或约220、或约230、或约240、或约250个核苷酸)的3'聚(A)尾。
另外，本文所述的方法的一些方面可用于各种医学治疗，举例说明，这些医学治疗包括治疗外皮系统的疾病、病症和/或病况或者更改、改进和/或改变外皮系统(例如，在美容上)。
还预期适用于人治疗的试剂盒，其包含以约10ng至约5000 ng(例如，约或不超过约10ng、或20ng、或50ng、或100ng、或200 ng、或300ng、或400ng、或500ng、或600ng、或700ng、或800 ng、或900ng、或1000ng、或1100ng、或1200ng、或1300ng、或 1400ng、或1500ng、或1600ng、或1700ng、或1800ng、或1900ng、或2000ng、或3000ng、或4000ng、或5000ng)的单位剂型的本文所述的核酸药物和注射针头。
另外，在一些方面，本发明提供一种包含本文所述的核酸药物和本文所述的媒剂(亦称“转染试剂”，例如脂质)中的一种或多种的药物制剂，所述制剂任选地适合皮下注射、皮内注射、表皮下注射、肌肉内注射、眼内注射、玻璃体内注射、关节内注射、心内注射、静脉内注射、硬膜外注射、鞘内注射、门静脉内注射、肿瘤内注射和局部施用中的一种或多种。如本文所用，术语“注射”可以指例如用注射器注射，以及其他施用液体的方法，例如输注、灌注、使用笔式注射器、药筒系统针阵列或贴片施用和/或通过导管系统施用。
在一些方面，提供核酸递送贴片。在一个方面，提供使用电场递送核酸的装置。其他方面涉及用于将核酸递送到皮肤的方法和组合物。再另外的方面涉及用于在皮肤中表达蛋白质的方法和组合物。
在一个方面，本发明提供用于治疗人疾病和病况的方法和组合物，所述治疗包括但不限于预防性治疗、罕见疾病(包括但不限于皮肤病学罕见疾病)的治疗以及用于医学皮肤病学和美容医学的治疗。在另一个方面，本发明提供包含核酸的化妆品。再另外的方面涉及用于更改色素沉着，例如用于治疗色素沉着病症的方法和组合物。再另外的方面涉及用于增强愈合(包括但不限于响应于伤口或手术的愈合)的方法和组合物。本发明的组合物可以更改、改进和/或改变受试者的外皮系统成员诸如但不限于皮肤、毛发和指甲的外观。这种更改、改进和/或改变可以在如本文所述的治疗方法和/或治疗用途(包括但不限于皮肤病治疗和化妆工序)的背景下。
另外，在各个实施方案中，本发明涉及靶向不限于皮肤病学应用的各种治疗性蛋白质。例如，在各个实施方案中，本发明的组合物和方法可用于治疗方法，所述治疗方法由例如本文所说明的各种可溶性蛋白质的表达增加所介导。在各个实施方案中，核酸药物编码和/或增加以下各物中的一种或多种的表达：循环蛋白、细胞外基质蛋白、工程改造蛋白、基因编辑蛋白、蛋白质或肽激素、酶、促红细胞生成素、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、NOVEPOETIN、弹性蛋白、胶原蛋白、抗体或抗体片段(例如，中和抗体或抗体片段)、细胞内蛋白、端粒酶逆转录酶、膜蛋白、融合蛋白、受体、配体结合结构域、蛋白质抑制剂、或其生物活性片段、类似物或变体。在其他实施方案中，核酸药物的施用引起以下一种或多种：血细胞比容增加；组织弹性增加；组织强度增加；和皮肤水合和/或水分保持增加；毛发生长；脂肪减少；DNA中的插入、缺失或突变；前药向活性药物转化；肿瘤大小和/或数量减少；斑块大小和/或数量减少；血管化增加；血管化减少；视力增加；疼痛减少；心输出量(例如，射血分数和每搏输出量)增加；心律异常减少；纤维化减少；一种或多种不良神经系统症状、病况或病症(例如，抑郁、食欲失调、多食、厌食、痴呆、头痛、疲劳、麻木、震颤和头晕)减少；勃起功能障碍减少；活力增加；肺功能增加；肾功能增加；肝功能增加；胰岛素敏感性增加；胰岛素敏感性减小；炎症减少；泪液产生增加；听力改善；听觉感知增加；耳鸣减少；汗液减少；感染部分或完全清除；生育能力增加；生育能力减小；抑制或中和蛋白质；招募或刺激免疫系统的一种或多种组分；端粒延长；抑制细胞衰老；复制潜力、重新编程、增殖、分化增加以及分化潜力增加。
在一些方面，提供具有低毒性和高翻译效率的RNA分子。在一个方面，提供用于细胞的高效体内转染、重新编程和基因编辑的细胞培养基。其他方面涉及用于产生编码重新编程蛋白的RNA分子的方法。再另外的方面涉及用于产生编码基因编辑蛋白的RNA分子的方法。
在一个方面，本发明提供包含工程改造的核酸酶裂解结构域的高效基因编辑蛋白。在另一个方面，本发明提供包含工程改造的核酸酶裂解结构域的高保真基因编辑蛋白。其他方面涉及包含工程改造的 DNA结合结构域的高效基因编辑蛋白。再另外的方面涉及包含工程改造的DNA结合结构域的高保真基因编辑蛋白。再另外的方面涉及包含工程改造的重复序列的基因编辑蛋白。再另外的方面涉及包含 DNA修饰结构域的基因编辑蛋白。一些方面涉及通过用基因编辑蛋白转染细胞或诱导细胞表达基因编辑蛋白来更改细胞DNA序列的方法。其他方面涉及用于更改体外培养物中存在的细胞的DNA序列的方法。再另外的方面涉及用于更改体内存在的细胞的DNA序列的方法。
在一些方面，本发明提供用于治疗癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的基因编辑蛋白或编码基因编辑蛋白的核酸。在一个方面，基因编辑蛋白能够更改癌症相关基因的DNA序列。在另一个方面，癌症相关基因是BIRC5基因。在其他方面，基因编辑蛋白能够更改细胞的DNA序列以促使细胞表达抗原或抗原受体。在一个方面，抗原是肿瘤抗原。在一个方面，抗原受体与肿瘤抗原结合。在又另一个方面，抗原受体是嵌合抗原受体。再其他方面涉及包含核酸和/或细胞的治疗剂和使用包含核酸和/或细胞的治疗剂治疗例如以下病症的方法：1型糖尿病、包括心脏病(缺血性和扩张性心肌病)、黄斑变性、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、囊性纤维化、镰状细胞贫血、地中海贫血、范可尼贫血(Fanconianemia)、严重联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、着色性干皮病、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)、肌肉营养不良、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、癌症和传染性疾病(包括肝炎和HIV/AIDS)。在一些方面，核酸包括RNA。在其他方面，RNA包含一种或多种非规范核苷酸。在再其他方面，使用病毒将核酸递送到细胞。在一些方面，所述病毒是复制型病毒。在其他方面，所述病毒是复制缺陷型病毒。
在以下所附描述中陈述本发明的细节。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但现在描述说明性的方法和材料。自描述和权利要求书中将显而易见本发明的其他特征、目的和优点。除非上下文另外清楚地指出，否则在说明书和所附权利要求书中，单数形式还包括复数。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。
本文公开的任何方面或实施方案都可以与如本文公开的任何其他方面或实施方案组合。
附图说明
图1描绘用编码绿色荧光蛋白(“GFP”)且包含所指示的核苷酸的 RNA转染的原代成人真皮成纤维细胞。
图2描绘使用一步实时RT-PCR和设计用于扩增人干扰素β mRNA的引物对图1的原代成人真皮成纤维细胞的基因表达分析的结果。将数据标准化为未转染的样品(“Neg.”)。GAPDH用作加载对照。
图3描绘如图2所示进行的用包含所指示的核苷酸的RNA转染的细胞的基因表达分析的结果。将数据标准化为未转染的样品 (“Neg.”)。GAPDH用作加载对照。
图4描绘如图2所示进行且使用设计用于扩增所指示的转录物的引物的用包含所指示的核苷酸的RNA转染的细胞的基因表达分析的结果。将数据标准化为未转染的样品(“Neg.”)。GAPDH用作加载对照。
图5描绘如图2所示进行的用编码NOVEPOETIN且包含所指示的核苷酸的RNA转染的原代人表皮角质形成细胞的基因表达分析的结果。将数据标准化为未转染的样品(“Neg.”)。GAPDH用作加载对照。
图6描绘将包含编码GFP的RNA的溶液皮内注射到健康的33 岁70kg男性受试者的前臂腹侧中。
图7描绘在用包含5-甲氧基尿苷并编码GFP(注射部位1-3)或 COL7(注射部位4)的RNA治疗后，图6中所示的受试者的前臂腹侧的区域。图像是在最终注射后立即拍摄。
图8描绘注射后24小时的图7的区域。
图9描绘使用所指示的荧光通道对图7的区域获得荧光图像的结果。还指示每个注射部位的剂量。图像是在注射后24小时拍摄。
图10描绘使用FITC荧光通道对图7的区域获得荧光图像的结果。指示每个注射部位的剂量。图像是在注射后48小时拍摄。
图11描绘使用FITC荧光通道对图7的区域获得定量荧光图像的结果。横轴指示注射后的时间。
图12描绘独立实验的荧光图像的结果，其中图6中所示受试者的前臂腹侧区域用包含5-甲氧基尿苷并编码GFP的RNA治疗。图像是在注射后24小时拍摄。
图13描绘设计用于检测在用包含所指示的核苷酸并编码 NOVEPOETIN的RNA转染的原代人表皮角质形成细胞的培养基中的阿法达贝泊汀的ELISA的结果。
图14描绘设计用于检测在用包含所指示的核苷酸并编码 NOVEPOETIN的RNA转染的原代人表皮角质形成细胞的培养基中的阿法达贝泊汀的ELISA的结果。
图15描绘设计用于检测在用包含所指示的核苷酸并编码 NOVEPOETIN的RNA转染的原代人表皮角质形成细胞的培养基中的阿法达贝泊汀的ELISA的结果。
图16描绘用包含5-甲氧基尿苷并编码hTERT的RNA转染的原代人真皮成纤维细胞。将细胞固定并在转染后24小时使用靶向hTERT的抗体染色。
图17描绘用如所指示制备并储存的编码绿色荧光蛋白(“GFP”) 的RNA转染的原代成人真皮成纤维细胞。
图18描绘单次施用NOVECRIT诱导NOVEPOIETIN在血清中的快速增加且持续的水平。Y轴显示NOVEPOIETIN蛋白的浓度 (mU/mL)。
图19描绘单次施用NOVECRIT刺激红细胞生成，产生升高的血细胞比容，持续至少14天。左图在Y轴上显示血细胞比容％，而右图显示网织红细胞％。
图20描绘汇总在实施例35的雄性斯普拉格杜勒(Sprague Dawley) 大鼠研究中从最大耐受剂量的NOVECRIT收集的血浆样品中TNFa、 IL-6和IFNa细胞因子水平的表格。
图21描绘使用用靶向位于COL7A1基因内的序列 TGAGCAGAAGTGGCTCAGTG(SEQ IDNO:467)和 TGGCTGTACAGCTACACCCC(SEQ ID NO:468)的RNA TALEN转染的原代成人真皮成纤维细胞的DNA的SURVEYOR测定。存在于 +RNA泳道中的条带指示常参与营养不良性大疱性表皮松解症的基因区域的编辑。
图22描绘使用用靶向位于COL7A1基因内的序列 TTCCACTCCTGCAGGGCCCC(SEQ IDNO:469)和TCGCCCTTCAGCCCGCGTTC(SEQ ID NO:470)的RNA TALEN转染的原代成人真皮成纤维细胞的DNA的SURVEYOR测定。存在于 +RNA泳道中的条带指示常参与营养不良性大疱性表皮松解症的基因区域的编辑。
图23显示各种合成RNA构建体(即，未修饰的核苷酸“A、G、U、 C”；仅假尿苷“psU”；仅5-甲基胞苷“5mC”；假尿苷和5-甲基胞苷“psU +5mC”；和阴性对照“neg”)在基因编辑背景下的免疫原性。
图24显示用各种合成RNA构建体(即，未修饰的核苷酸“A、G、 U、C”；仅假尿苷“psU”；仅5-甲基胞苷“5mC”；假尿苷和5-甲基胞苷“psU+5mC”；和阴性对照“neg”)转染的细胞中的基因编辑活性。
图25描绘用编码TALEN的RNA和指示长度的单链DNA修复模板(“RT”)转染的原代人表皮角质形成细胞中COL7A1基因的基因编辑。星号(“*”)所示位置处存在条带指示成功的基因编辑。
图26描绘用编码TALEN的RNA和80nt单链DNA修复模板 (“RT”)以指示比率的RNA:修复模板转染的原代人表皮角质形成细胞中COL7A1基因的基因编辑。星号(“*”)所示位置处存在条带指示成功的基因编辑。
图27描绘用编码TALEN的RNA和指示长度的单链DNA修复模板(“RT”)转染的原代人表皮角质形成细胞中COL7A1基因的基因校正。星号(“*”)所示位置处存在条带指示成功的基因校正。
图28描绘用编码TALEN的RNA和80nt单链DNA修复模板 (“RT”)以指示比率的RNA:修复模板转染的原代人表皮角质形成细胞中COL7A1基因的基因校正。星号(“*”)所示位置处存在条带指示成功的基因校正。
图29描绘用编码TALEN的RNA和80nt单链DNA修复模板 (“RT”)转染的原代人表皮角质形成细胞中COL7A1基因的基因编辑 (“T7E1”)和校正(“消化”)。星号(“*”)所示位置处存在条带指示成功的基因编辑(“T7E1”)和校正(“消化”)。
图30描绘通过ELISA测量的由用编码指示的BMP7变体的RNA 转染的原代人真皮成纤维细胞和原代人表皮角质形成细胞分泌的 BMP7蛋白的量。星号(“*”)指示ELISA测定的饱和度。
图31描绘通过ELISA测量的由用编码PTH的RNA转染的原代人表皮角质形成细胞分泌的甲状旁腺激素的量。
图32表明重复施用NOVECRIT刺激红细胞生成，产生升高的血细胞比容，持续至少14天。对于每个数据集，从左到右的柱状图的顺序为：第1组、第2组、第3组、第4组和第5组。
图33提供用于研究编码BMP7变体的RNA对预防和治疗糖尿病性肾病的作用的说明性实验设计。
图34描述如实施例42中所述的用编码BMP7变体的RNA治疗的大鼠中的BMP7蛋白水平。误差条指示SEM(n＝6)。
图35描绘如实施例42中所述的用编码BMP7变体的RNA治疗的大鼠的尿量、尿白蛋白和尿肌酸酐水平。对于每个数据集，从左到右的柱状图的顺序为：尿量、尿肌酐和尿白蛋白。
图36描述如实施例42中所述的编码BMP7变体的RNA在治疗糖尿病性肾病中的效果。对于每个数据集，从左到右的柱状图的顺序为：第6组-媒剂和第7组-FTB-2(BMP7变体A)。
图37，图37 中的 A-I，描绘用编码BDNF、BMP-2、BMP-6、IL-2、IL-6、 IL-15、IL-22、LIF或FGF-21的RNA转染的人表皮角质形成细胞的基因表达分析的结果。
图38描绘用编码IL-15或IL-15和IL-15RA的RNA转染的人表皮角质形成细胞的基因表达分析的结果。
图39描述如实施例45中所述在单次皮内注射编码这些蛋白质的各种RNA后FGF21、IL15、IL6、IL22和Novepoietin的血清水平。对于所测试的每种RNA，分析三只大鼠。
图40描绘实施例46中描述的伤口愈合测定的结果。对于每个孔，测量四个划痕位置，并且对于每种条件，测量两个孔。误差条指示标准偏差。
图41描绘如实施例47中所述的原代人表皮角质形成细胞的基因编辑。
图42描绘如实施例47中所述的原代人表皮角质形成细胞的基因校正。
图43描绘如实施例47中所述的原代人表皮角质形成细胞的基因编辑。
图44描述COLO205人结肠直肠腺癌细胞中的IL10产生。将 COLO205细胞以20,000个细胞/孔的密度在24孔板中在每孔0.5mL RPMI1640+10％FBS中接种。次日，将细胞(i)用0.4μg编码GFP的 RNA转染，如实施例(实施例3)中所述，(ii)用0.4μg编码IL22的RNA 转染，如实施例(实施例3)中所述，(iii)暴露于取自用编码IL22的RNA 转染的人表皮角质形成细胞的细胞培养基，(iv)暴露于取自未转染的人表皮角质形成细胞的细胞培养基，(v)暴露于重组人IL22 (782-IL-010；R&D Systems)。48小时后，经由ELISA(D1000B；R& D Systems)测量培养基中的IL10水平。在实验之前经由ELISA (D2200；R&D Systems)测定样品的IL22水平(iii)，并且对于条件(iv)，使用相同体积的培养基。
图45描绘BMP7活性测定，其涉及在用编码BMP7(变体A)的 RNA转染或暴露于重组人BMP7后ATDC 5细胞中的碱性磷酸酶活性的测量。将ATDC 5细胞以20,000个细胞/孔的密度在24孔板中在 DMEM/F12+5％FBS中接种。次日，通过将培养基更换为DMEM/F12 +2％FBS使细胞血清饥饿。接下来的一天，将细胞(i)用编码BMP7 的RNA转染或(ii)暴露于重组人BMP7(54-BP-010，R&D Systems)。三天后，测量细胞内碱性磷酸酶活性(ab83369；Abeam)。
图46描绘以下实验的结果，在所述实验中将100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(不含动物蛋白)用2μg编码所指示的基因编辑蛋白的RNA(1μg L和1μg R)转染。48h后收获DNA并分析基因编辑(A/B指示RIBOSLICE_AL、RIBOSLICE_BR；RIBOSLICE A 指示包含序列：GHGG、HG、GHGG、HG等的重复序列；RIBOSLICE B指示包含序列：HG、GHGG、HG、GHGG等的重复序列；L靶向序列：TGCCTGGTCCCTGTCTCCCT(SEQ ID NO:615)；R靶向序列：TGTCTTCTGGGCAGCATCTC(SEQ ID NO:616)；靶序列距A1AT [SERPINA1]起始密码子约75bp)。“TAL”指示针对靶序列的对照 TALEN。
图47描绘以下实验的结果，在所述实验中将100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(不含动物蛋白)用2μg编码所指示的基因编辑蛋白的RNA(1μg L和1μg R)转染。48h后收获DNA并分析基因编辑(A/B指示RIBOSLICE_AL、RIBOSLICE_BR；RIBOSLICE A 指示包含序列：GHGG、HG、GHGG、HG等的重复序列；RIBOSLICE B指示包含序列：HG、GHGG、HG、GHGG等的重复序列；L靶向序列：TATTCCCGGGCTCCCAGGCA(SEQ ID NO:622)；R靶向序列：TCTCCTGGCCTTCCTGCCTC(SEQ ID NO:612)；靶序列在 COL7A1的外显子73的末端附近)。“TAL”指示针对靶序列的对照 TALEN。
图48描绘以下实验的结果，在所述实验中将50,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(HEKn)(无动物蛋白)用2μg编码所指示的基因编辑蛋白的RNA转染。在48h后收获DNA并分析基因编辑(“Neg”指示未处理的HEKn DNA；“WT”指示野生型FokI；“EA”指示增强的活性FokI(S35P和K58E)；“Het”指示异二聚体(L：Q103E、N113D、 I116L，R：E107K、H154R、I155K)；“EA/Het”指示EA和Het；L靶向序列：TATTCCCGGGCTCCCAGGCA(SEQ ID NO:622)；R靶向序列：TCTCCTGGCCTTCCTGCCTC(SEQ ID NO:612)；靶序列在 COL7A1的外显子73的末端附近)。
图49描绘以下实验的结果，在所述实验中将6孔板的每个孔 100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(无动物蛋白)用2ug编码 hGDF15的RNA转染。在通过ELISA(R&DDGD150)转染后，在所指示的时间分析培养基的GDF15。
图50描绘以下实验的结果，在所述实验中将6孔板的每个孔 100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(无动物蛋白)用2ug编码所指示的蛋白质的RNA转染。在通过ELISA(Abeam ab176644)转染后，在所指示的时间分析培养基的IFKB。对于每个时间点，柱状图指示(从左到右)：IFKB WT、IFKB S32A、S36A和Neg。
图51描绘以下实验的结果，在所述实验中将6孔板的每个孔 100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(无动物蛋白)用2μg编码所指示的蛋白质的RNA转染。图像是在转染后24h拍摄。
图52描绘以下实验的结果，在所述实验中将24孔板的每个孔 20,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(无动物蛋白)用0.2μg编码 SOD3的RNA转染。将细胞固定并在转染后24h用1:100稀释的 NBP2-38493(Novus)兔抗人SOD3一抗和1:1000稀释的488驴抗兔二抗染色。“BF”指示明场，且“FL”指示荧光。
图53描绘以下实验的结果，在所述实验中向ZDF大鼠在第1天、第8天和第15天通过皮内注射施用编码hGDF15的RNA(第4组，灰色曲线(底部))或仅施用媒剂(第3组，黑色曲线(顶部))。在所指示的时间测量ALT血清水平。
图54描绘以下实验的结果，在所述实验中向ZDF大鼠在第1天、第8天和第15天通过皮内注射施用编码hGDF15的RNA(第4组，灰色曲线(底部))或仅施用媒剂(第3组，黑色曲线(顶部))。在所指示的时间测量AST血清水平。
图55描绘以下实验的结果，在所述实验中向ZDF大鼠在第1天、第8天和第15天通过皮内注射施用编码hGDF15的RNA(第4组，灰色曲线(顶部))或仅施用媒剂(第3组，黑色曲线(底部))。在所指示的时间测量总胆固醇血清水平。
图56描绘以下实验的结果，在所述实验中向ZDF大鼠在第1天、第8天和第15天通过皮内注射施用编码hGDF15的RNA(第4组，灰色(在第7天，底部))或仅施用媒剂(第3组，黑色(在第7天，顶部))。在所指示的时间测量葡萄糖血清水平。
图57描绘以下实验的结果，在所述实验中向ZDF大鼠在第1天、第8天和第15天通过皮内注射施用编码hGDF15的RNA(第4组，灰色(顶部))或仅施用媒剂(第3组，黑色(底部))。在所指示的时间测量甘油三酯血清水平。
图58描绘以下实验的结果，在所述实验中向ZDF大鼠在第1天、第8天和第15天通过皮内注射施用编码hGDF15的RNA(治疗组)或仅施用媒剂(对照组)。显示治疗组相对于对照组而言ALT、AST、总胆固醇、葡萄糖和甘油三酯血清水平的变化％。
图59描绘以下实验的结果，在所述实验中向瘦的斯普拉格-杜勒大鼠在第1天、第8天和第15天通过皮内注射施用编码hGDF15的 RNA(第2组)或仅施用媒剂(第1组)且向ZDF大鼠在第1天、第8天和第15天通过皮内注射施用编码hGDF15的RNA(第4组)或仅施用媒剂(第3组)。在所指示的时间测量GDF15血清水平。对于每个时间点，柱状图指示(从左到右)第1组、第2组、第3组和第4组。
图60描绘以下实验的结果，在所述实验中将6孔板的每个孔 200,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(无动物蛋白)用2μg编码 hESM1的RNA转染。在转染后，通过ELISA分析培养基的ESM1 52 (Abeam ab213776)。
图61描绘以下实验的结果，在所述实验中将100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(无动物蛋白)用2μg编码HBB外显子1 TALEN L和HBB外显子1TALEN R基因编辑蛋白的RNA(各1μg) 转染。在48小时后收获DNA并分析基因编辑(T7E1测定；正向引物：gccaaggacaggtacggctgtcatc(SEQ ID NO:627)；反向引物：cttgccatgagccttcaccttagggttg(SEQ ID NO:628)；产物大小：518nt；预测的条带大小：300nt、218nt)。
图62描绘以下实验的结果，在所述实验中将100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(无动物蛋白)用2μg编码PD1外显子1 TALEN L和PD1外显子1TALEN R基因编辑蛋白的RNA(各1μg) 转染。在48小时后收获DNA并分析基因编辑(T7E1测定；正向引物：tcctctgtctccctgtctctgtctctctctc(SEQ ID NO:594)；反向引物：ggacttgggccaggggaggag(SEQ ID NO:595)；产物大小：612nt；预测的条带大小：349nt、263nt)。
具体实施方式
本发明部分地基于核酸药物在人中的安全且有效给药策略的发现，所述核酸药物包括RNA，诸如包含非规范(或“经修饰的”)核苷酸的RNA。本发明人认为这是在人中安全且有效地RNA分子给药的首次报道，所述RNA分子包括包含非规范核苷酸的那些。尽管本领域报道哺乳动物给药需要非常大剂量的RNA分子，并且尽管给药量高，但实现最小的治疗效果(参见，例如美国专利公开号2013/0245103)，但本发明人惊奇地设法在人中进行合成RNA给药，并且在最小免疫或其他副作用的情况下实现显著的靶蛋白表达。
在各个实施方案中，本发明提供核酸药物的改善剂量、制剂、施用和使用方法，所述核酸药物包括RNA，所述RNA可以含有非规范核苷酸(例如，除腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶或其标准核苷、核苷酸、脱氧核苷或脱氧核苷酸衍生物外的残基)。在各个实施方案中，包含非规范核苷酸的RNA导致由RNA编码的蛋白质的表达，所述蛋白质通常是治疗益处之一(有时称为“靶标”或“关注的蛋白质”)。另外，治疗性蛋白质的这种表达在最小或可忽略的毒性下实现。
在各个方面，本发明基于核酸药物对于人受试者的安全且有效的剂量和施用参数的惊奇发现。核酸药物包括dsDNA分子、ssDNA分子、RNA分子、dsRNA分子、ssRNA分子、质粒、寡核苷酸、合成 RNA分子、miRNA分子、mRNA分子和siRNA分子。在各个实施方案中，RNA包含非规范核苷酸。
在一些方面，提供一种用于递送核酸药物的方法，其包括向有需要的人受试者施用有效剂量的核酸药物，其中所述核酸药物包括合成 RNA。在各个实施方案中，有效剂量是足以明显增加人受试者中由核酸药物编码的蛋白质的量的量。例如，当核酸药物是包含一种或多种经修饰的核苷酸的合成RNA时，核酸药物可以引起比用不包含一种或多种经修饰的核苷酸的核酸药物(例如，包含规范核苷酸A、G、U 和C的RNA)可获得的水平高的蛋白质表达。在一些实施方案中，与用不包含一种或多种经修饰的核苷酸的核酸药物可获得的水平相比较，核酸药物引起蛋白质表达增加约2倍、或约3倍、或约4倍、或约5倍、或约10倍、或约15倍、或约20倍、或约25倍、或约30 倍、或约35倍、或约40倍、或约45倍、或约50倍、或约100倍。
在一些实施方案中，核酸药物提供持续的治疗效果，其任选地由靶蛋白的持续表达介导。例如，在一些实施方案中，治疗效果在施用后存在超过约1天、或超过约2天、或超过约3天、或超过约4天、或超过约5天、或超过约6天、或超过约7天、或超过约8天、或超过约9天、或超过约10天、或超过约14天。在一些实施方案中，这种持续效果消除对于维持剂量的需要或降低维持剂量的量。
在一些实施方案中，核酸药物提供持续的靶蛋白水平。例如，在一些实施方案中，靶蛋白在施用后存在(例如，以可测量的量，例如在已施用核酸药物的患者的血清中)超过约1天、或超过约2天、或超过约3天、或超过约4天、或超过约5天、或超过约6天、或超过约7天、或超过约8天、或超过约9天、或超过约10天、或超过约 14天。在一些实施方案中，这种持续效果消除对于维持剂量的需要或降低维持剂量的量。
在各个实施方案中，核酸药物提供治疗作用而不持续存在核酸药物本身。在一些实施方案中，核酸药物例如在自施用起约6小时、或约12小时、或约18小时、或约24小时、或约2天、或约3天、或约4天、或约5天、或约1周内被快速代谢。
在各个实施方案中，有效剂量是明显避免体内细胞毒性的量。在各个实施方案中，有效剂量是明显避免人受试者中的免疫反应的量。例如，免疫反应可以是由先天免疫系统介导的免疫应答。可以使用本领域已知的标志物(例如，细胞因子、干扰素、TLR)监测免疫应答。在一些实施方案中，有效剂量消除对于用用以减轻残余毒性的免疫抑制剂(例如，B18R)治疗人受试者的需要。因此，在一些实施方案中，本发明方法允许提供增加的蛋白质表达并降低毒性的剂量。
在一些实施方案中，与由相应未修饰的核酸诱导的免疫应答相比，免疫应答降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约 60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或大于约99.9％。在一些实施方案中，与由相应未修饰的核酸诱导的一种或多种免疫应答标志物的上调相比，一种或多种免疫应答标志物的上调降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约99.9％或大于约99.9％。在一些实施方案中，免疫应答标志物包括干扰素基因的mRNA或蛋白质产物，所述干扰素基因包括干扰素α基因、IFNB1、TLR3、RARRES3、 EIF2AK2、STAT1、STAT2、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFIT5、OAS1、 OAS2、OAS3、OASL、ISG20或其片段、变体、类似物或家族成员。在一些实施方案中，免疫应答标志物包括TNF基因的mRNA或蛋白质产物，所述TNF基因包括TNFα基因、TNFRSF1A、TNFRSF1B、 LTBR、TNFRSF4、CD40、FAS、TNFRSF6B、CD27、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、 TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、 TNFRSF14、NGFR、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、 TNFRSF25和EDA2R或其片段、变体、类似物或家族成员。在一些实施方案中，免疫应答标志物包括白细胞介素基因的mRNA或蛋白质产物，所述白细胞介素基因包括IL-6基因、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8或CXCL8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、 IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、 IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、 IL-32、IL-33、IL-35、IL-36或其片段、变体、类似物或家族成员。
在一些实施方案中，细胞死亡比用相应未修饰的核酸观察到的细胞死亡少约10％、约25％、约50％、约75％、约85％、约90％、约 95％或超过约95％。此外，细胞死亡可以影响少于约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％、约1％、约0.1％、约0.01％或少于约0.01％的与经修饰的核酸接触的细胞。
在一些实施方案中，提供一种用于在哺乳动物受试者的细胞群中表达关注的蛋白质的方法，其包括向所述细胞施用包含有效剂量的编码关注的蛋白质的RNA的非病毒转染组合物，所述RNA含有避免明显细胞毒性的一种或多种非规范核苷酸，其中所述转染组合物以允许所述蛋白质在所述细胞中表达至少约5天(例如，约5、或约6、或约7、约8、或约9、或约10、或约14天)而没有明显细胞毒性的量施用。在一些实施方案中，提供一种用于在哺乳动物受试者的细胞群中表达关注的蛋白质的方法，其包括向所述细胞施用包含有效剂量的编码关注的蛋白质的RNA的非病毒转染组合物，所述RNA含有避免明显细胞毒性的一种或多种非规范核苷酸，其中所述转染组合物以允许所述蛋白质在所述细胞中表达至少约6小时(例如，约6小时、或约12小时、或约1天、或约2天、或约3天、或约4天、或约5 天)而没有明显细胞毒性的量施用。
在一些实施方案中，核酸药物(包括合成RNA)的有效剂量为约100ng至约2000ng、或约200ng至约1900ng、或约300ng至约 1800ng、或约400ng至约1700ng、或约500ng至约1600ng、或约 600ng至约1500ng、或约700ng至约1400ng、或约800ng至约1300 ng、或约900ng至约1200ng、或约1000ng至约1100ng、或约500 ng至约2000ng、或约500ng至约1500ng、或约500ng至约1000ng、或约1000ng至约1500ng、或约1000ng至约2000ng、或约1500ng 至约2000ng、或约100ng至约500ng、或约200ng至约400ng、或约10ng至约100ng、或约20ng至约90ng、或约30ng至约80ng、或约40ng至约70ng、或约50ng至约60ng。
在一些实施方案中，核酸药物(包括合成RNA)的有效剂量不超过约50ng、或约100ng、或约200ng、或约300ng、或约400ng、或约500ng、或约600ng、或约700ng、或约800ng、或约900ng、或约1000ng、或约1100ng、或约1200ng、或约1300ng、或约1400 ng、或约1500ng、或约1600ng、或约1700ng、或约1800ng、或约 1900ng、或约2000ng、或约3000ng、或约4000ng、或约5000ng。
在一些实施方案中，核酸药物(包括合成RNA)的有效剂量为约50ng、或约100ng、或约200ng、或约300ng、或约400ng、或约500ng、或约600ng、或约700ng、或约800ng、或约900ng、或约1000ng、或约1100ng、或约1200ng、或约1300ng、或约1400ng、或约1500ng、或约1600ng、或约1700ng、或约1800ng、或约1900 ng、或约2000ng、或约3000ng、或约4000ng、或约5000ng。
在一些实施方案中，核酸药物(包括合成RNA)的有效剂量为约0.028pmol、或约0.05pmol、或约0.1pmol、或约0.2pmol、或约 0.3pmol、或约0.4pmol、或约0.5pmol、或约0.6pmol、或约0.7pmol、或约0.8pmol、或约0.9pmol、或约1.0pmol、或约1.2pmol、或约1.4pmol、或约1.6pmol、或约1.8pmol、或约2.0pmol、或约2.2pmol、或约2.4pmol、或约2.6pmol、或约2.8pmol、或约3.0pmol、或约 3.2pmol、或约3.4pmol、或约3.6pmol、或约3.8pmol、或约4.0pmol、或约4.2pmol、或约4.4pmol、或约4.6pmol、或约4.8pmol、或约5.0pmol、或约5.5pmol、或约5.7pmol。
在一些实施方案中，核酸药物(包括合成RNA)以约0.1nM、或约0.25nM、或约0.5nM、或约0.75nM、或约1nM、或约2.5nM、或约5nM、或约7.5nM、或约10nM、或约20nM、或约30nM、或约40nM、或约50nM、或约60nM、或约70nM、或约80nM、或约90nM、或约100nM、或约110nM、或约120nM、或约150nM、或约175nM、或约200nM的浓度施用。
在一些实施方案中，核酸药物的有效剂量为约350ng/cm2、或约 500ng/cm2、或约750ng/cm2、或约1000ng/cm2、或约2000ng/cm2、或约3000ng/cm2、或约4000ng/cm2、或约5000ng/cm2、或约6000 ng/cm2、或约7000ng/cm2。在其他实施方案中，有效剂量小于约350ng/cm2。在某些实施方案中，有效剂量为约35ng/cm2、或约50ng/cm2、或约75ng/cm2、或约100ng/cm2、或约150ng/cm2、或约200ng/cm2、或约250ng/cm2、或约300ng/cm2、或约350ng/cm2。
在一些实施方案中，核酸药物的有效剂量为约35ng/cm2至约 7000ng/cm2、或约50ng/cm2至约5000ng/cm2、或约100ng/cm2至约 3000ng/cm2、或约500ng/cm2至约2000ng/cm2、或约750ng/cm2至约1500ng/cm2、或约800ng/cm2至约1200ng/cm2、或约900ng/cm2至约1100ng/cm2。
在一些实施方案中，核酸药物的有效剂量为约1皮摩尔/cm2、或约2皮摩尔/cm2、或约3皮摩尔/cm2、或约4皮摩尔/cm2、或约5皮摩尔/cm2、或约6皮摩尔/cm2、或约7皮摩尔/cm2、或约8皮摩尔/cm2、或约9皮摩尔/cm2、或约10皮摩尔/cm2、或约12皮摩尔/cm2、或约14皮摩尔/cm2、或约16皮摩尔/cm2、或约18皮摩尔/cm2、或约20 皮摩尔/cm2。在其他实施方案中，有效剂量小于约1皮摩尔/cm2。在某些实施方案中，有效剂量为约0.1皮摩尔/cm2、或约0.2皮摩尔/cm2、或约0.3皮摩尔/cm2、或约0.4皮摩尔/cm2、或约0.5皮摩尔/cm2、或约0.6皮摩尔/cm2、或约0.7皮摩尔/cm2、或约0.8皮摩尔/cm2、或约 0.9皮摩尔/平cm2、或约1皮摩尔/cm2。
在一些实施方案中，核酸药物的有效剂量为约0.1皮摩尔/cm2至约20皮摩尔/cm2、或约0.2皮摩尔/cm2至约15皮摩尔/cm2、或约0.5 皮摩尔/cm2至约10皮摩尔/cm2、或约0.8皮摩尔/cm2至约8皮摩尔 /cm2、或约1皮摩尔/cm2至约5皮摩尔/cm2、或约2皮摩尔/cm2至约 4皮摩尔/cm2。
在各个实施方案中，核酸药物(包括合成RNA)以药学上可接受的制剂施用。在各个实施方案中，核酸药物(包括合成RNA)被配制成用于注射和局部施用中的一种或多种。举例来说，核酸药物(包括合成RNA)可以被配制成用于注射到关注的组织，例如疾病部位(作为非限制性实例，肿瘤)。在各个实施方案中，注射包括经由贴片递送。在一些实施方案中，递送通过电刺激介导。在各个实施方案中，核酸药物(包括合成RNA)被配制成用于施用到表皮(任选地选自角质层、透明质层、颗粒层、棘层和生发层)、基底膜、真皮(任选地选自乳头状区域和网状区域)、皮下组织、结膜角膜、巩膜、虹膜、晶状体、角膜缘、视神经、脉络膜、睫状体、前段、前房和视网膜中的一种或多种。在各个实施方案中，核酸药物(包括合成RNA)被配制成用于皮下注射、皮内注射、真皮下注射、肌肉内注射、眼内注射、玻璃体内注射、关节内注射、心内注射、静脉内注射、硬膜外注射、鞘内注射、门静脉内注射、肿瘤内注射和局部施用中的一种或多种。在各个实施方案中，核酸药物(包括合成RNA)被配制成用于皮内 (ID)注射至真皮或表皮中的一种或多种。在各个实施方案中，核酸药物(包括合成RNA)以使得其影响角质形成细胞和成纤维细胞中的一种或多种(例如，使这些细胞表达一种或多种治疗性蛋白质)的方式施用。
因此，本发明提供如本文所述的各种制剂。另外，在一些实施方案中，本文所述的制剂可用于本发明的各种递送和/或治疗方法。例如，制剂可以包括囊泡，例如脂质体(参见Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat等人，Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编),Liss,New York,第353-365页(1989)。在各个实施方案中，制剂包含脂质体的水性悬浮液。说明性脂质体组分列于表1中，并且通过举例而不是限制性地给出。在各个实施方案中，将表1的脂质中的一种或多种、或两种或更多种、或三种或更多种、或四种或更多种、或五种或更多种组合在制剂中。
表1.说明性的生物相容性脂质
在一些实施方案中，脂质体包括LIPOFECTAMINE 3000。在一些实施方案中，脂质体包括以下文献中描述的一种或多种脂质：美国专利号4,897,355或7,479,573或国际专利公开号WO/2015/089487或 Feigner,P.L.等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417，各自的全部内容以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，脂质体包含N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。在一些实施方案中，脂质体包含二油酰基磷脂酰基乙醇胺(DOPE)。
在一个实施方案中，脂质体包括一种或多种聚乙二醇(PEG)链，所述聚乙二醇(PEG)链任选地选自PEG200、PEG300、PEG400、 PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3000和 PEG4000。在一些实施方案中，PEG为PEG2000。在一些实施方案中，脂质体包括1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)或其衍生物。
在一些实施方案中，制剂包含N-(羰基-乙氧基聚乙二醇 2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(MPEG2000-DSPE)、完全氢化的磷脂酰胆碱、胆固醇、LIPOFECTAMINE 3000、阳离子脂质、聚阳离子脂质和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-5000](FA-MPEG5000-DSPE)中的一种或多种。
在一个实施方案中，制剂包含约3.2mg/mL N-(羰基-乙氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺 (MPEG2000-DSPE)、约9.6mg/mL完全氢化的磷脂酰胆碱、约3.2 mg/mL胆固醇、约2mg/mL硫酸铵和组氨酸作为缓冲剂以及添加到脂质混合物中的约0.27mg/mL 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 -N-[叶酸(聚乙二醇)-5000](FA-MPEG5000-DSPE)。在另一个实施方案中，通过每约1μg核酸组合1μL的LIPOFECTAMINE 3000并在室温下温育至少约5分钟来使核酸复合。在一个实施方案中， LIPOFECTAMINE 3000是包含浓度为约1mg/mL的脂质的溶液。在一些实施方案中，通过每约1μg核酸组合约10μg的脂质体制剂并在室温下温育约5分钟来将核酸包封。
在一些实施方案中，制剂包含一种或多种纳米粒子。在一个实施方案中，纳米粒子是聚合纳米粒子。在各个实施方案中，制剂包含二嵌段共聚物、三嵌段共聚物、四嵌段共聚物和多嵌段共聚物中的一种或多种。在各个实施方案中，制剂包含一种或多种聚合纳米粒子，所述聚合纳米粒子包含聚乙二醇(PEG)-改性的聚乳酸(PLA)二嵌段共聚物(PLA-PEG)和PEG-聚丙二醇-PEG-改性的PLA-四嵌段共聚物 (PLA-PEG-PPG-PEG)。
在一些实施方案中，制剂包含WO/2000/027795中描述的一种或多种脂质，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，治疗剂包含一种或多种配体。在另一个实施方案中，治疗剂包含以下中的至少一种：雄激素、CD30(TNFRSF8)、细胞穿透肽、CXCR、雌激素、表皮生长因子、EGFR、HER2、叶酸、胰岛素、胰岛素样生长因子-I、白细胞介素-13、整联蛋白、孕酮、基质源因子-1、凝血酶、维生素D和转铁蛋白或其生物活性片段或变体。
本发明的活性组合物可以包括经典的药物制剂。根据本发明的这些组合物的施用可以经由任何常规途径进行，只要靶组织可经由该途径利用即可。这包括口服、经鼻或经颊。或者，施用可以通过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、门静脉内或静脉内注射，或通过直接注射到患病如癌症组织进行。本文公开的剂也可以通过导管系统施用。这类组合物通常将作为如本文所述的药学上可接受的组合物施用。
本文所述组合物的施用可以例如通过注射、局部施用、眼科施用和鼻内施用进行。在一些实施方案中，注射可以与电力(例如，电穿孔，包括用用于电化学疗法的装置(例如，CLINIPORATOR、IGEA Sri、 Carpi[MO]，意大利))相关联。局部施用可以是但不限于乳膏、洗剂、软膏、凝胶、喷雾剂、溶液等。局部施用可以还包括渗透增强剂，诸如但不限于表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、非螯合非表面活性剂、聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚、脂肪酸和/ 或盐与胆汁酸和/或盐组合、钠盐与月桂酸、癸酸和UDCA组合等。局部施用还可以包括香料、着色剂、防晒剂、抗菌剂和/或保湿剂。本文所述的组合物可以施用到至少一个部位，所述部位诸如但不限于前额、头皮、毛囊、毛发、上眼睑、下眼睑、眉毛、睫毛、眶下区域、眶周区域、太阳穴、鼻子、鼻桥、脸颊、舌头、鼻唇沟、嘴唇、眼周区域、下巴线、耳朵、颈部、乳房、前臂、上臂、手掌、手、手指、指甲、后背、腹部、体侧、臀部、大腿、小腿、脚、脚趾等。
施用途径包括例如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、门静脉内、直肠内、通过吸入或局部施用，特别对于耳、鼻、眼或皮肤。在一些实施方案中，施用经口或通过肠胃外注射实现。
在配制时，溶液可以以与剂量制剂相容的方式并且以如本文所述的治疗有效的量施用。制剂可以容易地以多种剂型如可注射溶液、药物释放胶囊等施用。例如，对于以水溶液肠胃外施用，所述溶液通常被适当地缓冲，并且液体稀释剂首先用例如足够的盐水或葡萄糖使其等渗。这种水溶液可以用于例如静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选地，无菌水性介质如本领域技术人员已知，特别是根据本公开内容采用。
在各个实施方案中，核酸药物(包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA和/或包含其的制剂)经局部施用，任选地通过皮下注射、皮内注射、真皮下注射和肌肉内注射中的一种或多种施用，并且有效剂量施用到约4mm2至约150mm2(例如，约或不超过约4mm2、或约5mm2、或约6mm2、或约7mm2、或约8mm2、或约10mm2、或约 20mm2、或约50mm2、或约100mm2、或约150mm2)的表面积。在各个实施方案中，核酸药物(包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA和/或包含其的制剂)经局部施用，任选地通过皮下注射、皮内注射、真皮下注射和肌肉内注射中的一种或多种施用，并且有效剂量施用到不大于约4mm2、或约5mm2、或约6mm2、或约7mm2、或约8 mm2、或约10mm2、或约20mm2、或约50mm2、或约100mm2、或约150mm2的表面积。在各个实施方案中，核酸药物(包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA和/或包含其的制剂)经局部施用，任选地通过皮下注射、皮内注射、真皮下注射和肌肉内注射中的一种或多种施用，并且有效剂量施用到4mm2、或约5mm2、或约6mm2、或约7mm2、或约8mm2、或约10mm2、或约20mm2、或约50mm2、或约100mm2、或约150mm2的表面积。
在各个实施方案中，核酸药物(包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA和/或包含其的制剂)经局部施用，任选地通过皮下注射、皮内注射、真皮下注射和肌肉内注射中的一种或多种施用，并且有效剂量(RNA重量/注射表面积)为约35ng/cm2至约7000ng/cm2。在各个实施方案中，核酸药物(包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA和/或包含其的制剂)经局部施用，任选地通过皮下注射、皮内注射、真皮下注射和肌肉内注射中的一种或多种施用，并且有效剂量(RNA重量/注射表面积)为不超过约35ng/cm2、或约50ng/cm2、或约75 ng/cm2、或约100ng/cm2、或约125ng/cm2、或约150ng/cm2、或约 175ng/cm2、或约200ng/cm2、或约225ng/cm2、或约250ng/cm2、或约500ng/cm2、或约1000ng/cm2、或约2000ng/cm2、或约5000ng/cm2、或约7000ng/cm2。在各个实施方案中，核酸药物(包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA和/或包含其的制剂)经局部施用，任选地通过皮下注射、皮内注射、真皮下注射和肌肉内注射中的一种或多种施用，并且有效剂量(RNA重量/注射表面积)为约35ng/cm2、或约50ng/cm2、或约75ng/cm2、或约100ng/cm2、或约125ng/cm2、或约150 ng/cm2、或约175ng/cm2、或约200ng/cm2、或约225ng/cm2、或约 250ng/cm2、或约500ng/cm2、或约1000ng/cm2、或约2000ng/cm2、或约5000ng/cm2、或约7000ng/cm2。
药物制剂可以额外包含递送试剂(亦称“转染试剂”，亦称“媒剂”，亦称“递送媒剂”)和/或赋形剂。药学上可接受的递送试剂、赋形剂及其制备和使用方法，包括用于制备药物制剂和将其施用到患者(亦称“受试者”)的方法是本领域熟知的，并且在许多出版物，包括例如美国专利申请公开号US 2008/0213377中陈述，其全部内容以引用的方式并入本文。
例如，本发明的组合物可以呈药学上可接受的盐的形式。这类盐包括在例如J.Pharma.Sci.66,2-19(1977)和The Handbook of Pharmaceutical Salts；Properties,Selection,and Use.P.H.Stahl和C.G. Wermuth(编辑)，Verlag，Zurich(瑞士)2002中所列的那些，其全部内容以引用的方式并入本文。药学上可接受的盐的非限制性实例包括：硫酸盐；柠檬酸盐；乙酸盐；草酸盐；氯化物；溴化物；碘化物；硝酸盐；硫酸氢盐；磷酸盐；酸式磷酸盐；异烟酸盐；乳酸盐；水杨酸盐；酸式柠檬酸盐；酒石酸盐；油酸盐；丹宁酸盐；泛酸盐；酒石酸氢盐；抗坏血酸盐；琥珀酸盐；马来酸盐；龙胆酸盐；富马酸盐；葡萄糖酸盐；葡糖酸盐；糖酸盐；甲酸盐；苯甲酸盐；谷氨酸盐；甲磺酸盐；乙磺酸盐；苯磺酸盐；对甲苯磺酸盐；樟脑磺酸盐；双羟萘酸盐；苯基乙酸盐；三氟乙酸盐；丙烯酸盐；氯苯甲酸盐；二硝基苯甲酸盐；羟基苯甲酸盐；甲氧基苯甲酸盐；甲基苯甲酸盐；邻乙酰氧基苯甲酸盐；萘-2-苯甲酸盐；异丁酸盐；苯基丁酸盐；a-羟基丁酸盐；丁炔-1,4-二羧酸盐；己炔-1,4-二羧酸盐；癸酸盐；辛酸盐；肉桂酸盐；乙醇酸盐；庚酸盐；马尿酸盐；苹果酸盐；羟基马来酸盐；丙二酸盐；扁桃酸盐；甲磺酸盐；烟酸盐；邻苯二甲酸盐；对苯二甲酸盐；丙炔酸盐；丙酸盐；苯基丙酸盐；癸二酸盐；辛二酸盐；对溴苯磺酸盐；氯苯磺酸盐；乙基磺酸盐；2-羟乙基磺酸盐；甲基磺酸盐；萘-1-磺酸盐；萘-2-磺酸盐；萘-1,5-磺酸盐；二甲苯磺酸盐；酒石酸盐；碱金属如钠、钾和锂的氢氧化物；碱土金属如钙和镁的氢氧化物；其他金属如铝和锌的氢氧化物；氨和有机胺，诸如未取代的或羟基取代的单-、二-或三-烷基胺、二环己胺；三丁胺；吡啶；N-甲胺、N-乙胺；二乙胺；三乙胺；单-、双-、或三-(2-OH-低级烷基胺)，诸如单-、双-、或三-(2-羟乙基)胺、2-羟基-叔丁胺或三-(羟甲基)甲胺、N,N-二-低级烷基-N-(羟基-低级烷基)-胺，诸如N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)胺或三-(2- 羟乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；和氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸等。
本发明的药物组合物可以包含赋形剂，包括液体如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物质油、芝麻油等。药物赋形剂可以是例如盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。另外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用到受试者时，药学上可接受的赋形剂为无菌的。合适的药物赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，本文所述的任何剂还可以包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
适于肠胃外施用(例如，皮下、皮内、真皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内、关节内和输注)的剂型包括例如溶液、悬浮液、分散液、乳液等。它们也可以以无菌固体组合物(例如，冻干组合物)的形式制造，其可以就在使用前溶解或悬浮在无菌可注射介质中。它们可以含有例如本领域已知的悬浮剂或分散剂。
在一些实施方案中，本文所述的制剂可以包含白蛋白和核酸分子。
在一些实施方案中，本发明涉及一种美容组合物。在一个实施方案中，所述美容组合物包含白蛋白。在另一个实施方案中，白蛋白用离子交换树脂或木炭处理。在又另一个实施方案中，美容组合物包含核酸分子。在另一个实施方案中，美容组合物包含白蛋白和核酸分子两者。再其他实施方案涉及一种美容治疗制品，其包含容纳在装置中的美容组合物，所述装置被构造成将组合物递送到患者。再其他实施方案涉及一种被构造成将美容组合物递送到患者的装置。在一个实施方案中，核酸分子编码以下组的成员：弹性蛋白、胶原蛋白、酪氨酸酶、黑皮质素1受体、角蛋白、丝聚蛋白(filaggren)、抗体和透明质酸合酶或其生物活性片段、变体、类似物或家族成员。
在一些实施方案中，本发明提供治疗方案。本发明人已经发现，本文所述的剂量和施用可以快速(例如，在约6、或约12、或约24、或约36、或约48小时内)产生明显的蛋白质表达效果。另外，这些效果可以持续约7天或更久。在一些实施方案中，本发明方法提供约每周至约每20周一次施用核酸药物，包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA。
在一些实施方案中，约每周施用核酸药物，包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA，持续至少2周(例如，3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10周)。在一些实施方案中，约每隔一周施用核酸药物，包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA，持续至少一个月(例如，1、或2、或3、或4、或5、或6、或12个月)。在一些实施方案中，每月或约每隔一个月施用核酸药物，包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA。在一些实施方案中，施用核酸药物，包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA至少2个月、或至少4个月、或至少6个月、或至少9个月、或至少1年。
在一些实施方案中，核酸药物，包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA约每周一次、或约每2周一次、或约每3周一次、或约每 4周一次、或约每5周一次、或约每6周一次、或约每7周一次、或约每8周一次、或约每9周一次、或约每10周一次、或约每11周一次、或约每12周一次、或约每13周一次、或约每14周一次、或约每15周一次、或约每20周一次、或约每24周一次施用。
在一些实施方案中，核酸药物，包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA不超过约每周一次、或约每2周一次、或约每3周一次、或约每4周一次、或约每5周一次、或约每6周一次、或约每7周一次、或约每8周一次、或约每9周一次、或约每10周一次、或约每 11周一次、或约每12周一次、或约每13周一次、或约每14周一次、或约每15周一次、或约每20周一次、或约24周施用。
某些蛋白质具有较久的半衰期，并且可以在组织中持续数小时、数天、数周、数月或数年。现在已经发现，治疗患者的某些方法可以引起包括例如一种或多种有益蛋白质的一种或多种蛋白质的积聚。因此，某些实施方案涉及一种用于治疗患者的方法，其包括以一系列剂量向患者递送编码一种或多种蛋白质的核酸。在一个实施方案中，核酸包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA。在另一个实施方案中，在第一时间点给予第一剂量。在又另一个实施方案中，在第二时间点给予第二剂量。在另一个实施方案中，患者在第二时间点的一种或多种蛋白质中的至少一种的量大于在第一时间点所述蛋白质的量。在再另一个实施方案中，所述方法引起所述蛋白质在患者体内积聚。
在各个实施方案中，本发明涉及核酸药物，其在各个实施方案中是包含一种或多种非规范核苷酸的RNA。当掺入RNA分子中时，某些非规范核苷酸可以部分地而不希望受理论束缚地通过干扰检测外源核酸的蛋白质如蛋白激酶R、Rig-1和蛋白质的寡腺苷酸合成酶家族的结合来降低RNA分子的毒性。已经报道在掺入其中时降低RNA 分子的毒性的非规范核苷酸包括：假尿苷、5-甲基尿苷、2-硫尿苷、 5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷及其某些组合。然而，在此之前，能够使它们降低RNA分子的体内毒性的非规范核苷酸的化学特性仍然是未知的。此外，掺入大量的大多数非规范核苷酸如5-甲基尿苷、2-硫尿苷、5-甲基胞苷和N6-甲基腺苷可以降低RNA分子可以翻译成蛋白质的效率，限制含有这些核苷酸的RNA分子在需要蛋白质表达的应用中的效用。此外，虽然假尿苷可以完全取代RNA分子中的尿苷而不降低合成RNA分子可以翻译成蛋白质的效率，但在某些情况下，例如，当执行频繁的重复转染时，仅含腺苷、鸟苷、胞苷和假尿苷的合成RNA分子可以表现出过量的毒性。
现在已经发现，并且在一些实施方案中，本发明涉及含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置或在嘌呤的情况下在6C和/或 7N和/或8C位置包括一处或多处取代的一种或多种非规范核苷酸的 RNA分子的毒性可以低于仅含有规范核苷酸的合成RNA分子，部分地归因于这些位置的取代能够干扰由检测外源核酸的蛋白质识别合成RNA分子，并且此外，这些位置的取代对合成RNA分子可以翻译成蛋白质的效率影响最小，部分地归因于这些位置的取代不会干扰碱基-配对和碱基-堆叠相互作用。
在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置包括一处或多处取代的非规范核苷酸的实例包括但不限于：2-硫尿苷、5-氮杂尿苷、假尿苷、4-硫尿苷、5- 甲基尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基尿苷、5-氨基假尿苷、5-羟基尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲氧基假尿苷、5-羟甲基尿苷、5- 羟甲基假尿苷、5-羧基尿苷、5-羧基假尿苷、5-甲酰基尿苷、5-甲酰基假尿苷、5-甲基-5-氮杂尿苷、5-氨基-5-氮杂尿苷、5-羟基-5-氮杂尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷、5-羟基假尿苷、4-硫-5-氮杂尿苷、 4-硫假尿苷、4-硫-5-甲基尿苷、4-硫-5-氨基尿苷、4-硫-5-羟基尿苷、 4-硫-5-甲基-5-氮杂尿苷、4-硫-5-氨基-5-氮杂尿苷、4-硫-5-羟基-5-氮杂尿苷、4-硫-5-甲基假尿苷、4-硫-5-氨基假尿苷、4-硫-5-羟基假尿苷、 2-硫胞苷、5-氮杂胞苷、假异胞苷、N4-甲基胞苷、N4-氨基胞苷、N4- 羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-氨基胞苷、5-羟基胞苷、5-甲氧基胞苷、 5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-甲基-5-氮杂胞苷、5- 氨基-5-氮杂胞苷、5-羟基-5-氮杂胞苷、5-甲基假异胞苷、5-氨基假异胞苷、5-羟基假异胞苷、N4-甲基-5-氮杂胞苷、N4-甲基假异胞苷、2- 硫-5-氮杂胞苷、2-硫假异胞苷、2-硫-N4-甲基胞苷、2-硫-N4-氨基胞苷、2-硫-N4-羟基胞苷、2-硫-5-甲基胞苷、2-硫-5-氨基胞苷、2-硫-5- 羟基胞苷、2-硫-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫-5- 羟基-5-氮杂胞苷、2-硫-5-甲基假异胞苷、2-硫-5-氨基假异胞苷、2- 硫-5-羟基假异胞苷、2-硫-N4-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-甲基假异胞苷、N4-甲基-5-甲基胞苷、N4-甲基-5-氨基胞苷、N4-甲基-5-羟基胞苷、 N4-甲基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5- 羟基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-甲基假异胞苷、N4-甲基-5-氨基假异胞苷、N4-甲基-5-羟基假异胞苷、N4-氨基-5-氮杂胞苷、N4-氨基假异胞苷、N4-氨基-5-甲基胞苷、N4-氨基-5-氨基胞苷、N4-氨基-5-羟基胞苷、 N4-氨基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5- 羟基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-甲基假异胞苷、N4-氨基-5-氨基假异胞苷、N4-氨基-5-羟基假异胞苷、N4-羟基-5-氮杂胞苷、N4-羟基假异胞苷、N4-羟基-5-甲基胞苷、N4-羟基-5-氨基胞苷、N4-羟基-5-羟基胞苷、 N4-羟基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5- 羟基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-甲基假异胞苷、N4-羟基-5-氨基假异胞苷、N4-羟基-5-羟基假异胞苷、2-硫-N4-甲基-5-甲基胞苷、2-硫-N4- 甲基-5-氨基胞苷、2-硫-N4-甲基-5-羟基胞苷、2-硫-N4-甲基-5-甲基-5- 氮杂胞苷、2-硫-N4-甲基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-甲基-5-羟基-5- 氮杂胞苷、2-硫-N4-甲基-5-甲基假异胞苷、2-硫-N4-甲基-5-氨基假异胞苷、2-硫-N4-甲基-5-羟基假异胞苷、2-硫-N4-氨基-5-氮杂胞苷、2- 硫-N4-氨基假异胞苷、2-硫-N4-氨基-5-甲基胞苷、2-硫-N4-氨基-5-氨基胞苷、2-硫-N4-氨基-5-羟基胞苷、2-硫-N4-氨基-5-甲基-5-氮杂胞苷、 2-硫-N4-氨基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-氨基-5-羟基-5-氮杂胞苷、 2-硫-N4-氨基-5-甲基假异胞苷、2-硫-N4-氨基-5-氨基假异胞苷、2-硫 -N4-氨基-5-羟基假异胞苷、2-硫-N4-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-羟基假异胞苷、2-硫-N4-羟基-5-甲基胞苷、N4-羟基-5-氨基胞苷、2-硫-N4- 羟基-5-羟基胞苷、2-硫-N4-羟基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-羟基-5- 氨基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-羟基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-羟基-5- 甲基假异胞苷、2-硫-N4-羟基-5-氨基假异胞苷、2-硫-N4-羟基-5-羟基假异胞苷、N6-甲基腺苷、N6-氨基腺苷、N6-羟基腺苷、7-去氮腺苷、 8-氮杂腺苷、N6-甲基-7-去氮腺苷、N6-甲基-8-氮杂腺苷、7-去氮-8- 氮杂腺苷、N6-甲基-7-去氮-8-氮杂腺苷、N6-氨基-7-去氮腺苷、N6- 氨基-8-氮杂腺苷、N6-氨基-7-去氮-8-氮杂腺苷、N6-羟基腺苷、N6- 羟基-7-去氮腺苷、N6-羟基-8-氮杂腺苷、N6-羟基-7-去氮-8-氮杂腺苷、 6-硫鸟苷、7-去氮鸟苷、8-氮杂鸟苷、6-硫-7-去氮鸟苷、6-硫-8-氮杂鸟苷、7-去氮-8-氮杂鸟苷、6-硫-7-去氮-8-氮杂鸟苷和5-甲氧基尿苷。
在一些实施方案中，本发明涉及一种或多种非规范核苷酸，其选自5-羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-甲氧基胞苷、5-羟基尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羧基尿苷、5- 甲酰基尿苷、5-甲氧基尿苷、假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、 5-羟甲基假尿苷、5-羧基假尿苷、5-甲酰基假尿苷和5-甲氧基假尿苷。在一些实施方案中，至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少 65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少 90％、或至少95％、或100％的非规范核苷酸是5-羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-甲氧基胞苷、 5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-甲酰基尿苷、 5-甲氧基尿苷、假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-羟甲基假尿苷、5-羧基假尿苷、5-甲酰基假尿苷和5-甲氧基假尿苷中的一种或多种。
在一些实施方案中，至少约50％、或至少约55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或100％的胞苷残基是选自5-羟基胞苷、 5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-甲氧基胞苷的非规范核苷酸。
在一些实施方案中，至少约20％、或约30％、或约40％、或约 50％、或至少约55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或 100％的尿苷残基是选自5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-羟甲基尿苷、5- 羧基尿苷、5-甲酰基尿苷、5-甲氧基尿苷、假尿苷、5-羟基假尿苷、 5-甲基假尿苷、5-羟甲基假尿苷、5-羧基假尿苷、5-甲酰基假尿苷和 5-甲氧基假尿苷的非规范核苷酸。
在一些实施方案中，至少约10％(例如，10％、或约20％、或约 30％、或约40％、或约50％)的鸟苷残基是非规范核苷酸，并且所述非规范核苷酸任选地是7-去氮鸟苷。在一些实施方案中，RNA含有不超过约50％的代替鸟苷残基的7-去氮鸟嘌呤。
在一些实施方案中，RNA不含代替腺苷残基的非规范核苷酸。
注意到，针对某些非规范核苷酸存在替代的命名方案。例如，在某些情况下，5-甲基假尿苷可以称为“3-甲基假尿苷”或“N3-甲基假尿苷”或“1-甲基假尿苷”或“N1-甲基假尿苷”。
含有前缀“氨基”的核苷酸可以指含有与核苷酸的所述位置的原子键合的氮原子的任何核苷酸，例如，5-氨基胞苷可以指5-氨基胞苷、 5-甲基氨基胞苷和5-硝基胞苷。类似地，含有前缀“甲基”的核苷酸可以指含有与核苷酸的所述位置的原子键合的碳原子的任何核苷酸，例如，5-甲基胞苷可以指5-甲基胞苷、5-乙基胞苷和5-羟甲基胞苷，含有前缀“硫”的核苷酸可以指含有与核苷酸的给定位置的原子键合的硫原子的任何核苷酸，并且含有前缀“羟基”的核苷酸可以指含有与核苷酸的给定位置的原子键合的氧原子的任何核苷酸，例如，5-羟基尿苷可以指5-羟基尿苷和具有与氧原子键合的甲基的尿苷，其中氧原子与尿苷的5C位置的原子键合。
因此，某些实施方案涉及包含一种或多种非规范核苷酸的RNA，其中所述RNA分子含有一种或多种核苷酸，所述核苷酸在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置或在嘌呤的情况下在6C和/或7N 和/或8C位置包括一处或多处取代。其他实施方案涉及一种治疗剂，其中所述治疗剂含有一种或多种包含一种或多种非规范核苷酸的 RNA分子，并且其中包含一种或多种非规范核苷酸的一种或多种 RNA分子含有一种或多种核苷酸，所述核苷酸在嘧啶的情况下在2C 和/或4C和/或5C位置或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置包括一处或多处取代。在一个实施方案中，治疗剂包含转染试剂。在另一个实施方案中，转染试剂包含阳离子脂质、脂质体或胶束。在再另一个实施方案中，脂质体或胶束包含叶酸并且治疗组合物具有抗癌活性。在另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括以下各物中的至少一种：假尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-氨基尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-羟基假尿苷、 5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷、假异胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫胞苷、 5-氮杂胞苷、5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷、5-甲基假异胞苷、7-去氮腺苷、7-去氮鸟苷、6-硫鸟苷和6-硫-7-去氮鸟苷。在另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括假尿苷、2-硫尿苷、4- 硫尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-氨基尿苷、2-硫假尿苷、4-硫假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷和5-氨基假尿苷中的至少一种；和假异胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫胞苷、5-氮杂胞苷、 5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷和5-甲基假异胞苷中的至少一种。在另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括假尿苷、2- 硫尿苷、4-硫尿苷、5-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-氨基尿苷、2-硫假尿苷、4-硫假尿苷、5-羟基假尿苷和5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷中的至少一种；和假异胞苷、N4-甲基胞苷、2-硫胞苷、5- 氮杂胞苷、5-羟基胞苷、5-氨基胞苷、5-甲基胞苷、N4-甲基假异胞苷、 2-硫假异胞苷、5-羟基假异胞苷、5-氨基假异胞苷和5-甲基假异胞苷中的至少一种；和7-去氮鸟苷、6-硫鸟苷、6-硫-7-去氮鸟苷和5-甲氧基尿苷中的至少一种。在又另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：5-甲基胞苷和7-去氮鸟苷。在另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸还包括假尿苷或4-硫尿苷或5-甲基尿苷或5-氨基尿苷或4-硫假尿苷或5-甲基假尿苷或5-氨基假尿苷。在再另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸还包括7-去氮腺苷。在另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假异胞苷和7-去氮鸟苷以及4-硫尿苷。在又另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假异胞苷或7-去氮鸟苷和假尿苷。在再另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：5-甲基尿苷和5-甲基胞苷以及7-去氮鸟苷。在另一实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假尿苷或5-甲基假尿苷和5-甲基胞苷以及7-去氮鸟苷。在另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸包括：假异胞苷和7-去氮鸟苷以及假尿苷。在一个实施方案中，包含一种或多种非规范核苷酸的RNA存在于体内。
通过常用于体外转录的RNA聚合酶，某些非规范核苷酸可以比其他非规范核苷酸更高效地掺入RNA分子中，这部分地归因于这些某些非规范核苷酸倾向于参与标准碱基-配对相互作用和碱基-堆叠相互作用，并以与相应的规范核苷酸与RNA聚合酶相互作用的方式类似的方式与RNA聚合酶相互作用。结果，含有一种或多种非规范核苷酸的某些核苷酸混合物可能是有益的，这部分地因为含有这些核苷酸混合物的体外转录反应可以产生大量的RNA。因此，某些实施方案涉及一种核苷酸混合物，其含有在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置上或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置上包括一处或多处取代的一种或多种核苷酸。核苷酸混合物包括但不限于 (每种核苷酸之前的数字指示体外转录反应中非规范核苷酸三磷酸的示例性分数，例如，0.2假异胞苷是指含有腺苷-5'-三磷酸、鸟苷-5'-三磷酸、尿苷-5'-三磷酸、胞苷-5'-三磷酸和假异胞苷-5'-三磷酸的反应，其中假异胞苷-5'-三磷酸在所述反应中的存在量约等于反应中存在的假异胞苷-5'-三磷酸+胞苷-5'-三磷酸的总量的0.2倍，其中所述量以摩尔或质量为基础测量，并且其中核苷前的多于一个数字指示示例性分数的范围)：1.0假尿苷、0.1-0.82-硫尿苷、0.1-0.85-甲基尿苷、0.2-1.05-羟基尿苷、0.2-1.05-甲氧基尿苷、0.1-1.05-氨基尿苷、0.1-1.04-硫尿苷、 0.1-1.02-硫假尿苷、0.1-1.04-硫假尿苷、0.1-1.05-羟基假尿苷、0.2-15- 甲基假尿苷、0.2-1.05-甲氧基假尿苷、0.1-1.05-氨基假尿苷、0.2-1.02- 硫胞苷、0.1-0.8假异胞苷、0.2-1.05-甲基胞苷、0.2-1.05-羟基胞苷、 0.2-1.05-羟甲基胞苷、0.2-1.05-甲氧基胞苷、0.1-1.05-氨基胞苷、 0.2-1.0N4-甲基胞苷、0.2-1.05-甲基假异胞苷、0.2-1.05-羟基假异胞苷、 0.2-1.05-氨基假异胞苷、0.2-1.0N4-甲基假异胞苷、0.2-1.02-硫假异胞苷、0.2-1.07-去氮鸟苷、0.2-1.06-硫鸟苷、0.2-1.06-硫-7-去氮鸟苷、 0.2-1.08-氮杂鸟苷、0.2-1.07-去氮-8-氮杂鸟苷、0.2-1.06-硫-8-氮杂鸟苷、0.1-0.57-去氮腺苷和0.1-0.5N6-甲基腺苷。
在各个实施方案中，包含一种或多种非规范核苷酸组合物或合成多核苷酸组合物(例如，其可以通过体外转录制备)的RNA在具有腺嘌呤或遗传密码中的“A”的位置处大致上或完全含有规范核苷酸。在该上下文中，术语“大致上”是指至少90％。在这些实施方案中，RNA 组合物或合成的多核苷酸组合物可以在具有遗传密码中的“G”的位置以及相应的规范核苷酸“G”处进一步含有(例如，由其组成)7-去氮鸟苷，并且在具有G的位置处的规范核苷酸和非规范核苷酸可以在5:1 至1:5的范围内，或者在一些实施方案中在2:1至1:2的范围内。在这些实施方案中，RNA组合物或合成的多核苷酸组合物可以在具有遗传密码中的“C”的位置以及规范核苷酸“C”处进一步含有(例如，由其组成)5-羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-甲氧基胞苷中的一种或多种(例如，两种、三种或四种)，并且在具有C的位置处的规范核苷酸和非规范核苷酸可以在5:1至 1:5的范围内，或者在一些实施方案中，在2:1至1:2的范围内。在一些实施方案中，在“C”位置处的非规范核苷酸的水平如前段所述。在这些实施方案中，RNA组合物或合成的多核苷酸组合物可以在具有遗传密码中的“U”的位置以及规范核苷酸“U”处进一步含有(例如，由其组成)5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-甲酰基尿苷、5-甲氧基尿苷、假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、 5-羟甲基假尿苷、5-羧基假尿苷、5-甲酰基假尿苷和5-甲氧基假尿苷中的一种或多种(例如，两种、三种或四种)，并且在具有”U“的位置处的规范核苷酸和非规范核苷酸可以在5:1至1:5的范围内，或者在一些实施方案中，在2:1至1:2的范围内。在一些实施方案中，“U”位置处的非规范核苷酸的水平如前段所述。
现在已经发现，组合某些非规范核苷酸可能是有益的，这部分归因于非规范核苷酸对降低RNA分子的毒性的贡献可以累加。因此，某些实施方案涉及一种核苷酸混合物，其中所述苷酸混合物含有上面列出的非规范核苷酸中的多于一种，例如，核苷酸混合物含有假异胞苷和7-去氮鸟苷两者，或者核苷酸混合物含有N4-甲基胞苷和7-去氮鸟苷两者，等。在一个实施方案中，核苷酸混合物含有上面列出的非规范核苷酸中的多于一种，并且每种非规范核苷酸以上面列出的分数存在于混合物中，例如，核苷酸混合物含有0.1-0.8假异胞苷和 0.2-1.07-去氮鸟苷，或者核苷酸混合物含有0.2-1.0N4-甲基胞苷和 0.2-1.07-去氮鸟嘌呤，等。
在某些情况下，例如，当可能不需要或不希望最大化体外转录反应的收率时，可以使用除上面给出的那些之外的核苷酸分数。以上列出的示例性分数和分数的范围涉及具有典型纯度(大于90％纯度)的核苷酸-三磷酸溶液。通过使用更高纯度如大于约95％纯度、或大于约 98％纯度、或大于约99％纯度、或大于约99.5％纯度的核苷酸-三磷酸溶液，可以使用更大分数的这些和其他核苷酸，这可以例如通过使用现有的化学纯化技术如高压液相色谱(HPLC)或通过其他方法纯化核苷酸三磷酸溶液来实现。在一个实施方案中，纯化具有多种异构体的核苷酸以富集希望的异构体。
其他实施方案涉及一种通过使细胞与含有一种或多种非规范核苷酸的RNA分子接触在体内诱导细胞表达关注的蛋白质的方法，所述非规范核苷酸在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置包括一处或多处取代。再其他实施方案涉及一种通过使细胞与含有一种或多种非规范核苷酸的 RNA分子接触在体内转染、重新编程和/或基因编辑细胞的方法，所述非规范核苷酸在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置包括一处或多处取代。在一个实施方案中，RNA分子通过体外转录产生。在一个实施方案中， RNA分子编码一种或多种重新编程因子。在另一个实施方案中，所述一种或多种重新编程因子包括Oct4蛋白。在另一个实施方案中，还使细胞与编码Sox2蛋白的RNA分子接触。在又另一个实施方案中，还使细胞与编码Klf4蛋白的RNA分子接触。在又另一个实施方案中，还使细胞与编码c-Myc蛋白的RNA分子接触。在又另一个实施方案中，还使细胞编码Lin28蛋白的RNA分子接触。
诸如T7RNA聚合酶的酶可以优先在含有规范核苷酸和非规范核苷酸两者的体外转录反应中掺入规范核苷酸。因此，含有一定分数的非规范核苷酸的体外转录反应可以产生含有分数与反应中存在的非规范核苷酸的分数不同(通常更低)的非规范核苷酸的RNA。在某些实施方案中，提到核苷酸掺入分数(例如，“含有50％假异胞苷”或“0.1-0.8假异胞苷”的合成RNA分子)因此可以指含有所述分数的核苷酸的RNA分子和在含有所述分数的核苷酸(或核苷酸衍生物，例如核苷酸-三磷酸)的反应中合成的RNA分子，即使这样的反应可以产生含有分数与反应中所存在的非规范核苷酸的分数不同的核苷酸的 RNA。
不同的核苷酸序列可以通过利用替代密码子来编码相同的蛋白质。在某些实施方案中，提到核苷酸掺入分数因此可以是指含有所述分数的核苷酸的RNA分子和与不同RNA分子编码相同的蛋白质的 RNA分子，其中不同RNA分子含有所述分数的核苷酸。
某些实施方案涉及一种试剂盒，其含有实践本发明所需要的一种或多种材料。在一个实施方案中，所述试剂盒含有一种或多种合成 RNA分子。在一个实施方案中，试剂盒含有一种或多种编码一种或多种重新编程因子和/或基因编辑蛋白的合成RNA分子。在另一个实施方案中，所述一种或多种合成RNA分子含有一种或多种非规范核苷酸，所述非规范核苷酸在嘧啶的情况下在2C和/或4C和/或5C位置或在嘌呤的情况下在6C和/或7N和/或8C位置包括一处或多处取代。在另一个实施方案中，试剂盒包含以下中的一种或多种：转染培养基、转染试剂、复合培养基和基质溶液。在一个实施方案中，基质溶液含有纤连蛋白和/或玻连蛋白或重组纤连蛋白和/或重组玻连蛋白。在一个实施方案中，试剂盒的一种或多种组分作为多个等分试样存在。在一个实施方案中，试剂盒包含核酸转染-试剂复合物的等分试样。在另一个实施方案中，试剂盒包含核酸转染-试剂复合物等分试样，其以固体形式提供，例如，作为冷冻或冷冻干燥的丸粒提供。在又另一个实施方案中，试剂盒含有培养基的等分试样，其中每个等分试样含有通过化学处理或通过冷冻稳定化的转染试剂-核酸复合物。
通常转染且特别地重新编程可以是不同且耗时的技术，所述技术可以是重复的且易于出错。然而，这些技术由于缺乏自动的转染仪器而经常手动进行。因此，某些实施方案涉及一种可以以自动或半自动方式在体内转染、重新编程和/或基因编辑细胞的系统。
现在已经发现，5-甲基胞苷脱甲基化途径的非规范核苷酸成员在掺入合成RNA中时可以增加合成RNA可以在体内翻译成蛋白质的效率，并且可以降低合成RNA在体内的毒性。这些非规范核苷酸包括，例如：5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞苷和5-羧基胞苷(亦称“胞苷-5-羧酸”)。因此，某些实施方案涉及一种核酸。在一些实施方案中，所述核酸存在于体内。在一个实施方案中，核酸是合成的 RNA分子。在另一个实施方案中，核酸包含一种或多种非规范核苷酸。在一个实施方案中，核酸包含5-甲基胞苷脱甲基化途径的一种或多种非规范核苷酸成员。在另一个实施方案中，核酸包含以下中的至少一种：5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞苷和5-羧基胞苷或其衍生物。在另一个实施方案中，核酸包含以下中的至少一种：假尿苷、5-甲基假尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、N4-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷和7-去氮鸟苷或其衍生物。
5-甲基胞苷脱甲基化途径
某些实施方案涉及一种蛋白质。其他实施方案涉及一种编码蛋白质的核酸。在一个实施方案中，所述蛋白质为关注的蛋白质。在另一个实施方案中，所述蛋白质选自：重新编程蛋白和基因编辑蛋白。在一个实施方案中，所述核酸是质粒。在另一个实施方案中，核酸存在于病毒或病毒载体中。在另一个实施方案中，所述病毒或病毒载体是复制缺陷型的。在更另一个实施方案中，病毒或病毒载体是复制型的。在一个实施方案中，病毒或病毒载体包括以下中的至少一种：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或其天然或工程改造的变体和工程改造的病毒。
还发现，非规范核苷酸的某些组合在增加合成RNA可以在体内翻译成蛋白质的效率和降低合成RNA在体内的毒性方面特别有效，例如，以下组合：5-甲基尿苷和5-甲基胞苷；5-羟基尿苷和5-甲基胞苷；5-羟基尿苷和5-羟甲基胞苷；5-甲基尿苷和7-去氮鸟苷；5-甲基胞苷和7-去氮鸟苷；5-甲基尿苷、5-甲基胞苷和7-去氮鸟苷；和5- 甲基尿苷、5-羟甲基胞苷和7-去氮鸟苷。因此，某些实施方案涉及一种包含以下中的至少两种的核酸：5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷和7-去氮鸟苷或其一种或多种衍生物。其他实施方案涉及一种包含以下中的至少三种的核酸：5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷和7-去氮鸟苷或其一种或多种衍生物。其他实施方案涉及一种包含以下中的所有的核酸：5-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷和 7-去氮鸟苷或其一种或多种衍生物。在一个实施方案中，核酸包含一个或多个5-甲基尿苷残基、一个或多个5-甲基胞苷残基和一个或多个 7-去氮鸟苷残基，或一个或多个5-甲基尿苷残基、一个或多个5-羟甲基胞苷残基和一个或多个7-去氮鸟苷残基。
已经进一步发现，含有一定分数的某些非规范核苷酸及其组合的合成RNA分子可以在体内表现出特别高的翻译效率和低毒性。因此，某些实施方案涉及一种核酸，其包含以下中的至少一种：一个或多个尿苷残基、一个或多个胞苷残基和一个或多个鸟苷残基，并且包含一种或多种非规范核苷酸。在一个实施方案中，约20％和约80％之间的尿苷残基是5-甲基尿苷残基。在另一个实施方案中，约30％和约50％之间的尿苷残基是5-甲基尿苷残基。在另一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基。在一个实施方案中，约60％和约80％之间的胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在另一个实施方案中，约80％和约100％之间的胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在另一个实施方案中，约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在再另一个实施方案中，约 20％和约100％之间的胞苷残基是5-羟甲基胞苷残基。在一个实施方案中，约20％和约80％之间的鸟苷残基是7-去氮鸟苷残基。在另一个实施方案中，约40％和约60％之间的鸟苷残基是7-去氮鸟苷残基。在另一个实施方案中，约50％的鸟苷残基是7-去氮鸟苷残基。在一个实施方案中，约20％和约80％之间或约30％和约60％之间或约40％的胞苷残基是N4-甲基胞苷和/或N4-乙酰基胞苷残基。在另一个实施方案中，每个胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在另一个实施方案中，约 100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基和/或5-羟甲基胞苷残基和/或N4- 甲基胞苷残基和/或N4-乙酰基胞苷残基和/或其一种或多种衍生物。在再另一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基，约 20％和约100％之间的胞苷残基是N4-甲基胞苷和/或N4-乙酰基胞苷残基，且约50％的鸟苷残基是7-去氮鸟苷残基。在一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基，且约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在另一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基，且约50％的鸟苷残基是7-去氮鸟苷残基。在另一个实施方案中，约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基，且约50％的鸟苷残基是7-去氮鸟苷残基。在另一个实施方案中，约100％的尿苷残基是5-羟基尿苷残基。在一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基，约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基，且约50％的鸟苷残基是7-去氮鸟苷残基。在另一个实施方案中，约40％的尿苷残基是5-甲基尿苷残基，约20％和约100％之间的胞苷残基是5-羟甲基胞苷残基，且约 50％的鸟苷残基是7-去氮鸟苷残基。在一些实施方案中，小于约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基。在其他实施方案中，小于约100％的胞苷残基是5-羟甲基胞苷残基。在一个实施方案中，合成RNA分子中的每个尿苷残基是假尿苷残基或5-甲基假尿苷残基。在另一个实施方案中，约100％的尿苷残基是假尿苷残基和/或5-甲基假尿苷残基。在另一个实施方案中，约100％的尿苷残基是假尿苷残基和/或5-甲基假尿苷残基，约100％的胞苷残基是5-甲基胞苷残基，且约50％的鸟苷残基是7-去氮鸟苷残基。
可以用于代替5-甲基尿苷或与5-甲基尿苷组合的其他非规范核苷酸包括但不限于：假尿苷、5-羟基尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲氧基假尿苷、5-羧基尿苷、5-羧基假尿苷、5-甲酰基尿苷、 5-甲酰基假尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羟甲基假尿苷和5-甲基假尿苷(亦称“1-甲基假尿苷”，亦称“N1-甲基假尿苷”)或其一种或多种衍生物。可以用于代替5-甲基胞苷和/或5-羟甲基胞苷或与5-甲基胞苷和/或5- 羟甲基胞苷组合的其他非规范核苷酸包括但不限于：假异胞苷、5-甲基假异胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲氧基胞苷、N4-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷或其一种或多种衍生物。在某些实施方案中，例如，当仅执行单次转染、注射或递送时或当被转染、注射或递送至的细胞、组织、器官或患者对转染相关毒性或先天免疫信号传导不特别敏感时，可以减少非规范核苷酸的分数。减少非规范核苷酸的分数可能是有益的，这部分地归因于减少非规范核苷酸的分数可以降低核酸的成本。在某些情况下，例如，当希望核酸最小的免疫原性时，可以增加非规范核苷酸的分数。
诸如T7RNA聚合酶的酶可以优先在含有规范核苷酸和非规范核苷酸的体外转录反应中掺入规范核苷酸。因此，含有一定分数的非规范核苷酸的体外转录反应可以产生含有分数与反应中存在的非规范核苷酸的分数不同(通常更低)的非规范核苷酸的RNA。在某些实施方案中，提到核苷酸掺入分数(例如，“50％5-甲基尿苷”)因此可以指含有所述分数的核苷酸的核酸和在含有所述分数的核苷酸(或核苷酸衍生物，例如核苷酸-三磷酸)的反应中合成的核酸，即使这样的反应可以产生含有分数与反应中所存在的非规范核苷酸的分数不同的核苷酸的核酸。此外，不同的核苷酸序列可以通过利用替代密码子来编码相同的蛋白质。在某些实施方案中，提到核苷酸掺入分数因此可以指含有所述分数的核苷酸的核酸和与不同核酸编码相同的蛋白质的核酸，其中不同核酸含有所述分数的核苷酸。
某些实施方案涉及一种包含选自Cap 0、Cap 1、Cap 2和Cap 3 的5'-帽结构的核酸或其衍生物。在一个实施方案中，核酸包含一种或多种UTR。在另一个实施方案中，所述一种或多种UTR增加核酸的稳定性。在另一个实施方案中，一种或多种UTR包括α-珠蛋白或β-珠蛋白5'-UTR。在再另一个实施方案中，一种或多种UTR包括α- 珠蛋白或β-珠蛋白3'-UTR。在再另一个实施方案中，合成RNA分子包含α-珠蛋白或β-珠蛋白5'-UTR和α-珠蛋白或β-珠蛋白3'-UTR。在一个实施方案中，5'-UTR包含与Kozak共有序列大致上类似的Kozak 序列。在另一个实施方案中，核酸包含3'-聚(A)尾。在另一个实施方案中，3'-聚(A)尾的长度为在约20nt和约250nt之间或在约120nt 和约150nt之间。在另一个实施方案中，3'-聚(A)尾的长度为约20nt、或约30nt、或约40nt、或约50nt、或约60nt、或约70nt、或约80nt、或约90nt、或约100nt、或约110nt、或约120nt、或约130nt、或约140nt、或约150nt、或约160nt、或约170nt、或约180nt、或约 190nt、或约200nt、或约210nt、或约220nt、或约230nt、或约240nt、或约250nt。
某些实施方案涉及制备核酸药物(包括包含一种或多种非规范核苷酸的RNA)方法。这类方法产生大致上稳定的RNA。
在各个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗、预防或减轻疾病、病症和/或病况的方法中。例如，在一些实施方案中，包括各种有效剂量、施用策略和制剂的所描述的体内递送方法用于治疗方法中。
在各个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于更改、改进和 /或改变组织(例如，美容上)的方法。
在各个实施方案中，本发明的方法和组合物包括在本文所述的疾病、病症和/或病况的诊断、治疗、预防或减轻中使用核酸药物(包括合成RNA)。在各个实施方案中，本发明的方法和组合物包括在组织的更改、改进和/或改变(例如，美容上)中使用核酸药物(包括合成 RNA)。
一般而言，在各个实施方案中，如本文所述的合成RNA以本文所述的特定剂量施用到人，并且合成RNA包含序列，所述序列有时称为编码关注的蛋白的靶序列，所述蛋白可以是治疗性蛋白。
仅包含规范核苷酸的合成RNA可以与模式识别受体结合，可以被识别为病原体相关的分子模式，并且可以在细胞中触发有效的免疫应答，这可以导致翻译阻断、炎性细胞因子分泌和细胞死亡。现在已经发现，包含某些非规范核苷酸的合成RNA可以逃避先天免疫系统的检测，并且可以以高效翻译成蛋白质(包括在人中)。已经进一步发现合成RNA包含至少一种本文所述的非规范核苷酸，所述非规范核苷酸包括例如以下组的成员：5-甲基胞苷、5-羟基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-甲氧基胞苷、假尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-甲氧基尿苷、5- 甲酰基尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-羟甲基假尿苷、5-羧基尿苷、5-甲氧基假尿苷和5-甲酰基假尿苷，可以逃避先天免疫系统的检测，并且可以以高效翻译成蛋白质(包括在人中)。因此，某些实施方案涉及一种用于诱导细胞表达关注的蛋白质的方法，其包括使细胞与合成RNA接触。其他实施方案涉及一种用合成RNA转染细胞的方法，其包括使细胞与包含一种或多种合成RNA分子的溶液接触。再其他实施方案涉及一种用于治疗患者的方法，其包括向所述患者施用合成RNA。在一个实施方案中，所述合成RNA包含至少一种本文所述的非规范核苷酸，所述非规范核苷酸包括例如以下组的成员：5-甲基胞苷、5-羟基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-甲氧基胞苷、假尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲酰基尿苷、5-羟基假尿苷、 5-甲基假尿苷、5-羟甲基假尿苷、5-羧基尿苷、5-甲氧基假尿苷和5- 甲酰基假尿苷。在另一个实施方案中，合成RNA编码关注的蛋白质。示例性RNA可以含有如本文其他地方所述的规范核苷酸和非规范核苷酸的组合和水平，包括关于本文所述的任何关注的蛋白质的表达。在又另一个实施方案中，所述方法引起关注的蛋白质的表达。在另一个实施方案中，所述方法引起关注的蛋白质在患者皮肤中表达。
其他实施方案涉及一种用于在体内将核酸递送到细胞的方法。再其他实施方案涉及一种用于体内诱导细胞表达多种关注的蛋白质的方法。再其他实施方案涉及一种用于治疗患者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括破坏角质层。在另一个实施方案中，所述方法包括使细胞与核酸接触。在又另一个实施方案中，所述方法使得细胞内化核酸。在另一个实施方案中，所述方法产生表达关注的蛋白质的细胞。在再另一个实施方案中，所述方法引起关注的蛋白质在患者中表达。在再另一个实施方案中，所述方法引起患者症状中的一种或多种减轻。在再另一个实施方案中，患者需要关注的蛋白质。在再另一个实施方案中，患者缺乏关注的蛋白质。
再其他实施方案涉及一种用于治疗患者的方法，其包括向患者递送组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白。在另一个实施方案中，组合物包含一种或多种核酸分子。在又另一个实施方案中，所述一种或多种核酸分子中的至少一种编码关注的蛋白质。在一个实施方案中，所述方法引起蛋白质在患者皮肤中表达。在另一个实施方案中，所述方法引起治疗或美容有效量的关注的蛋白质在患者中表达。在又另一个实施方案中，所述方法包括施用类固醇。在另一个实施方案中，类固醇是以下组的成员：氢化可的松和地塞米松。
一些实施方案涉及治疗组合物和/或治疗方法，其包含编码一种或多种蛋白质的核酸分子，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种是细胞外基质蛋白质。再其他实施方案涉及一种美容组合物，其包含编码一种或多种蛋白质的核酸分子，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种是细胞外基质蛋白质。
色素沉着病症可以引起患者的严重症状。现在已经发现，色素沉着病症可以通过向患者递送编码酪氨酸酶的核酸来治疗。因此，某些实施方案涉及一种用于治疗色素沉着病症的方法。其他实施方案涉及一种用于更改患者的色素沉着的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码酪氨酸酶的核酸。其他实施方案涉及一种包含编码酪氨酸酶的核酸的美容组合物。再其他实施方案涉及一种包含编码酪氨酸酶的核酸的治疗组合物。再其他实施方案涉及一种用于增加患者皮肤的紫外线吸收的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码酪氨酸酶的核酸。在另一个实施方案中，所述方法引起患者皮肤的紫外线吸收增加。再其他实施方案涉及一种用于减少人皮肤在暴露于紫外光后的光损伤的方法。在一个实施方案中，所述方法引起人皮肤在暴露于紫外光后的光损伤减少。再其他实施方案涉及一种用于治疗着色性干皮病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码酪氨酸酶的核酸。再其他实施方案涉及一种用于治疗大疱性表皮松解症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码角蛋白5、角蛋白14、凝集素、整联蛋白家族成员、层粘连蛋白、层粘连蛋白亚基、胶原蛋白XVII、胶原VII或其生物活性片段、变体、类似物或其家族成员中的一种或多种的核酸。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码VII型胶原蛋白的核酸。在另一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码黑皮质素1受体的核酸。再其他实施方案涉及一种用于治疗干燥病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码透明质酸合酶的核酸。在另一个实施方案中，患者被诊断患有特应性皮炎。在又另一个实施方案中，患者被诊断患有鱼鳞病。某些实施方案涉及一种用于治疗美容病况的方法。其他实施方案涉及一种用于诱导组织愈合的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者递送编码透明质酸合酶的核酸。在另一个实施方案中，所述美容病况是以下组的成员：皱纹、皮肤下垂、皮肤变薄、变色和干燥皮肤。在又另一个实施方案中，患者已经进行白内障手术。在一些实施方案中，核酸是合成RNA。在其他实施方案中，所述方法引起患者症状中的一种或多种减轻。其他实施方案涉及一种通过向细胞或患者递送编码蛋白质或肽的核酸来治疗适应症的方法。再其他实施方案涉及一种包含编码蛋白质或肽的核酸的组合物。可以使用本发明的方法和组合物治疗的适应症和可以由本发明的组合物编码的蛋白质和肽在表2A和/或表2B中列出，并且通过举例而不是作为限制给出。在一个实施方案中，所述适应症选自表2A和/或表 2B。在另一个实施方案中，蛋白质或肽选自表2A和/或表2B。在又另一个实施方案中，所述适应症和蛋白质或肽选自表2A和/或表2B 的同一行。在另一个实施方案中，关注的蛋白质是以下组的成员： UCP1、UCP2和UCP3。其他实施方案涉及用于诱导细胞表达多种关注的蛋白质的方法。在一个实施方案中，关注的蛋白质包括以下组的至少两个成员：脂肪酶、UCP1、UCP2和UCP3。在另一个实施方案中，关注的蛋白质包括脂肪酶和以下组的成员：UCP1、UCP2和UCP3。在另一个实施方案中，蛋白质是基因编辑蛋白。在又另一个实施方案中，基因编辑蛋白靶向至少部分地负责疾病表型的基因。在又另一个实施方案中，基因编辑蛋白靶向编码选自表2A和/或表2B的蛋白质的基因。在再另一个实施方案中，基因编辑蛋白单独或与一种或多种其他分子或基因编辑蛋白组合校正或消除至少部分地负责疾病表型的突变。
在各个实施方案中，本发明预期靶向表2A和/或表2B中公开的任何蛋白质的前体形式和/或成熟形式和/或同种型和/或突变体以及这类蛋白质。在一些实施方案中，相对于相应的野生型蛋白质，任何前体形式和/或成熟形式和/或同种型和/或突变体都具有增强的分泌。在一些实施方案中，任何前体形式和/或成熟形式和/或同种型和/或突变体具有更改的半衰期(例如，血清、血浆、细胞内)-例如，更长或更短的半衰期。在一些实施方案中，这相对于野生型而言。
表2A.说明性适应症
本发明的额外说明性目标包括国际专利公开号WO 2013/151671 的表6中列出的化妆品目标，其内容以引用的方式整体并入本文。
在各个实施方案中，本发明的剂用于影响人的外皮系统的方法中。本发明的组合物和方法可以用以更改生物和/或生理过程，以例如减少皮肤下垂；增加皮肤厚度；增加皮肤容量；减少皱纹数目、皱纹长度和/或皱纹深度；增加皮肤紧致、坚挺、色调和/或弹性；增加皮肤水合和保湿力、水量和渗透平衡；增加皮肤脂质水平；增加胞外基质和/或粘附和通信多肽；增加皮肤能量产生；利用和保持；改善氧利用；改善皮肤细胞寿命；改善皮肤细胞免疫防御、热休克应激应答、抗氧化剂防御能力以中和自由基和/或毒性防御；改善紫外线的保护和恢复；改善皮肤细胞通讯和皮肤细胞神经支配；改善细胞凝聚力/粘附力；改善钙矿物质及其他矿物质代谢；改善细胞周转；以及改善细胞昼夜节律。
更进一步，在一些实施方案中，本发明的组合物可以用于治疗、控制或预防疾病、病症和/或病况，和/或可以更改、改进或改变罹患诸如但不限于以下的疾病、病症和/或病况的受试者的外皮系统的成员的外观：寻常型痤疮、夏季痤疮、聚合性痤疮、化妆品痤疮、暴发性痤疮、颈项部瘢痕性痤疮、机械性痤疮、药物性痤疮、粟粒坏死性痤疮、坏死性痤疮、红斑痤疮、光化性角化病、寻常型痤疮、夏季痤疮、聚合性痤疮、美容性痤疮、暴发性痤疮、颈项部瘢痕性痤疮、机械性痤疮、药物性痤疮、粟粒坏死性痤疮、坏死性痤疮、红斑痤疮、急性荨麻疹、过敏性接触性皮炎、斑形脱发、血管性水肿、脚癣、特应性皮炎、自体湿疹、婴儿痤疮、秃顶、bastomycosis、黑头、胎记和其他皮肤色素沉着问题、疔疮、跌打损伤、蚊虫叮咬、烧伤、蜂窝组织炎、恙螨、氯痤疮、胆碱能或应力荨麻疹、慢性荨麻疹、冷型荨麻疹、融合性网状乳头状瘤病、鸡眼、囊肿、头皮屑、疱疹样皮炎、皮肤划痕症、汗疱湿疹、尿布疹、皮肤干燥、出汗障碍、外胚层发育不良如少汗性外胚层发育不良和X-连锁的少汗性外胚层发育不良、湿疹、疣状表皮发育不全(epidermaodysplasia verruciformis)、结节性红斑、剥脱性痤疮、运动诱发的过敏性毛囊炎、多余的皮肤油、毛囊炎、雀斑、冻伤、真菌指甲、头发密度、头发生长速度、卤素痤疮、脱发、热疹、血肿、单纯疱疹感染(例如，非生殖器)、化脓性汗腺炎、荨麻疹、多汗症、色素沉着过度、少汗性外胚层发育不良、色素沉着不足、脓疱病、毛发内生、热型荨麻疹、嵌甲、婴儿痤疮或新生儿痤疮、瘙痒、刺激性接触性皮炎、股癣、瘢痕瘤、角化糠疹、扁平苔癣、硬化性苔藓、面部播散性粟粒状狼疮、黄褐斑、痣、传染性软疣、指甲的生长速度、指甲的健康、神经性皮炎、钱币状湿疹、职业性痤疮、油性痤疮、灰指甲、物理荨麻疹、藏毛囊肿、玫瑰糠疹、花斑糠疹、接触毒漆引起的皮疹、润发油痤疮、须部假性毛囊炎或颈项部瘢痕性痤疮、牛皮癣、牛皮癣关节炎、压力或延迟压力荨麻疹、刺伤如割伤和擦伤、皮疹、罕见或水型荨麻疹、隆鼻、癣、红斑痤疮、罗思蒙德 -汤姆森综合征(rothmund-thomsonsyndrome)、皮肤松弛、疥疮、疤痕、皮脂溢、脂溢性皮炎、带状疱疹、皮肤癌、皮肤下垂、太阳能型荨麻疹、蜘蛛咬伤、妊娠纹、晒伤、焦油痤疮、热带痤疮、皮肤变薄、鹅口疮、花斑癣、短暂性棘层松解性皮肤病、大亨帽或坏死性粟粒痤疮、肤色不均、静脉曲张、静脉湿疹、振动血管性水肿、白癜风、疣、韦伯-克里斯蒂安病(Weber-Christian disease)、皱纹、x-连锁的少汗性外胚层发育不良、干燥性湿疹、酵母菌感染和一般衰老迹象。
在一些实施方案中，提供用本发明的组合物治疗、控制或预防皮肤干燥的方法。在一些实施方案中，丝聚蛋白原(一种转化为丝聚蛋白的蛋白质)是关注的蛋白质(例如，当治疗寻常型鱼鳞病时)。
在一些实施方案中，提供治疗、控制或预防各种类型的牛皮癣(例如，瘟疫牛皮癣、滴状牛皮癣、脓疱性牛皮癣、反向牛皮癣和红皮病型牛皮癣)中的任何一种的方法。在各个实施方案中，关注的蛋白质是牛皮癣易感性1至9的基因的任何产物(PSORSI-PSORS9)。
各个实施方案涉及治疗、控制或预防湿疹(例如，特应性皮炎、钱币性湿疹、汗疱性湿疹、脂溢性皮炎、刺激性接触性皮炎、过敏性接触性皮炎、汗疱疹、静脉性湿疹、疱疹性皮炎、神经性皮炎、自体热化和干燥性湿疹)，并且可以任选地靶向以下中的一种或多种：丝聚蛋白；三遗传性变异体、卵细胞样1(OVOL1)、肌动蛋白样9(ACTL9) 和与湿疹相关的驱动蛋白家族成员3A(KIF3A)；以及基因脑源性神经营养因子(BDNF)和速激肽前体1(TAC1)。
麻疹(Hives)或荨麻疹(urticaria)，包括但不限于急性荨麻疹、慢性荨麻疹和血管性水肿、物理荨麻疹、压力或延迟压力荨麻疹、胆碱能或应力荨麻疹、冷型荨麻疹、热型荨麻疹、太阳能型荨麻疹、罕见或水型荨麻疹、振动性血管性水肿、运动诱发的过敏症和皮肤划痕症，可以通过例如靶向PLCG-2用本发明的组合物治疗。
各个实施方案涉及红斑痤疮的治疗、控制或预防，所述红斑痤疮包括但不限于红细胞乙状结肠红斑痤疮、丘疹脓疱性红斑痤疮、酒渣鼻和眼红斑痤疮。任选地，抗菌肽抗微生物肽(CAMP)和/或激肽释放酶相关的肽酶5(也称为角质层胰蛋白酶(SCTE))是关注的蛋白质。
在一些实施方案中，提供用本发明的组合物治疗、控制或预防痤疮的方法。例如，痤疮可以包括但不限于痤疮样疹、夏季痤疮、聚合性痤疮、化妆品痤疮、暴发性痤疮、颈项部瘢痕性痤疮、机械性痤疮、药物性痤疮、粟粒坏死性痤疮、坏死性痤疮、红斑痤疮、婴儿痤疮、黑头、氯痤疮、剥脱性痤疮、卤素痤疮、婴儿痤疮或新生儿痤疮、面部播散粟粒状狼疮、职业性痤疮、油性痤疮、润发性痤疮、焦油痤疮、热带痤疮、大亨帽或坏死性粟粒痤疮、须部假性毛囊炎或颈项部瘢痕性痤疮和化脓性汗腺炎。在这些实施方案中，关注的蛋白质可以是一种或多种基质金属蛋白酶(MMP)，例如基质金属蛋白酶-1(MMP-1或间质胶原酶)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶-13 (MMP-13)。
在另外的实施方案中，用本发明的组合物治疗白癜风，例如，其中靶向NLR家族，含有1个基因(NALP1)基因的热蛋白结构域。
在一些实施方案中，本发明的组合物可用于例如经由外异蛋白A 基因(EDA)、受体(EDAR)和受体相关死亡结构域(EDARADD)治疗、控制或预防少汗性外胚层发育不良(HED)。
在一些实施方案中，本发明的组合物可用于治疗、控制或预防秃顶或头发稀疏(例如，男性型秃发或雄性激素性脱发(AGA))，并且任选地，以下的一种或多种可以是关注的蛋白质：雄性激素受体(AR)、外异蛋白A2受体(EDA2R)和溶血磷脂酸受体6(P2RY5)。
本发明的组合物还可用于例如经由胶原蛋白、核糖体s6激酶、分泌的磷蛋白1(也称为骨桥蛋白)或转化生长因子β3治疗、控制或预防疤痕和妊娠纹(皮纹)的方法。
疣状表皮发育不良(也称为卢茨-莱万多夫斯基表皮发育不良 (Lutz-Lewandowsky epidermodysplasia))，是一种罕见的常染色体隐性基因遗传性皮肤病，也可以用本发明的组合物例如通过靶向跨膜通道样6(EVER1)或跨膜通道样8(EVER2)基因治疗。
在一些实施方案中，皮肤下垂、变薄或起皱可以用本发明的组合物例如通过靶向关注的蛋白质如胶原蛋白、弹性蛋白、成纤维细胞生长因子7、TIMP金属肽酶抑制剂、基质金属肽酶、超氧化物歧化酶和其他细胞外基质蛋白和蛋白多糖中的一种或多种治疗、控制或预防。
另外的实施方案诸如经由促黑素细胞刺激激素和/或促阿黑皮素原用于皮肤晒黑。
在一些实施方案中，本发明的组合物可以用于伤口治疗。在一些实施方案中，用本发的明组合物治疗、控制或预防伤口的方法包括额外的步骤，例如清洁伤口床以促进伤口愈合和闭合，包括但不限于：清创、急剧清创(自伤口手术切除死亡或感染的组织)，任选地包括化学清创剂如酶，以去除坏死组织；伤口敷料，为伤口提供湿润温暖的环境并且促进组织修复和愈合(例如，包含水凝胶(例如，AQUASORB； DUODERM)、水胶体(例如，AQUACEL；COMFEEL)、泡沫(例如， LYOFOAM；SPYROSORB)的伤口敷料)和藻酸盐(例如，ALGISITE；CURASORB)；施用生长因子以刺激细胞分裂和增殖并促进伤口愈合，例如贝卡普勒明(becaplermin)；和(iv)可能需要软组织伤口覆盖、皮肤移植以实现清洁未愈合伤口(例如，自体皮肤移植物、尸体皮肤移植物、生物工程改造的皮肤替代物(例如，APLIGRAF；DERMAGRAFT)的覆盖)。
在各个实施方案中，本文所述的核酸药物可以用于各种美容/整形外科工序，包括但不限于涉及皮肤移植和美学或美容手术的外科工序(例如，面部整形外科工序，包括但不限于眼睑成形术、鼻整形术、除皱术、颏成形术、面部植入物、耳廓成形术、毛发植入术、唇裂和腭裂修复术和/或身体整形外科工序，包括但不限于腹部整形术、腕关节成形术、大腿抬高术、乳房缩小术、隆乳术、体形塑造、吸脂、手部手术)。
在各个实施方案中，用本发明的组合物治疗、控制或预防多种癌症(例如，结肠直肠癌、胆囊癌、肺癌、胰腺癌和胃癌)。在一些实施方案中，用本发明的组合物治疗皮肤癌。例如，皮肤癌是光化性角化病、基底细胞癌、黑素瘤、卡波西氏肉瘤和鳞状细胞癌中的一种或多种。在一些实施方案中，本发明的组合物用于辅助完成周向边缘和深边缘评估、莫氏手术(Mohs surgery)、放射(例如，外部束放射疗法或近距离放射疗法)、化学疗法(包括但不限于局部化学疗法，例如用咪喹莫特(imiquimod)或5-氟尿嘧啶)以及冷冻疗法。本发明的组合物还可用于治疗各种分期的癌症，包括皮肤癌(例如，基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(SCC)和黑素瘤)，诸如美国癌症联合委员会(AJCC)TNM 系统的分期(例如TX、TO、Tis、T1、T1a、T1b、T2、T2A、T2B、 T3、T3a、T3b、T4、T4a、T4b、NX、NO、N1、N2、N3、MO、M1a、 M1b、M1c中的一个或多个)和/或分期系统的分期(例如，0期、IA期、 IB期、IIA期、IIB期、IIC期、IIIA期、IIIB期、IIIC期、IV期)。
本发明的说明性癌症和/或肿瘤包括但不限于基底细胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌；消化系统的癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内肿瘤；肾癌或肾脏癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统的癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统的癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/卵泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴细胞性NHL；高级小型非裂解细胞NHL；巨大肿块NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；以及其他癌和肉瘤；以及移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)，以及与瘢痣病、水肿(诸如与脑肿瘤相关的水肿) 和梅格斯氏综合征(Meigs'syndrome)相关的异常血管增生。
在各个实施方案中，用本发明的组合物治疗、控制或预防一种或多种罕见疾病，所述疾病包括例如红细胞生成性原卟啉病、海莉-海莉病(Hailey-Hailey Disease)、大疱性表皮松解症(EB)、着色性干皮病、埃勒斯-当洛斯综合征、皮肤松弛症、蛋白质C和蛋白质S缺乏症、奥尔波特综合征、条纹掌跖角化病、致死性皮肤棘层松解EB、弹性纤维假黄瘤(PXE)、寻常型鱼鳞病、寻常型天疱疮和基底细胞痣综合征。
在各个实施方案中，本发明的组合物用于治疗、控制或预防一种或多种炎性疾病或病况，诸如炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸系统疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、感染性休克、类风湿性关节炎、炎性肠病、炎性盆腔疾病、疼痛、眼部炎性疾病、乳糜泻、莱氏综合征(Leigh Syndrome)、甘油激酶缺乏症、家族性嗜酸性粒细胞增多症(FE)、常染色体隐性痉挛性共济失调、喉部炎症、肺结核、慢性胆囊炎、支气管扩张、矽肺病和其他尘肺病。
在各个实施方案中，本发明的组合物用于治疗、控制或预防一种或多种自体免疫疾病或病况，诸如多发性硬化、糖尿病、狼疮、乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、硬皮病、古德帕斯丘氏综合征(Goodpasture'ssyndrome)、韦格纳氏肉芽肿病、自体免疫性癫痫、拉斯穆森氏脑炎(Rasmussen'sencephalitis)、原发性胆汁硬化、硬化性胆管炎、自体免疫性肝炎、艾迪生氏病(Addison'sdisease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、纤维肌痛、麦涅氏综合征(Menier's syndrome)；移植排斥 (例如，预防同种异体移植物排斥)恶性贫血、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合征、红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、赖特氏综合征(Reiter's syndrome)、格雷夫氏病(Grave's disease) 和其他自体免疫疾病。
在各个实施方案中，本发明的组合物用于治疗、控制或预防一种或多种神经系统疾病，包括ADHD、AIDS-神经系统并发症、缺乏透明隔膜、获得性癫痫性失语症、急性播散性脑脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不全、失认症、艾卡迪综合征(AicardiSyndrome)、亚历山大病(Alexander Disease)、阿尔佩斯氏病(Alpers' Disease)、交替性偏瘫、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化、无脑畸形、动脉瘤、安格尔曼综合征(AngelmanSyndrome)、血管瘤病、缺氧症、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、阿诺德-基亚里畸形(Arnold-Chiari Malformation)、动静脉畸形、阿司帕坦(Aspartame)、阿斯伯格综合征(Asperger Syndrome)、共济失调毛细血管扩张、共济失调、注意力不足-机能亢进病症、孤独症、自治性功能障碍、背痛、巴斯综合征(Barth Syndrome)、贝敦氏症(Batten Disease)、白塞氏病 (Behcet's Disease)、贝尔氏麻痹(Bell's Palsy)、良性原发性眼睑痉挛症、良性病灶性肌肉萎缩、良性颅内高压、伯-罗二氏综合征 (Bernhardt-Roth Syndrome)、宾斯万格氏病、眼睑痉挛、布洛氏-苏兹伯格综合征(Bloch-Sulzberger Syndrome)、臂丛神经损伤、臂丛损伤、布拉德伯里-埃格尔斯顿综合征(Bradbury-Eggleston Syndrome)、颅内小动脉瘤、脑损伤、脑和脊椎肿瘤、布朗-色夸综合征(Brown-Sequard Syndrome)、延髓肌肉萎缩、卡纳万病(Canavan Disease)、腕管综合征、灼性神经痛、海绵状瘤、海绵形痣、海绵状静脉畸形、中央颈髓综合征、脊髓中央损伤综合征、中枢疼痛综合征、头部病症、小脑变性、小脑发育不全、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、脑地方性多神经炎、大脑性脚气病、大脑性巨人症、脑组织缺氧、大脑性麻痹、大脑-眼- 面部-骨骼综合征、腓骨肌萎缩症、小脑扁桃体下疝畸形、舞蹈病、舞蹈病棘红细胞增多症、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病(CIDP)、慢性体位性不耐症、慢性疼痛、II型科凯恩综合征(Cockayne Syndrome Type II)、Coffin Lowry综合征、包括持久植物状态的昏迷、复合区域疼痛综合征、先天性两侧面瘫、先天性肌无力、先天性肌病、先天性海绵状静脉畸形、皮质基底核变性、颅动脉炎、颅骨缝早闭、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、累积性创伤病症、库兴氏综合征(Cushing'sSyndrome)、巨细胞包涵体病(CIBD)、巨细胞病毒感染、舞蹈眼睛-舞蹈足综合征、丹迪-沃克综合征(Dandy-Walker Syndrome)、道森病(Dawson Disease)、De Morsier综合征、德杰伦-克隆普克麻痹(Dejerine-Klumpke Palsy)、多梗塞性痴呆、皮质下痴呆、路易体痴呆、皮肌炎、发展性运用障碍、德维克氏综合征(Devic's Syndrome)、糖尿病性神经病变、弥漫性硬化、德拉韦氏综合征(Dravet's Syndrome)、家族性性自主神经机能异常、书写困难、诵读困难、吞咽困难、运用障碍、张力障碍、早期婴儿癫痫性脑病、空蝶鞍综合征 (Empty SellaSyndrome)、埃科诺莫氏病(Encephalitis Lethargica)、脑炎和脑膜炎、脑膨出、脑病、脑三叉神经血管瘤病、癫痫、埃尔布氏麻痹(Erb's Palsy)、埃尔布-杜兴和德杰伦-克隆普克麻痹(Erb-Duchenne and Dejerine-Klumpke Palsies)、法布瑞病、华尔思氏综合征(Fahr'sSyndrome)、晕厥、家族性自主神经机能异常、家族性血管瘤、家族性特发性基底神经节钙化、家族性痉挛性麻痹、发热性痉挛(例如， GEFS和GEFS+)、费舍尔综合征、松软婴儿综合征、戈谢病(Gaucher's Disease)、格斯特曼氏综合征(Gerstmann's Syndrome)、格-施-沙综合征 (Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease)巨细胞动脉炎、巨细胞性包涵体病、球样细胞性脑白质营养不良、舌咽神经痛、格林-巴利综合征 (Guillain-BarreSyndrome)、HTLV-1相关脊髓病、哈勒沃登-施帕茨病 (Hallervorden-Spatz Disease)、头部伤害、头痛、连续性偏头痛、半面痉挛、交替性偏瘫(Hemiplegia Alterans)、遗传性神经病、遗传性痉孪性截瘫、雷弗素姆氏病(Heredopathia Atactica Polyneuritiformis)、耳带状疱疹、带状疱疹、平山综合征(Hirayama Syndrome)、前脑无裂畸形、亨廷顿氏病、积水性无脑畸形、常压脑积水、脑积水、脊髓积水、皮质醇过多症、嗜睡、张力过高、张力过低、缺氧症、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿肌张力过低、婴儿植烷酸贮积病、婴儿雷夫叙姆病、婴儿痉挛症、发性肌病、肠原性脂肪代谢障碍、颅内囊肿、颅内高压、艾萨克氏综合征(Isaac's Syndrome)、朱伯特综合征(Joubert Syndrome)、卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre Syndrome)、肯尼迪氏病(Kennedy's Disease)、金斯伯恩综合征(Kinsbourne syndrome)、克-列二氏综合征(Kleine-Levin syndrome)、克利佩尔综合征(Klippel Feil Syndrome)、静脉畸形骨肥大综合征 (Klippel-Trenaunay Syndrome，KTS)、库律-布西综合征(Kluver-Bucy Syndrome)、健忘失忆综合征(Korsakoffs AmnesicSyndrome)、克拉伯病(Krabbe Disease)、库格尔贝格-韦兰德病(Kugelberg-WelanderDisease)、库鲁病、朗伯-伊顿类重症肌无力综合征(Lambert-Eaton MyasthenicSyndrome)、获得性失语性癫痫综合征(Landau-Kleffner Syndrome)、股外侧皮神经截留、侧髓综合征、学习能力缺失、利氏病(Leigh's Disease)、林-戈二氏综合征(Lennox-Gastaut Syndrome)、莱施-尼汉综合征(Lesch-Nyhan Syndrome)、脑白质病变、莱文-奎奇立综合征(Levine-Critchley Syndrome)、路易体痴呆、无脑回症、闭锁综合征、卢格里克氏病(Lou Gehrig's Disease)、神经性红斑狼疮后遗症、莱姆病-神经性并发症、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph Disease)、巨脑症、巨脑畸形、梅一罗二氏综合征(Melkersson-Rosenthal Syndrome)、脑膜炎、门克斯病(Menkes Disease)、感觉异常性股痛、异染性脑白质营养不良、小头畸形、偏头痛、米勒费雪综合征(Miller Fisher Syndrome)、轻度中风、线粒体肌病、莫比乌斯综合征(Mobius Syndrome)、单肢肌肉萎缩、运动神经元疾病、脑基底异常血管网病、粘脂贮积症、黏多糖贮积症、多发性梗塞痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化、具有体位性低血压的多系统萎缩症、多系统萎缩症、肌肉萎缩、先天性肌无力、重症肌无力、脑脱髓鞘性弥漫性硬化、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、先天性肌病、甲状腺毒性肌病、肌病、先天性肌强直、肌强直、嗜眠病、神经棘红细胞增多症 (Neuroacanthocytosis)、具有脑铁积聚的神经退化、神经纤维瘤、神经阻滞剂恶性综合征、AIDS的神经病学并发症、庞贝氏病(Pompe Disease)的神经病学表现、视神经脊髓炎、神经性肌强直、神经元蜡样脂褐质贮积症、神经元迁移病症、遗传性神经病、神经系统结节病、神经毒性、海绵形痣、尼-皮二氏病、奥沙利文-麦克劳德综合征(O' Sullivan-McLeod Syndrome)、枕神经痛、隐匿性脊椎闭合不全序列、大田原综合征(Ohtahara Syndrome)、橄榄体脑桥小脑萎缩、眼肌阵挛、体位性低血压、过度使用综合征、慢性疼痛、肿瘤伴随综合征、感觉异常、帕金森氏病、先天性肌强直症(Parnyotonia Congenita)、突发性舞蹈手足徐动症、突发性偏头痛、帕-罗二氏病(Parry-Romberg)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、舒凯尔II型综合征(Pena Shokeir II Syndrome)、围神经囊肿、周期性麻痹、周围神经病、室周白质软化症(Periventricular Leukomalacia)、持久植物状态、广泛性发展障碍(PervasiveDevelopmental Disorders)、植烷酸贮积病、皮克氏病(Pick's Disease)、梨状肌综合征、垂体瘤、多肌炎、蓬佩病、脑穿通、脊髓灰质炎后综合征、带状疱疹神经痛、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、姿势体位性心动过速综合征、姿势心动过速综合征、原发性侧索硬化、朊病毒疾病、渐进性面部单侧萎缩、渐进性运动性共济失调、渐进性多灶性白质脑病、渐进性致硬化灰质萎缩、渐进性核上麻痹、假性脑瘤、吡哆醇依赖和吡哆醇反应痉挛病症、I型拉姆齐亨特综合征(Ramsay Hunt Syndrome Type I)、II型拉姆齐亨特综合征、拉斯穆森氏脑炎(Rasmussen's Encephalitis)及其他自体免疫癫痫、反射性交感神经营养不良综合征、婴儿雷夫叙姆病、雷夫叙姆病、重复运动病症、重复应力损伤、多动腿综合征、反转录病毒相关脊髓病、雷特综合征(Rett Syndrome)、雷依氏综合征(Reye's Syndrome)、赖利- 戴综合征(Riley-Day Syndrome)、SUNCT头痛、骶神经根囊肿、圣维特斯舞蹈(Saint Vitus Dance)、涎腺疾病、桑德霍夫病(Sandhoff Disease)、席尔德氏病(Schilder's Disease)、脑裂、痉挛症、视中隔发育不良(Septo-Optic Dysplasia)、婴儿严重肌肉阵挛性癫痫(SMEI)、发抖婴儿综合征、带状疱疹、香-德综合征(Shy-Drager Syndrome)、修格兰氏综合征(Sjogren'sSyndrome)、睡眠呼吸暂停症、昏睡病、索托氏综合征(Soto's Syndrome)、僵直、脊柱裂、脊髓梗塞、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑萎缩、史提尔-理查森-奥尔谢夫斯基综合征(Steele-Richardson-Olszewski Syndrome)、僵人综合征、纹状体黑质变性(Striatonigral Degeneration)、中风、斯特奇-韦伯综合征 (Sturge-Weber Syndrome)、亚急性硬化性全脑炎、皮质下动脉硬化性脑病、吞咽病症、西登哈姆氏舞蹈病(SydenhamChorea)、晕厥、梅毒性脊椎硬化、脊髓空洞积水症、脊髓空洞症、全身性红斑狼疮、脊髓痨、迟发性运动障碍、塔洛夫囊肿(Tarlov Cysts)、泰-萨二氏病 (Tay-Sachs Disease)、颞动脉炎、系链脊髓综合征、汤姆森病、胸出口综合征、甲状腺毒性肌病、三叉神经痛、托德麻痹、妥瑞综合征 (Tourette Syndrome)短暂性脑缺血发作、可传播的海绵状脑病、横贯性脊髓炎、外伤性脑损伤、颤振、三叉神经痛、热带痉挛下肢轻瘫、结节性硬化、血管勃起肿瘤、包括颞动脉炎的脉管炎、冯·埃科诺莫氏病(Von Economo's Disease)、希-林二氏病(VHL)、冯·雷克林豪森氏病(Von Recklinghausen's Disease)、瓦伦伯格氏综合征(Wallenberg's Syndrome)、韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffman Disease)、韦尼克- 科尔萨科夫综合征(Wernicke-Korsakoff Syndrome)、西方综合征(West Syndrome)、惠普尔病(Whipple'sDisease)、威廉姆斯综合征、威尔逊病、X-连锁的脊椎和延髓肌肉萎缩和泽尔韦格综合征。
在各个实施方案中，本发明的组合物用于治疗一种或多种呼吸疾病，诸如气喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管扩张、过敏性鼻炎、窦炎、肺部血管收缩、炎症、过敏症、阻碍呼吸、呼吸窘迫综合征、囊性纤维变性、肺动脉高血压、肺部血管收缩、肺气肿、汉坦病毒肺部综合征(HPS)、勒夫勒综合征(Loeffler's syndrome)、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、胸膜炎、肺炎、肺水肿、肺纤维化、结节病、与呼吸道合胞病毒感染相关的并发症以及其他呼吸疾病。
在各个实施方案中，本发明的组合物用于治疗、控制或预防心血管疾病，诸如影响心和脉管系统的疾病或病况，包括但不限于冠心病 (CHD)、脑血管病(CVD)、主动脉狭窄、周边血管疾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、心肌梗塞(心脏病发作)、脑血管疾病(中风)、短暂性脑缺血发作(TIA)、心绞痛(稳定和不安定性)、心房纤维性颤动、心律不整、心瓣膜病(vavular disease)和/或充血性心力衰竭。
在各个实施方案中，本发明的组合物用于治疗、控制或预防一种或多种代谢相关病症。在各个实施方案中，本发明可用于治疗、控制或预防糖尿病，包括1型和2型糖尿病的糖尿病以及与肥胖相关的糖尿病。本发明的组合物和方法可用于治疗或预防糖尿病相关病症，包括但不限于糖尿病性肾病；高血糖症；葡萄糖耐受不良；胰岛素抵抗；肥胖；脂质病症；血脂异常；高脂血症；高甘油三酯血症；高胆固醇血症；低HDL水平；高LDL水平；动脉粥样硬化及其后遗症；血管再狭窄；肠道易激综合征；炎性肠病，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；其他炎性病况；胰腺炎；腹部肥胖；神经变性疾病；视网膜病；肿瘤病况；脂肪细胞肿瘤；脂肪细胞癌如脂肪肉瘤；前列腺癌；及其他癌症，包括胃癌、乳腺癌、膀胱癌和结肠癌；血管生成；阿尔茨海默氏病；牛皮癣；高血压，代谢综合征(例如，人患有下列病症中的一种或多种：腹部肥胖、高甘油三酯血症、低HDL胆固醇、高血压和高空腹血糖)；卵巢雄激素过多症(多囊性卵巢症)以及其中胰岛素抵抗是一种分量(compnent)的其他病症，如睡眠呼吸暂停症。本发明的组合物和方法可用于治疗、控制或预防包括遗传或环境性的肥胖以及与肥胖相关的病症。本文的肥胖相关病症与肥胖相关，由肥胖造成或由肥胖引起。与肥胖症相关的病症的实例包括肥胖、糖尿病、暴食、狂吃症和贪食症、高血压、血浆胰岛素浓度升高和胰岛素抵抗、血脂异常、高脂血症、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌和结肠癌、骨关节炎、阻塞性睡眠呼吸暂停、胆结石、心脏病、心脏节律异常和心律失常、心肌梗塞、充血性心力衰竭、冠心病、猝死、中风、多囊性卵巢症、颅咽管瘤、普瑞德威利综合征(Prader-Willi Syndrome)、弗罗利克氏综合征(Frohlich's syndrome)、GH缺乏受试者、正常变短身材(normal variantshort stature)、特纳氏综合征(Turner's syndrome)及其他病理学病况，其中将代谢活性降低或静能消耗减少显示为占总体不含脂肪物质的百分数，例如患急性淋巴母细胞性白血病的儿童。与肥胖症相关的病症的另外实例为代谢综合征；胰岛素抵抗综合征；生殖激素异常；性和生殖功能障碍，诸如生育能力受损、不育症、男性性腺机能减退和女性多毛症；与母亲肥胖相关的胎儿缺陷；胃肠道运动性病症，诸如肥胖相关的胃食管回流；呼吸病症，诸如肥胖呼吸困难综合征(匹克威克综合征)；气喘；心血管病症；炎症，例如脉管系统的全身性炎症；动脉硬化；高胆固醇血症；下背疼痛；胆囊病；高尿酸血症；痛风；和肾癌；以及麻醉风险增加。本发明的组合物和方法还可用以治疗阿尔茨海默氏病。
当在体内递送时，包括含有核酸的脂质体制剂的核酸可以在肝脏和/或脾脏中积聚。现在已经发现，编码蛋白质的核酸可以调节肝脏和脾脏中的蛋白质表达，并且以这种方式使用的核酸可以构成治疗肝脏和脾脏疾病的有效治疗剂。因此，某些实施方案涉及一种通过向患者递送编码关注的蛋白质的核酸来治疗肝脏和/或脾脏疾病的方法。其他实施方案涉及一种用于治疗肝脏和/或脾脏疾病的治疗组合物，其包含编码关注的蛋白质的核酸。可以治疗的肝脏和/或脾脏的疾病和病况包括但不限于：肝炎、酒精诱发的肝病、药物诱发的肝病、艾巴氏病毒感染(Epstein Barr virus infection)、腺病毒感染、巨细胞病毒感染、弓形体病、洛矶山区发热、非酒精性脂肪肝病、血色病、威尔森氏病(Wilson'sDisease)、吉尔伯特氏病(Gilbert's Disease)和肝脏和/ 或脾脏的癌症。
在一些实施方案中，本发明的组合物和方法涉及治疗1型糖尿病、心脏病(包括缺血性和扩张性心肌病)、黄斑变性、帕金森氏病、囊性纤维化、镰状细胞贫血、地中海贫血、范可尼贫血、严重联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、着色性干皮病、亨廷顿氏病、肌肉营养不良、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默氏病、癌症和传染性疾病(包括肝炎和HIV/AIDS)。
在各个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗或预防一种或多种代谢疾病或病症。在各个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗或预防以下一种或多种：碳水化合物代谢的疾病或病症、氨基酸代谢的疾病或病症、尿素循环的疾病或病症、脂肪酸代谢的疾病或病症、卟啉代谢的疾病或病症、溶酶体贮积症、过氧化物酶体生物发生病症以及嘌呤或嘧啶代谢的疾病或病症。
在各个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗或预防下表中的疾病或病症中的一种或多种。在各个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于例如通过调节与下表中的疾病相关的基因来治疗或预防下表中的疾病或病症中的一种或多种。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于使用本发明的组合物基因编辑下表中所述的基因。
上表中列出的Entrez条目以引用的方式整体并入本文。
另外，在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可用于靶向这些蛋白质中的任一种或用于治疗表2B的疾病或病症中的任一种。在各个实施方案中，本发明预期靶向表2B中公开的任何蛋白质的全长和/或截短形式。在各个实施方案中，本发明预期靶向表2B中公开的任何蛋白质的前体形式和/或成熟形式和/或同种型。
在各个实施方案中，本发明预期靶向与本文(例如，在表2B中) 公开的任何蛋白质序列具有约60％(例如，约60％、或约61％、或约 62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)的序列同一性的蛋白质。
在各个实施方案中，本发明预期靶向蛋白质，所述蛋白质包含相对于本文(例如，在表2B中)所述的任何蛋白质序列具有一处或多处氨基酸突变的氨基酸序列。例如，本发明预期靶向包含相对于本文(例如，在表2B中)所述的任何蛋白质序列具有1、或2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12处氨基酸突变的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方案中，所述一处或多处氨基酸突变可以独立地选自取代、插入、缺失和截短。
在一些实施方案中，氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。
例如，“保守取代”可以基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。20 种天然存在的氨基酸可以分组为以下六个标准氨基酸组：(1)疏水性： Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
如本文所用，“保守取代”定义为由上文所示的六个标准氨基酸组的同一组内列出的另一种氨基酸交换氨基酸。例如，由Glu交换Asp 在如此修饰的多肽中保留一个负电荷。此外，甘氨酸和脯氨酸可以基于它们破坏α-螺旋的能力而彼此取代。
如本文所用，“非保守取代”定义为由上文所示的六个标准氨基酸组(1)至(6)的不同组中列出的另一种氨基酸交换氨基酸。
在各个实施方案中，取代还可以包括非经典氨基酸(例如，硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ- 氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、常见氨基酸的D-异构体、2,4- 二氨基丁酸、a-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸(sarcosme)、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计氨基酸如β甲基氨基酸、Ca- 甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸和一般氨基酸类似物)。
在表2B中，所有说明性标识符(例如，基因序列号和参考文献以引用的方式整体并入本文)。
表2B.说明性蛋白质、说明性肽和说明性适应症
在各个实施方案中，施用核酸药物(包括合成RNA)的方式是其影响角质形成细胞和成纤维细胞中的一种或多种(例如，促使这些细胞表达一种或多种治疗性蛋白质)。例如，本发明方法允许使用患者的细胞产生治疗性蛋白质并且通过合成RNA给药来定制这种蛋白质的水平的方法。
在一个特定的实施方案中，合成RNA靶向可溶性蛋白质。在一些实施方案中，合成RNA靶向以下蛋白质家族中的一种或多种的蛋白质：转化生长因子(TGF)β、骨形态发生蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素。术语“家族”、“超家族”和“亚家族”可以互换使用
在一个特定的实施方案中，合成RNA靶向TGFβ家族的成员。 TGF-β超家族蛋白包含以六-保守半胱氨酸残基为特征的细胞因子 (Lander等，(2001)Nature,409:860-921)。人基因组含有至少约42个编码TGF-β超家族蛋白的开放阅读框。TGF-β超家族蛋白可以基于序列相似性和它们激活的特异性信号传导途径至少分为BMP亚家族和TGF-β亚家族。在各个实施方案中，合成RNA靶向以下一种或多种：TGF(例如，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)、激活素(例如，激活素 A)和抑制素、巨噬细胞抑制性细胞因子-1(MIC-1)、米勒管(Mullerian) 抑制物质、抗米勒管激素和胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)。
TGF-β超家族包含半胱氨酸结细胞因子超家族的子集。半胱氨酸结细胞因子超家族的额外成员包括但不限于血小板源性生长因子 (PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(P1GF)、头蛋白 (Noggin)、神经营养因子(BDNF、NT3、NT4和βNGF)、促性腺激素、促卵泡素、促黄体素、白细胞介素-17和凝固素原。该蛋白质家族也是本发明所涵盖的靶标之一。
在各个实施方案中，本发明涉及靶向TGFβ家族成员用于治疗或预防各种免疫病症、癌症、支气管哮喘、肺纤维化、心脏病、糖尿病、遗传性出血性毛细血管扩张、马凡综合征(Marfan syndrome)、血管埃勒斯-当洛斯综合征、洛伊-迪茨综合征(Loeys-Dietzsyndrome)、帕金森氏病、慢性肾病、多发性硬化和AIDS。
在一个特定的实施方案中，合成RNA靶向BMP家族的成员。 BMP亚家族包括但不限于BMP-2、BMP-3(成骨素)、BMP-3b (GDF-10)、BMP-4(BMP-2b)、BMP-5、BMP-6、BMP-7(成骨蛋白-1 或OP-1)、BMP-8(OP-2)、BMP-8B(OP-3)、BMP-9(GDF-2)、BMP-10、 BMP-11(GDF-11)、BMP-12(GDF-7)、BMP-13(GDF-6、CDMP-2)、 BMP-15(GDF-9)、BMP-16、GDF-1、GDF-3、GDF-5(CDMP-1)和 GDF-8(肌肉生长抑制素)。在各个实施方案中，合成RNA靶向以下一种或多种：BMP-2、BMP-3(成骨素)、BMP-3b(GDF-10)、BMP-4 (BMP-2b)、BMP-5、BMP-6、BMP-7(成骨蛋白-1或OP-1)、BMP-8 (OP-2)、BMP-8B(OP-3)、BMP-9(GDF-2)、BMP-10、BMP-11 (GDF-11)、BMP-12(GDF-7)、BMP-13(GDF-6、CDMP-2)、BMP-15 (GDF-9)、BMP-16、GDF-1、GDF-3、GDF-5(CDMP-1)和GDF-8(肌肉生长抑制素)。BMP有时被称为成骨蛋白(OP)、生长分化因子(GDF) 或软骨源性形态发生蛋白(CDMP)。在一个特定的实施方案中，合成 RNA靶向一种或多种BMP融合物(例如，如美国专利公开号 2009/0202638中所述，其全部内容以引用的方式并入本文)和/或一种或多种BMP突变体(例如，如美国专利公开号2011/0039773中所述，其全部内容以引用的方式并入本文)。
在各个实施方案中，本发明涉及靶向BMP家族成员用于再生医学或代谢应用，包括但不限于整形外科应用，诸如脊柱融合、骨不愈合和口腔外科手术、代谢疾病、前驱糖尿病、糖尿病、产热、胰岛素敏感、胰岛素抵抗和包括棕色脂肪脂肪生成的脂肪生成。本文中在其他地方描述各种其他代谢应用。在各个实施方案中，本发明涉及靶向包括BMP-7的BMP家族成员用于治疗慢性肾病(CKD)和/或逆转由于硬化引起的肾小球损失。
在各个实施方案中，本发明涉及靶向BMP家族成员以在体内的多个位置诱导骨和软骨的增殖。例如，本发明预期关节如膝关节、肘关节、踝关节和指关节的修复。例如，靶向BMP家族成员可以引起患有关节炎或其他软骨退化疾病的患者的软骨再生。另外，本发明涉及治疗由于损伤引起的软骨撕裂。此外，本发明可用于诱导患者的骨生长，例如但不限于用于治疗患有骨折或骨裂、骨质疏松症的患者或需要脊柱融合的患者，或用于修复脊柱、椎骨等。
在各个实施方案中，本发明涉及靶向BMP家族成员以诱导不同于骨或骨软骨的哺乳动物中的多种组织的骨形态发生和组织形态发生的发育级联。该形态发生活性包括诱导祖细胞增殖和分化的能力，以及通过引起骨、软骨、非矿物质化骨骼或结缔组织和其他成人组织的形成等事件的进展支持和维持分化表型的能力。
例如，本发明可以用于治疗以防止代谢性骨病中的骨量损失和/ 或增加。使用成骨蛋白防止代谢性骨病中的骨量损失和/或增加的一般治疗方法公开在美国专利号5,674,844中，其全部内容以引用的方式并入本文。另外，本发明的组合物和方法可用于替代或修复损伤部位如骨裂、骨折和软骨撕裂的骨或软骨；牙周组织再生(例如，使用成骨蛋白进行牙周组织再生的一般方法公开在美国专利号5,733,878 中，其全部内容以引用的方式并入本文)；肝脏再生，包括在部分肝切除术后的肝脏再生(参见，例如美国专利号5,849,686，其全部内容以引用的方式并入本文)；治疗慢性肾衰竭(参见，例如美国专利号 6,861,404，其全部内容以引用的方式并入本文)；增强中枢神经系统缺血或创伤后的功能恢复(参见，例如美国专利号6,407,060，其全部内容以引用的方式并入本文)；诱导树突生长(参见，例如美国专利号 6,949,505，其全部内容以引用的方式并入本文)；诱导神经细胞粘附(参见，例如美国专利号6,800,603，其全部内容以引用的方式并入本文)；以及治疗和预防帕金森氏病(参见，例如美国专利号6,506,729，其全部内容以引用的方式并入本文)。作为另一个实施例，本发明的组合物和方法，包括在靶向一种或多种BMP时，可以用于诱导牙质生成。迄今为止，牙髓组织对损伤的不可预测的应答是牙科中的基本临床问题。使用标准牙科手术工序，通过除去就在样品牙齿的牙髓上方的牙釉质和牙本质(通过钻孔)，对冠状牙髓组织执行部分切断，诱导止血，应用牙髓治疗以及通过标准工序密封和填充空腔可以手术暴露小面积(例如，2mm)的牙髓。
在各个实施方案中，本发明涉及靶向BMP家族成员用于治疗一种或多种如本文所述的代谢相关病症。
在一个特定的实施方案中，合成RNA靶向FGF家族的成员。FGF 是生长因子家族，其成员参与血管生成、伤口愈合、胚胎发育和各种内分泌信号传导途径。在各个实施方案中，以下FGF中的任一种是本发明的靶标：FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、 FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14(FGF11、 FGF12、FGF13和FGF14为FGF同系因子1-4(FHF1-FHF4))、FGF16、 FGF17、FGF18、FGF19(亦称FHF15/19)、FGF20、FGF21、FGF22 和FGF22。在一些实施方案中，合成RNA靶向任何上述FGF的同源受体。在各个实施方案中，本发明涉及靶向FGF家族成员以治疗或预防与FGF的异常功能和/或表达相关的疾病或病症、代谢疾病或病症(例如，糖尿病、肥胖、血脂异常、高血糖、高胰岛素血症、高血压、肝细胞病如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等)、癌症、与脂质代谢受损相关的疾病或病症、与肾功能受损相关的疾病或病症、与肝功能受损相关的疾病或病症、异常细胞增殖、血管疾病或病症(例如，冠状动脉疾病、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、腹主动脉瘤、血凝块、深静脉血栓形成、静脉淤滞疾病、静脉炎、静脉曲张等)、血管生成、动脉粥样硬化、心血管疾病或病症、与血管形成受损相关的疾病或病症、与细胞信号传导受损相关的疾病或病症、与激酶活性受损相关的疾病或病症以及与葡萄糖摄入脂肪细胞受损相关的疾病或病症。
在一个特定的实施方案中，合成RNA靶向VEGF家族的成员。在一些实施方案中，靶标是以下一种或多种：VEGF-A(包括所有同种型，例如VEGF121、VEGF165和VEGF189)、胎盘生长因子(PGF，包括所有同种型，例如PGF-1、PGF-2和PGF-3)、VEGF-B、VEGF-C 和VEGF-D及其任何变体(参见，例如美国专利号9,078,860，其全部内容以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，合成RNA靶向任何上述VEGF的同源受体。本发明还涵盖作为靶标的VEGF相关蛋白，其包括orf病毒编码的VEGF样蛋白，称为VEGF-E，以及一系列蛇毒液，称为VEGF-F。VEGF和VEGF相关蛋白是胱氨酸结生长因子的血小板源性生长因子(PDGF)超基因家族的成员。PDGF超基因家族的所有成员与PDGF具有高度的结构同源性。
在各个实施方案中，本发明涉及靶向VEGF家族成员以治疗与血管生成相关的疾病和病况，包括但不限于实体瘤癌症、血管瘤、类风湿性关节炎、骨关节炎、脓毒性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、特发性肺纤维化、血管再狭窄、动静脉畸形、脑膜瘤、新生血管性青光眼、牛皮癣、卡波西综合征、血管纤维瘤、血友病关节、肥厚性瘢痕、奥斯勒-韦伯综合征(Osier-Weber syndrome)、化脓性肉芽肿、晶状体后纤维组织、硬皮病、沙眼、逢希伯-林道病(vonHippel-Lindau disease)、血管粘连病变、滑膜炎、皮炎、神经退化性疾病、先兆子痫、不明原因的女性不育症、子宫内膜异位症、不明原因的男性不育症、翼状胬肉、伤口、溃疡、皮肤溃疡、胃溃疡和十二指肠溃疡。在各个实施方案中，本发明涉及靶向VEGF家族成员以治疗血管生成相关的眼病，包括但不限于与异常眼内新血管形成相关的任何眼病，包括但不限于早产儿视网膜病、糖尿病性视网膜病、视网膜静脉阻塞和与年龄相关的黄斑变性以及糖尿病性黄斑水肿和视网膜静脉阻塞。在一个实施方案中，本发明的组合物和方法涉及湿性年龄相关性黄斑变性的治疗。
在一个特定的实施方案中，合成RNA靶向白细胞介素家族的成员。白细胞介素代表一大组具有多种功能的细胞因子，并且首先通过在白细胞中表达表征，并且已经显示在多种细胞如巨噬细胞、TH-1 和TH-2细胞、T-淋巴细胞、单核细胞和骨髓基质中表达。广泛地说，免疫系统的功能在很大程度上取决于白细胞介素的表达和功能。在一些实施方案中，靶标是白细胞介素1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35和36中的一种或多种，以及在每种白细胞介素中，各种同种型和/或白细胞介素受体(例如，IL-1R、 IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-8R、IL-9R、IL-10R、 IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-14R、IL-15R、IL-16R、IL-17R、IL-18R、IL-19R、IL-20R、IL-21R、IL-22R、IL-23R、IL-24R、IL-25R、IL-26、 IL-27R、IL-28R、IL-29R、IL-30R、IL-31R、IL-32R、IL-33R、IL-34R、 IL-35R和IL-36R)。在一个特定的实施方案中，靶向IL-15和IL-15R(例如，IL-15RA)两者。不希望受理论束缚，认为靶向白细胞介素(例如，IL-15)及其认知白细胞介素受体(例如，IL-15RA)两者引起协同有益效果。在各个实施方案中，本发明涉及靶向白细胞介素家族的成员以治疗如本文所述的受试者或生物体中的癌症，炎性、呼吸、自体免疫、心血管、神经、代谢和/或增殖性疾病、病症和/或病况。在一个特定的实施方案中，本发明涉及靶向白细胞介素家族的成员以治疗癌症。在一个特定的实施方案中，本发明涉及靶向白细胞介素家族的成员以治疗类风湿性关节炎。
在一个特定的实施方案中，合成RNA靶向EPO基因或其衍生物 (例如，SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:167)。一些实施方案涉及NOVEPOETIN蛋白(SEQ ID NO:167)。其他实施方案与NOVECRIT(SEQ ID NO:168)有关。
促红细胞生成素可以刺激慢性肾功能衰竭的贫血患者的红细胞生成，在所述患者中促红细胞生成素的内源性产生受损。不受理论的束缚，由于红细胞生成常常需要的时间长度(红细胞祖细胞成熟并释放到循环中的数天)，血红蛋白的临床显著增加在不到两周内通常并未观察到，并且在一些患者中可能需要长达十周。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物提供更快速的治疗效果。在一些实施方案中，例如，在与野生型EPO和/或没有非规范核苷酸的EPO和/或作为蛋白质生物制剂递送的EPO相比时，本发明的方法和组合物提供更快的治疗效果。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物提供持续的治疗效果。在一些实施方案中，例如，在与野生型EPO和/或没有非规范核苷酸的EPO和/或作为蛋白质生物制剂递送的EPO相比时，本发明的方法和组合物提供持续的治疗效果。
例如，对于EPO，本发明的方法和组合物在小于约6周、或小于约5周、或小于约4周、或小于约3周、或小于约2周、或小于约1 周内提供血细胞比容的临床显著增加。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物在约2周、或约10天、或约1周、或约3天、或约1 天内提供血细胞比容的临床显著增加。在各个实施方案中，本发明的方法和组合物加速红细胞祖细胞成熟并释放到循环中的过程。
在一些实施方案中，与野生型EPO和/或没有非规范核苷酸的 EPO和/或作为蛋白质生物制剂递送的EPO相比，本发明的EPO相关组合物可用于降低施用的剂量和/或频率。例如，本发明的EPO相关组合物可以用于本文公开的疾病(包括但不限于一种或多种贫血)的治疗方案中，所述治疗方案涉及每月、或每两周或每周施用。因此，在一些实施方案中，本发明的EPO相关组合物降低每日施用或在一些实施方案中每周施用的需要。在一些实施方案中，与野生型EPO 和/或没有非规范核苷酸的EPO和/或作为蛋白质生物制剂递送的 EPO相比，本发明的EPO相关组合物需要较低的维持剂量。某些实施方案特别可用于治疗化学疗法诱导的贫血。其他实施方案特别可用于治疗与炎症相关的贫血，包括但不限于类风湿性关节炎。
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物提供一种消除对RBC 输注的需要的快速且稳健的应答。例如，在一些实施方案中，本发明的方法和组合物允许治疗不同意输注的患者。
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物增加血细胞比容的增加速率。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物维持升高的血细胞比容(例如25％、或30％、或35％、或40％或更高)持续一段时间(例如，约1个月、或约2个月、或约3个月、或约4个月、或约5个月、或约6个月、或约9个月)。
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物刺激红细胞产生。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物刺激骨髓中定型红细胞祖细胞的分裂和分化。
在一些实施方案中，包括而不限于在靶向EPO时，本发明涉及治疗以下一种或多种：贫血，包括由慢性肾病(例如，由于透析)和/ 或化学疗法和/或HIV治疗(例如，齐多夫定(Zidovudine，INN)或叠氮胸苷(azidothymidine，AZT)、炎性肠病(例如克罗恩氏病和溃疡结肠炎) 引起的贫血，与炎性病况(例如，关节炎、狼疮、IBD)有关的贫血，与糖尿病、精神分裂症、脑型疟有关的贫血，再生障碍性贫血，和由癌症治疗(例如，化学疗法和/或放射)引起的脊髓发育不良以及各种脊髓发育不良综合征疾病(例如，镰状细胞贫血、血红蛋白SC疾病、血红蛋白C疾病、α-和β-地中海贫血、早产后新生儿贫血和可比较的病况)。
在一些实施方案中，包括而不限于在靶向EPO时，本发明涉及治疗或患有以下病症中的一种或多种的患者：癌症，心力衰竭，自体免疫疾病，镰状细胞病，地中海贫血，失血，输注反应，糖尿病，维生素B12缺乏症，胶原蛋白血管病，舒瓦克曼综合征(Shwachmansyndrome)，血小板减少性紫癜，乳糜泻，内分泌缺乏状况，诸如甲状腺机能减退或爱迪生氏病(Addison's disease)，自体免疫疾病，诸如克罗恩氏病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎或幼年型类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎，免疫病症，诸如嗜酸性筋膜炎、低免疫球蛋白血症或胸腺瘤/胸腺癌、移植物抗宿主病、白血病前期，非血液学综合征(例如，唐氏、Dubowwitz、塞克尔梨(Seckel))，费尔蒂综合征(Felty syndrome)，溶血尿毒症综合征，脊髓发育不良综合征，夜间阵发性血红蛋白尿症，骨髓纤维瘤，全血细胞减少症，纯红细胞发育不全，舍恩莱因-亨诺氏紫癜(Schoenlein-Henoch purpura)，疟疾，蛋白饥饿，月经过多，全身性硬化，肝硬化，代谢减退状况，充血性心力衰竭，慢性感染，诸如HIV/AIDS、结核病、骨髓炎、乙型肝炎、丙型肝炎、埃-巴二氏病毒或细小病毒、T细胞白血病毒、细菌过度繁殖综合征、真菌或寄生虫感染，和/或红细胞膜病症，诸如遗传性球形红细胞症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性异形红细胞症、遗传性裂口红细胞症、红细胞酶缺陷、脾功能亢进、免疫溶血或阵发性睡眠性血红蛋白尿。
在一些实施方案中，包括而不限于在靶向EPO时，本发明涉及治疗或患有贫血，即红细胞数和/或红细胞中见到的血红蛋白量低于正常水平的状况的患者。在各个实施方案中，贫血可以是急性的或慢性的。例如，本发明的贫血包括但不局限于缺铁性贫血、肾贫血、慢性疾病/炎症的贫血、恶性贫血、诸如大红细胞性胃液缺乏性贫血、少年期恶性贫血和先天性恶性贫血、癌症相关的贫血、化学疗法相关的贫血、放射疗法相关的贫血、纯红细胞再生障碍性贫血、具有过量胚细胞的难治性贫血、再生障碍性贫血、X-线铁粒幼细胞贫血、溶血性贫血、镰状细胞贫血、由ESA产生受损引起的贫血、脊髓发育不良综合征、低血色素贫血、小红细胞性贫血、铁粒幼细胞贫血、自体免疫性溶血性贫血、库利氏贫血(Cooley'sanemia)、地中海贫血，先天性纯红细胞再生障碍性贫血(Diamond Blackfan anemia)、范康尼氏贫血(Fanconi's anemia)以及药物诱发的免疫性溶血性贫血。贫血可以引起严重症状，包括缺氧、慢性疲劳、集中力缺乏、浅色皮肤、低血压、眩晕和心力衰竭。
在一些实施方案中，贫血由作为贫血病因之一的化学疗法诱发。例如，化学疗法可以是任何骨髓抑制化学疗法。在一些实施方案中，化学疗法是一种或多种基于铂的药物，包括顺铂(例如，PLATINOL) 和卡铂(例如，PARAPLATIN)。在一些实施方案中，化学疗法是本文所述的任何一种剂。在一些实施方案中，化学疗法是Groopman等人， J Natl Cancer Inst(1999)91(19):1616-1634中描述的任何剂，其内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于治疗晚期癌症患者(例如，IV期、或III期、或II期癌症)中的化学疗法相关的贫血。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于治疗接受剂量密集化学疗法或其他侵袭性化学疗法方案的癌症患者中的化学疗法相关贫血。
在一些实施方案中，本发明涉及患有一种或多种基于血液的癌症如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的患者中的贫血的治疗。这类癌症可能直接影响骨髓。另外，本发明涉及已扩散至骨或骨髓的转移性癌症。在一些实施方案中，本发明涉及治疗在进行放射疗法的患者的贫血。这类放射疗法可能损害骨髓，降低其制造红细胞的能力。在另外的实施方案中，本发明涉及治疗患有铁、维生素B12和叶酸中的一种或多种减少或缺乏的患者的贫血。在另外的实施方案中，本发明涉及治疗患有过度出血的患者的贫血，所述过度出血包括但不限于手术后或来自引起内出血的肿瘤的过度出血。在另外的实施方案中，本发明涉及治疗患有慢性疾病的贫血的患者的贫血。
在一些实施方案中，本发明涉及治疗由慢性肾衰竭引起的贫血。在一些实施方案中，本发明涉及治疗由使用一种或多种肾替代疗法引起的贫血，所述肾替代疗法包括透析、血液透析、腹膜透析、血液滤过、血液透析滤过和肾移植。
在一些实施方案中，本发明涉及治疗未进行透析的慢性肾病患者的贫血。例如，本发明涉及1期CKD、或2期CKD、或3期CKD、或4期CKD、或5期CKD的患者。在一些实施方案中，本发明的患者为4期CKD或5期CKD。在一些实施方案中，本发明的患者已经历肾移植。在一些实施方案中，本发明涉及患有急性肾损伤(AKI)的患者的贫血的治疗。
在各个实施方案中，本发明的组合物和方法用于减少或消除患者的疲劳、头晕和呼吸短促。
在各个实施方案中，本发明的组合物和方法用于治疗对红细胞生成刺激剂治疗呈现低响应或抗性的患者。在一些实施方案中，对促红细胞生成素或ESA抗性贫血的低响应性是指存在下列条件中的至少一种：i)在恒定剂量的ESA治疗下血红蛋白水平显著减小，ii)实现或维持某一血红蛋白水平所需的ESA剂量显著增加，iii)尽管相当于促红细胞生成素的ESA剂量大于150IU/kg/周或0.75mg/kg/周的阿法达贝泊汀也未能将血红蛋白水平提高到靶标范围或继续需要这种高剂量的ESA来维持靶标血红蛋白水平。例如，约5-10％的患有CDK 的患者表明对ESA的低响应性，这定义为继续需要大于300IU/kg/ 周促红细胞生成素或1.5ng/kg/周由皮下途径施用的达贝泊汀。
在各个实施方案中，本发明的组合物和方法减轻对红细胞生成刺激剂疗法的剂量不断增加的需要，且因此任选地避免副作用(例如，流感样症状，诸如关节痛、虚弱、眩晕和疲倦、皮肤刺激、不利心血管并发症风险增加)。
在各个实施方案中，本发明的组合物和方法用于维持约12.5g/dL 至13g/dL的血红蛋白水平。在各个实施方案中，本发明的组合物和方法在血红蛋白水平低于约12g/dL、或约11g/dL、或约10g/dL、或约9g/dL、或约8g/dL、或约7g/dL、或约6g/dL、或约5g/dL的患者中使用。在各个实施方案中，本发明的组合物和方法在具有指示血液病理学的铁血液测试分数如铁蛋白评分低于约200ng/L和/或转铁蛋白饱和度评分低于约30％的患者中使用。
在各个实施方案中，本发明的组合物和方法用于增加或维持血红蛋白水平在9g/dL至10g/dL范围的靶标水平下、在9g/dL至11g/dL 范围的靶标水平下、在9g/dL至12g/dL范围的靶标水平下、在9g/dL 至14g/dL范围的靶标水平下、在10g/dL至14g/dL范围的靶标水平下、或在12g/dL至14g/dL范围的靶标水平下。
在各个实施方案中，本发明的组合物和方法用于使患者的血红蛋白水平正常。在各个实施方案中，人的正常血红蛋白范围对于男性为约14g/dL至18g/dL，且对于女性为12g/dL至16g/dL，其中男性的平均血红蛋白值为约16g/dL，且女性的平均血红蛋白值为约14g/dL。
在一些实施方案中，例如当靶向EPO时，本发明涉及治疗以下毒性分级标准(例如，NCI常见毒性标准)的一种或多种的贫血：1级(轻度)，10.0g血红蛋白/dL至正常极限内；2级(中等)，8.0-10.0g血红蛋白/dL；3级(严重或重度)，6.5-7.9g血红蛋白/dL；和4级(危及生命)，小于6.5g血红蛋白/dL。在各个实施方案中，本发明使毒性分级标准增加约1个点、或约2个点、或约3个点、或约4个点。在各个实施方案中，本发明引起患者具有0或1的水平。在各个实施方案中，本发明的组合物和方法改善贫血，如通过Groopman等人，J Natl CancerInst(1999)91(19):1616-1634中描述的一种或多种量表评估，其全部内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，当靶向EPO时，本发明涉及用一种或多种 EPO的组合疗法。例如，本发明的组合物可以提供可以补充另一种 EPO的快速作用的持续作用。在一些实施方案中，本发明的组合物用作其他EPO的佐剂。在一些实施方案中，本发明的组合物用作其他EPO的维持疗法。其他EPO包括下列：阿法依伯汀，包括而不限于达贝泊汀(ARANESP)、EPOCEPT(LUPIN PHARMA)、NANOKINE (NANOGEN PHARMACEUTICAL)、EPOFIT(INTAS PHARMA)、EPOGEN(AMGEN)、EPOGIN、EPREX(JANSSEN-CILAG)、 BINOCRIT(SANDOZ)、PROCRIT；倍他依泊汀(epoetin beta)，包括而不限于NEORECORMON(HOFFMANN-LA ROCHE)、 RECORMON、甲氧基聚乙二醇-倍他依泊汀(MIRCERA,ROCHE)；德尔塔依泊汀(epoetin delta)，包括而不限于DYNEPO(红细胞生成刺激蛋白，SHIRE PLC)；欧米伽依泊汀(epoetin omega)，包括而不限于EPOMAX；泽塔依泊汀(epoetin zeta)，包括而不限于SILAPO(STADA) 和RETACRIT(HOSPIRA)；及其他EPO，包括而不限于EPOCEPT (LUPIN PHARMACEUTICALS)、EPOTRUST(PANACEA BIOTEC LTD)、ERYPRO SAFE(BIOCON LTD.)、REPOITIN(SERUM INSTITUTE OFINDIA LIMITED)、VINTOR(EMCURE PHARMACEUTICALS)、EPOFIT(INTAS PHARMA)、ERYKINE(INTAS BIOPHARMACEUTICA)、WEPOX(WOCKHARDT BIOTECH)、ESPOGEN(LG LIFE SCIENCES)、RELIPOIETIN (RELIANCE LIFE SCIENCES),SHANPOIETIN(SHANTHA BIOTECHNICS LTD),ZYROP(CADILA HEALTHCARE LTD.)、 EPIAO(RHUEPO)(SHENYANG SUNSHINE PHARMACEUTICALCO.LTD)、CINNAPOIETIN(CINNAGEN)。
在一些实施方案中，当靶向EPO时，本发明涉及与输血的组合疗法。例如，本发明的组合物可以补充输血。在一些实施方案中，当靶向EPO时，本发明涉及与铁补充剂的组合疗法。
在一些实施方案中，本发明还涉及以下蛋白质靶标，例如，在治疗疾病中：生长激素(GH)，例如人和牛生长激素、生长激素释放激素；干扰素，包括α-、β-或γ-干扰素等，白细胞介素-I；白细胞介素II；促红细胞生成素，包括a-和β-促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、抗生殖蛋白(例如，血管抑制素、内皮抑素)、PACAP多肽(垂体腺苷酸环化酶激活多肽)、血管活性肠肽(VIP)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、血管加压素、精氨酸加压素(AVP)、血管紧张素、降钙素、心房性因子、生长抑素、促肾上腺皮质激素、促性腺激素释放激素、催产素、胰岛素、生长激素、纤溶酶原组织激活剂、凝血因子，包括凝血因子VIII和IX、葡糖苷酰鞘氨醇酶、沙格司亭(sargramostim)、雷诺格拉斯蒂姆(lenograstin)、非尔司亭(filgrastin)、阿法链道酶(dornase-α)、莫拉司亭(molgramostim)、PEG-L- 天冬酰胺酶、PEG-腺苷脱氨酶、水蛭素(hirudin)、依他凝血素 (eptacog-α)(人血凝因子Vila)、神经生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、VEGF；肝素，包括低分子量肝素、降钙素；抗原；单克隆抗体；万古霉素；去铁胺(DFO)；甲状旁腺激素、免疫原或抗原，以及抗体，诸如单克隆抗体。
在一些实施方案中，本发明方法允许有效的额外治疗剂(例如，本文所述的那些)活性和/或靶向关注的细胞和/或组织。例如，本发明的合成RNA可以导致一种或多种靶向分子的表达增加，所述靶向分子将额外治疗剂导向治疗位置。例如，额外治疗剂可以具有合成RNA 编码的结合配偶体。例如，合成RNA可以诱导抗原的表达，所述抗原指导可以组合使用的抗体的治疗活性(例如，赫赛汀(herceptin)、美罗华(rituxan)、坎帕斯(campath)、吉妥昔单抗(gemtuzumab)、赫赛汀、潘瑞克斯(panorex)、利妥昔单抗(rituximab)、百克沙(bexxar)、依决洛单抗、阿仑单抗、mylotrag、IMC-C225、司马汀195(smartin 195)和米妥莫单抗(mitomomab))。在一些实施方案中，合成RNA可以直接注射到本文所述的一种或多种肿瘤中，并将治疗性抗体归巢到肿瘤。
在一些实施方案中，本发明方法允许有效的额外治疗剂产生，特别是在额外治疗剂是前药时，例如，以产生活性形式的药物。在一些实施方案中，合成RNA可以直接注射到本文所述的一种或多种肿瘤中，并将前药归巢到肿瘤。例如，合成RNA可以编码催化无毒全身递送的剂局部转化成有效化学治疗剂的酶。通过说明(注意，本文列出的任何前药或药物是如本文所用的额外剂)：
在某些实施方案中，合成RNA可以编码催化5-FU和/或多柔比星自各种前药转化的酶，如以下实例所示：
5-FU前药和酶
多柔比星前药和酶
在一些实施方案中，以本文所述剂量和方案的核酸药物可以与一种或多种额外剂(亦称辅助疗法或组合剂)组合使用。在一些实施方案中，以本文所述剂量和方案的核酸药物可以在经历用一种或多种额外剂治疗的人患者中使用。在一些实施方案中，核酸药物用作本文所述的任何额外剂的佐剂或新佐剂。在一些实施方案中，本发明涉及共同施用和/或共同配制。本文所述的任何组合物都可以共同配制和/或共同施用。在一些实施方案中，本文所述的任何核酸药物在与另一种剂共同施用时协同起作用，并且可以以低于在这类剂用作单一疗法时常用的剂量的剂量施用。
在一些实施方案中，本文所述的任何核酸药物可以包括修饰的衍生物，即通过共价连接任何类型的分子到组合物修饰使得共价连接不会阻止组合物的活性。例如但不限制，衍生物包括通过尤其糖基化、脂化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其他蛋白连接等进行修饰的组合物。许多化学修饰中的任何一种都可以通过已知技术进行，所述技术包括但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。额外地，衍生物可以含有一种或多种非经典氨基酸。在各个实施方案中，一种或多种额外剂(亦称辅助疗法或组合剂)可以缀合到本文所述的任何核酸药物。
使细胞与类固醇接触可以抑制对外来核酸的先天免疫应答，并且可以增加核酸递送和翻译的效率。因此，某些实施方案涉及使细胞与类固醇接触。其他实施方案涉及向患者施用类固醇。说明性类固醇包括皮质类固醇。在一些实施方案中，类固醇是可的松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、曲安西龙和倍他米松中的一种或多种。在一个实施方案中，类固醇为氢化可的松。在另一个实施方案中，类固醇为地塞米松。
其他实施方案涉及向患者施用以下组的成员：抗生素、抗真菌剂和RNA酶抑制剂。
A型肉毒杆菌毒素已被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗原发性眼睑痉挛、12岁以上患者的斜视和面部单侧痉挛、颈部肌张力障碍、眉间线(面部)皱纹以及治疗多汗症，并且B型肉毒杆菌毒素已被批准用于治疗颈肌张力障碍。本发明的组合物可以与这些毒素组合用于治疗这些疾病和相关疾病。一些实施方案涉及一种靶向神经毒素的核酸药物。在各个实施方案中，神经毒素是肉毒杆菌毒素或其生物活性片段、变体、类似物或家族成员。
另外，任何一种上述毒素的组合可以与本发明的组合物组合用于各种美容工序，包括而不限于面部皱纹、过度运动的皮肤纹、眉间纹、鱼尾纹、木偶纹、皮肤病、鼻唇沟、眼睑痉挛、斜视、面部单侧痉挛和出汗病症。或者，本发明的组合物可以作为单一疗法用于这些美容工序中。
某些实施方案涉及一种包含一种或多种本发明的治疗或美容组合物和一种或多种辅助疗法或美容治疗的组合疗法。在某些实施方案中，将一种或多种本发明的治疗或美容组合物施用到正在接受一种或多种辅助疗法或美容治疗的受试者。示例性辅助疗法和美容治疗在美国临时申请号61/721,302的表3和表5中列出，其内容以引用的方式并入本文，并且通过举例而不是限制给出。
表3.说明性辅助疗法
在一些实施方案中，额外剂是细胞毒性剂，在说明性实施方案中，其包括毒素、化学治疗剂、放射性同位素和引起细胞凋亡或细胞死亡的剂。
说明性细胞毒性剂包括但不限于甲氨喋呤、氨基喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺；烷化剂，诸如氮芥、三胺硫磷苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法仑、卡莫司汀 (BSNU)、丝裂霉素C、洛莫司汀(CCNU)、1-甲基亚硝基脲、环磷酰胺、氮芥、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C、顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂和卡铂(carboplatin)(卡铂(paraplatin))；蒽环类抗生素，包括柔红霉素(先前道诺霉素(daunomycin))、多柔比星(阿霉素)、地托比星、洋红霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌和比生群；抗生素，包括更生霉素(放线菌素D)、博莱霉素、加利车霉素、普卡霉素和安曲霉素(AMC)；和抗真菌剂，诸如长春花碱、长春新碱和长春花碱。其他细胞毒素剂包括紫杉醇(taxol)、篦麻毒素、假单胞菌外毒素、吉西他宾、细胞分裂抑素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、依托泊苷、替尼泊苷、秋水仙碱、二羟基炭疽杆菌素二酮、1- 去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、甲基苄肼、羟基脲、门冬酰胺酶、皮质类固醇、米托坦 (O,P'-(DDD))、干扰素和这些细胞毒素剂的混合物。
另外的细胞毒素剂包括但不限于化疗剂，诸如卡铂、顺铂、紫杉醇、吉西他宾、加利车霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、放线菌素D、环磷酰胺、长春新碱、博莱霉素、VEGF拮抗剂、EGFR 拮抗剂、铂(platins)、紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、甲酰四氢叶酸(leucovorine)、类固醇、环磷酰胺、美法仑、长春花碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞宾)、氮芥、酪氨酸激酶抑制剂、放射疗法、性激素拮抗剂、选择性雄激素受体调节剂、选择性雌激素受体调节剂、PDGF拮抗剂、TNF拮抗剂、IL-1拮抗剂、白细胞介素(例如，IL-12或IL-2)、IL-12R拮抗剂、毒素缀合的单克隆抗体、肿瘤抗原特异性单克隆抗体、艾比特思(Erbitux)、阿瓦斯丁 (Avastin)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、抗CD20抗体、美罗华(Rituxan)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、DXL625、赫赛汀或其任意组合。得自植物和细菌的毒性酶如篦麻毒素、白喉毒素和假单胞菌属毒素可以与治疗剂(例如，抗体)缀合以产生细胞类型特异性杀死试剂(Youle等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA77:5483(1980)； Gilliland等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77:4539(1980)；Krolick等人， Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77:5419(1980))。
其他细胞毒性剂包括细胞毒性核糖核酸酶，如Goldenberg在美国专利号6,653,104中所述。本发明的实施方案还涉及放射免疫缀合物，其中在使用或不使用复合物形成剂的情况下使发射α或β粒子的放射性核素稳定地偶联到抗体或其结合片段。这类放射性核素包括β- 发射体，诸如磷-32、钪-47、铜-67、镓-67、钇-88、钇-90、碘-125、碘-131、钐-153、镥-177、铼-186或铼-188，和α-发射体，诸如砹-211、铅-212、铋-212、铋-213或锕-225。
说明性的可检测部分还包括但不限于辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和荧光素酶。另外的示例性荧光物质包括但不限于若丹明(rhodamine)、荧光素、异硫氰酸荧光素、伞形酮、二氯三嗪基胺、藻红蛋白以及丹磺酰氯。其他示例性化学发光部分包括但不限于鲁米诺(luminol)。其他示例性生物发光物质包括但不限于荧光素(luciferin)和水母素(aequorin)。其他示例性放射性材料包括但不限于碘-125、碳-14、硫-35、氚和磷-32。
本文所述的任何额外剂的剂量以及给药方案可以取决于各种参数，所述参数包括但不限于人患者的一般健康状况，以及给药医师和 /或人患者的判断。共同施用可以是同时的或顺序的。本文所述的任何额外剂可以在施用核酸药物到有需要的人患者之前(例如，约5分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约 4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6 周、8周或约12周前)、与其同时或在其之后(例如、约5分钟、约15 分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约 6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约8周或约12周)施用。在各个实施方案中，本文所述的任何剂间隔约1分钟、间隔约10分钟、间隔约30分钟、间隔小于约1小时、间隔约1小时、间隔约1小时至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔不超过约24小时或间隔不超过约48小时施用。
在一个特定的实施方案中，组合方案设计成利用本发明的核酸药物给药和制剂快速(例如约6小时、或约12小时、或约24小时、或约30小时、或约36小时、或约48小时内)具有强效作用且这些作用可以持续约7天或更久的发现。
本文公开核酸药物的剂量。通常，任何有用的额外试剂的剂量是本领域技术人员已知的。例如，剂量可以参考以下文献确定： Physicians’Desk Reference，第66版，PDRNetwork；2012版(2011 年12月27日)，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，本发明允许患者接受超过参考Physicians’Desk Reference确定的剂量的剂量。本文所述的任何额外剂的剂量可以取决于若干因素，包括病况的严重程度、病况是否要治疗或预防以及待治疗的人患者的年龄、体重和健康状况。另外，关于具体人患者的药物基因组学(基因型对治疗剂的药代动力学、药效学或功效特征的影响)信息可以影响所用的剂量。此外，可以根据多种因素稍微调整确切的个体剂量，所述因素包括所施用的剂的特定组合、施用时间、施用途径、制剂的性质、排泄速率、正治疗的具体疾病、病症的严重程度和病症的解剖位置。可以预期剂量的一些变化。
细胞、组织、器官和生物体(包括但不限于人)具有若干可以抑制或阻止核酸递送的特征，包括例如角质层，其可以充当外来生物和核酸的屏障。因此，这些特征可以抑制包含核酸的治疗剂和化妆品的作用。现在已经发现，使用包括柔性膜和多个针的贴片可以规避或克服这些特征中的许多，并且这种贴片可以充当用于递送核酸的有效且安全的制品。因此，某些实施方案涉及一种核酸递送贴片。在一个实施方案中，核酸递送贴片包含柔性膜。在另一个实施方案中，核酸递送贴片包含多个针。在又另一个实施方案中，多个针连接到柔性膜。在一些实施方案中，贴片包含核酸。在一个实施方案中，核酸存在于溶液中。在一个实施方案中，多个针包括一个或多个具有内腔的针。在另一个实施方案中，贴片还包含第二柔性膜。在又另一个实施方案中，柔性膜和第二柔性膜布置成形成空腔。在另一个实施方案中，空腔含有核酸。在再另一个实施方案中，膜包含一个或多个孔，核酸可以穿过所述孔。在再另一个实施方案中，一个或多个孔和一个或多个具有内腔的针布置成允许含有核酸的溶液穿过所述一个或多个孔中的至少一个并穿过所述一个或多个具有内腔的针中的至少一个。在一些实施方案中，贴片被构造成将溶液递送到皮肤。在一个实施方案中，溶液包含核酸。在另一个实施方案中，溶液包含媒剂。在又另一个实施方案中，媒剂是脂质或类脂质。在再另一个实施方案中，媒剂是基于脂质的转染试剂。
细胞膜可以充当外来核酸的屏障。现在已经发现，将本发明的贴片与电场组合可以增加核酸递送的效率。因此，某些实施方案涉及一种包含多个针的核酸递送贴片，其中至少两个针形成高压电路的一部分。某些实施方案涉及一种用于微针递送的可植入“纹身(tattoo)”(参见，例如Nature Matenals 12，第367-376页(2013)，其内容以引用的方式整体并入本文)。在一个实施方案中，高压电路产生大于约10V 的电压。在另一个实施方案中，高压电路产生大于约20V的电压。在又另一个实施方案中，电场在两个针之间产生。在另一个实施方案中，电场的大小为至少约100V/cm。在再另一个实施方案中，电场的大小为至少约200V/cm。在一些实施方案中，贴片被构造成将核酸递送到表皮。在其他实施方案中，贴片被构造成将核酸递送到真皮。在再其他实施方案中，贴片被构造成将核酸递送到皮下组织。在再其他实施方案中，贴片被构造成将核酸递送到肌肉。某些实施方案涉及一种包含多个电极的核酸递送贴片。在一个实施方案中，多个电极连接到柔性膜。其他实施方案涉及一种包含刚性结构的核酸递送贴片。在一个实施方案中，多个电极连接到刚性结构。
在一些实施方案中，本文所述的组合物使用覆盖受试者的受影响区域的针阵列施用。在一些实施方案中，在施用后机械按摩治疗区域。在一些实施方案中，在施用后使治疗区域暴露于电脉冲。在一些实施方案中，电脉冲在约10V和约200V之间持续约50微秒至约1秒。在一些实施方案中，电脉冲由多电极阵列在治疗区域周围产生。
在一些实施方案中，本发明提供一种贴片递送系统，其包含封闭在膜内的非病毒RNA转染组合物，以及每约100cm2或更小、或约 50cm2或更小、或约10cm2或更小、或约5cm2或更小、或约1cm2或更小、或约0.5cm2或更小、或约0.2cm2或更小的治疗区域递送约 10ng至约2000ng RNA的递送针阵列。在一些实施方案中，非病毒转染组合物含有每约20μL至约1ml的注射体积约10ng至约2000 ng。在一些实施方案中，每个针递送在1μL和500μL之间的注射体积。
在一些实施方案中，递送贴片包含保持核酸药物的丙烯酸系储库。在一些实施方案中，添加硅粘合剂以产生微观浓缩药物细胞的半固体悬浮液。另外，一些实施方案提供一种贴片，所述贴片与一种或多种增强剂相关(这些增强剂包括而不限于离子电渗、超声波、包括凝胶的化学物质、微针、超声促渗、激光和电穿孔方法)。
在一些实施方案中，递送经由凝胶，任选地含有增强剂组合的水醇凝胶(例如，COMBIGEL(ANTARES PHARMA))实现。
在各个实施方案中，RNA使用针阵列递送。说明性的针阵列包括但不限于AdminPen600和美国专利号7,658,728、7,785,301和 8,414,548中描述的那些，其全部公开内容以引用的方式并入本文。针的其他实例包括例如3MTM中空微结构透皮系统和3M固体微结构透皮系统(sMTS)。参见，例如美国专利号3,034,507和3,675,766； Microneedles forTransdermal Drug Delivery.Advanced Drug Delivery Reviews.56:581-587(2004)；Pharm Res.2011年1月；28(1):31-40，其全部内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用微针和/或微针阵列。在各个实施方案中，微针和/或微针阵列可以是而不限于固体、RNA包被、溶解、可生物降解和/或中空的。在一些实施方案中，递送经由微针系统，任选地与在特定时间或根据需要递送药物的电子控制的微泵组合实现。例如，可以使用MACROFLUX(Alza)系统。
其他实施方案涉及一种用于将核酸体内递送到细胞的方法，其包括将核酸体内应用到含有细胞的组织。在一个实施方案中，所述方法还包括在细胞附近施加瞬态电场。在另一个实施方案中，方法引起细胞体内内化核酸。在又另一个实施方案中，核酸包括合成RNA。在另一个实施方案中，方法进一步引起细胞内化治疗或美容有效量的核酸。在一个实施方案中，细胞为皮肤细胞。在另一个实施方案中，细胞为肌肉细胞。在又另一个实施方案中，细胞为表皮成纤维细胞。在另一个实施方案中，细胞为角质形成细胞。在再另一个实施方案中，细胞为成肌细胞。在一些实施方案中，核酸包含关注的蛋白质。在一个实施方案中，关注的蛋白质为荧光蛋白。在另一个实施方案中，关注的蛋白质是细胞外基质蛋白质。在又另一个实施方案中，关注的蛋白质是以下组的成员：弹性蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、赖氨酰氧化酶、弹性蛋白结合蛋白、生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、粒细胞集落刺激因子、基质金属蛋白酶、肌动蛋白、肌原纤维蛋白、微纤维相关的糖蛋白、赖氨酰氧化酶样蛋白、血小板源性生长因子、脂酶、解偶蛋白、产热素、丝聚蛋白、成纤维细胞生长因子、抗体和参与色素产生的蛋白质。在一些实施方案中，所述方法还包括将核酸递送到表皮。在其他实施方案中，所述方法还包括将核酸递送到真皮。在再其他实施方案中，所述方法还包括递送核酸到真皮下。在一个实施方案中，递送通过注射进行。在另一个实施方案中，递送使用微针阵列注射进行。在又另一个实施方案中，递送通过局部施用进行。在另一个实施方案中，递送包括破坏或除去组织的一部分。在再另一个实施方案中，递送包括破坏或除去角质层。在一些实施方案中，核酸存在于溶液中。在一个实施方案中，溶液包含生长因子。在另一个实施方案中，生长因子是下组中的成员：成纤维细胞生长因子和转化生长因子。在又另一个实施方案中，生长因子是下组的成员：基础成纤维细胞生长因子和转化生长因子β。在其他实施方案中，溶液包含胆固醇。
在另一个实施方案中，所述方法还包括使细胞与一种或多种核酸分子接触。在又另一个实施方案中，所述一种或多种核酸分子中的至少一种编码关注的蛋白质。在另一个实施方案中，所述方法产生表达关注的蛋白质的细胞。在再另一个实施方案中，所述方法引起细胞表达治疗或美容有效量的关注的蛋白质。
在另一个实施方案中，使细胞与核酸分子接触。在又另一个实施方案中，所述方法使得细胞内化核酸分子。在另一个实施方案中，该方法引起细胞内化治疗或美容有效量的核酸分子。在一个实施方案中，核酸编码关注的蛋白质。在一个实施方案中，核酸分子包括下组的成员：dsDNA分子、ssDNA分子、RNA分子、dsRNA分子、ssRNA 分子、质粒、寡核苷酸、合成RNA分子，miRNA分子、mRNA分子和siRNA分子。在各个实施方案中，RNA包含一种或多种非规范核苷酸。
在一些实施方案中，本发明涉及美国专利号5,711,964、5,891,468、 6,316,260、6,413,544、6,770,291和7,390,780中描述的一种或多种施用技术，其全部内容以引用的方式整体并入本文。
本发明还提供可以简化本文所述的核酸药物和/或本文所述的任何额外剂的施用的试剂盒。本发明的说明性试剂盒包含在单位剂型中的核酸药物和/或本文所述的任何额外剂。在一个实施方案中，单位剂型是容器，诸如预填充注射器，其可以是无菌的，含有本文所述的任何剂和药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或媒剂。所述试剂盒还包含指导本文所述的任何剂的使用的标签或印刷说明书。所述试剂盒或所述试剂盒的一种或多种组分可以在室温、约4℃、约-20℃、约 -80℃或约-196℃下储存。所述试剂盒还可以包括盖子窥器、局部麻醉剂和施用位置的清洁剂。试剂盒还可以包含一种或多种本文所述的额外试剂。在一个实施方案中，试剂盒包含容器，所述容器含有有效量的如本文公开的核酸药物和有效量的另一种组合物如本文所述的额外剂。在一些实施方案中，单位剂型是预加载的(亦称预给药或预填充的)注射器或笔式针注射器(注射笔))。所述单位剂型可以包含有效剂量，例如约10ng至约2000ng，例如约10ng、或约20ng、或约 50ng、或约100ng、或约200ng、或约300ng、或约400ng、或约 500ng、或约600ng、或约700ng、或约800ng、或约900ng、或约1000ng、或约1100ng、或约1200ng、或约1300ng、或约1400ng、或约1500ng、或约1600ng、或约1700ng、或约1800ng、或约1900 ng、或约2000ng、或约3000ng、或约4000ng、或约5000ng的本文所述的核酸药物。
一些实施方案涉及具有低毒性和高翻译效率的合成RNA分子。其他实施方案涉及一种用于细胞的高效体内转染、重新编程和基因编辑的细胞培养基。其他实施方案涉及用于产生编码重新编程蛋白的合成RNA分子的方法。再另外的实施方案涉及用于产生编码基因编辑蛋白的合成RNA分子的方法。
一些实施方案涉及基因编辑和/或基因校正的方法。一些实施方案涵盖例如用包含非规范核苷酸的RNA如编码以下一种或多种的 RNA的基于合成RNA的基因编辑和/或基因校正：核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶、巨核酸酶、切口酶、聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白DNA修复蛋白、 DNA修饰蛋白、碱基修饰蛋白、DNA甲基转移酶、引起DNA去甲基化的蛋白质、DNA为底物的酶或其天然或工程改造的变体、家族成员、直向同源物、片段或融合构建体。在一些实施方案中，基因编辑和/或基因校正的效率高，例如高于基于DNA的基因编辑和/或基因校正。在一些实施方案中，本发明的基因编辑和/或基因校正方法对于体内应用而言足够高效。在一些实施方案中，本发明的基因编辑和/或基因校正方法足够高效，而不需要细胞选择(例如，选择已编辑的细胞)。在各个实施方案中，本发明方法的基因编辑效率为约1％、或约2％、或约3％、或约4％、或约5％、或约6％、或约7％、或约 8％、或约9％、或约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约 50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约100％。在各个实施方案中，本发明方法的基因校正效率为约1％、或约2％、或约3％、或约4％、或约5％、或约6％、或约7％、或约8％、或约9％、或约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约100％
一些实施方案涉及包含工程改造的核酸酶裂解或DNA修饰结构域的高效基因编辑蛋白。其他实施方案涉及包含工程改造的核酸酶裂解或DNA修饰结构域的高保真基因编辑蛋白。各个实施方案涉及包含工程改造的DNA结合结构域的高效基因编辑蛋白。其他实施方案涉及包含工程改造的DNA结合结构域的高保真基因编辑蛋白。再其他实施方案涉及包含工程改造的重复序列的基因编辑蛋白。一些实施方案涉及包含一个或多个CRISPR相关家族成员的基因编辑蛋白。一些实施方案涉及通过用基因编辑蛋白转染细胞或诱导细胞表达基因编辑蛋白来更改细胞的DNA序列的方法。其他实施方案涉及用于更改体外培养物中存在的细胞的DNA序列的方法。再另外的实施方案涉及用于更改体内存在的细胞的DNA序列的方法。
一些实施方案涉及调节多肽的分泌或亚细胞定位的方法。在这类实施方案中，本发明提供一种编码蛋白质的RNA，所述蛋白质包含与具有生物学功能的多肽可操作地连接的信号肽。在一个实施方案中，信号肽调节多肽的分泌。在另一个实施方案中，信号肽调节多肽的亚细胞定位。例如，包含至少一种FGF21信号肽的BMP7可以引起BMP7的分泌增加。在另一个实施例中，包含代替内源性BMP7 信号肽的至少一种FGF21信号肽的BMP7可以引起BMP7的分泌增加。在各个实施方案中，包含下表中列出的至少一种信号肽的表2A 或表2B中列出的任何蛋白质可以引起蛋白质的分泌增加。
一些实施方案涉及调节蛋白质的血清半衰期、分泌、生物利用度和/或活性的方法，其包括施用编码所述蛋白质的RNA和编码所述蛋白质的受体的RNA。例如，IL15可以与其受体如IL15RA一起施用，以增强IL15的血清半衰期、分泌、生物利用度和活性中的一种或多种。
当从体外转录的RNA翻译时，许多蛋白质和肽可以表现出由不完全或不充分翻译后加工引起的活性降低。现在已经发现，通过使细胞与第二蛋白质接触和/或诱导细胞表达第二蛋白质来增加RNA转染后产生的活性蛋白质、多肽或肽的量，所述第二蛋白质能够将多肽加工成所述蛋白质、肽或多肽。因此，某些实施方案涉及一种用于诱导细胞表达活性蛋白质、多肽或肽的方法，其包括使所述细胞与编码第一多肽的合成RNA分子接触，和使所述细胞与能够将所述第一多肽加工成活性蛋白质、多肽或肽的第二蛋白质接触。
在某些实施方案中，将第二蛋白质施用到患者。在一个实施方案中，第二蛋白质是重组蛋白质。在另一个实施方案中，使细胞与编码第二蛋白质的合成RNA分子接触。在另一个实施方案中，使细胞与抑制第二蛋白质的分子的抑制剂接触和/或诱导细胞表达所述抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂是短干扰RNA分子。
在某些实施方案中，第二蛋白质是PCSK家族的成员。在其他实施方案中，第二蛋白质是前蛋白转化酶。在再其他实施方案中，第二蛋白质是激素原转化酶。在再其他实施方案中，第二蛋白质是羧肽酶。在一个实施方案中，第二蛋白质是PCSK3(弗林蛋白/PACE)。在另一个实施方案中，第二蛋白质主要是分泌的。在又另一个实施方案中，第二蛋白质主要是细胞内的。在另一个实施方案中，第一多肽、蛋白质、多肽或肽选自以下组：促阿黑皮素原产物、肾素、脑啡肽产物、强啡肽原产物、生长抑素、胰岛素、刺鼠相关肽、胰高血糖素、甲状旁腺激素、转化生长因子β超家族成员、白蛋白、β-分泌酶1、神经生长因子、钙调素结合蛋白、α-整合素、因子IX、α-黑色素细胞刺激激素、促肾上腺皮质激素、β-内啡肽和蛋氨酸脑啡肽。
糖化和糖基化是通过其使一个或多个糖分子键合至蛋白质的方法。现在已经发现，更改糖化和糖基化位点的数量或位置可以增加或降低蛋白质的稳定性。因此，某些实施方案涉及一种具有一个或多个糖化或糖基化位点的蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质经工程改造以具有比蛋白质的天然变体多的糖化或糖基化位点。在另一个实施方案中，蛋白质经工程改造以具有比蛋白质的天然变体少的糖化或糖基化位点。在又另一个实施方案中，蛋白质具有增加的稳定性。在又另一个实施方案中，蛋白质具有降低的稳定性。在一些实施方案中，蛋白质是循环蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质是促红细胞生成素或其生物活性片段、变体、类似物或家族成员。在另一个实施方案中，蛋白质是阿法达贝泊汀或其生物活性片段、变体、类似物或家族成员。在另一个实施方案中，蛋白质是NOVEPOETIN或其生物活性片段、变体、类似物或家族成员。
已经进一步发现，在某些情况下，在转染培养基中包括一种或多种类固醇和/或一种或多种抗氧化剂可以增加体内转染效率、体内重新编程效率和体内基因编辑效率。因此，某些实施方案涉及使细胞或患者与糖皮质激素如氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲基强的松龙、地塞米松或倍他米松接触。其他实施方案涉及一种通过使细胞与含有类固醇的培养基接触并使所述细胞与一种或多种核酸分子接触来诱导所述细胞表达关注的蛋白质的方法。在一个实施方案中，核酸分子包括合成RNA。在另一个实施方案中，类固醇是氢化可的松。在又另一个实施方案中，氢化可的松以在约0.1uM和约10uM之间、或约1uM的浓度存在于培养基中。其他实施方案涉及一种通过使细胞与含有抗氧化剂的培养基接触并使所述细胞与一种或多种核酸分子接触而在体内诱导所述细胞表达关注的蛋白质的方法。在一个实施方案中，抗氧化剂是抗坏血酸或抗坏血酸-2-磷酸。在另一个实施方案中，抗坏血酸或抗坏血酸-2-磷酸以在约0.5mg/L和约500mg/L之间(包括约50mg/L)的浓度存在于培养基中。再其他实施方案涉及一种通过使细胞与含有类固醇和/或抗氧化剂的培养基接触并使所述细胞与一种或多种核酸分子接触而用于体内重新编程和/或基因编辑所述细胞的方法，其中所述一种或多种核酸分子编码一种或多种重新编程和/或基因编辑蛋白。在某些实施方案中，细胞存在于生物体中，并且将类固醇和/或抗氧化剂递送到生物体。
已经报道在某些情况下将转铁蛋白添加到复合培养基中来增加质粒转染的效率。现在已经发现，向复合培养基中添加转铁蛋白也可以增加用合成RNA分子进行体内转染的效率。因此，某些实施方案涉及一种通过将一种或多种合成RNA分子和转染试剂添加到含有转铁蛋白的溶液中来体内诱导所述细胞表达关注的蛋白质的方法。在一个实施方案中，转铁蛋白以在约1mg/L至约100mg/L之间，诸如约 5mg/L的浓度存在于溶液中。在另一个实施方案中，转铁蛋白是重组的。
在某些情况下包括，关于培养，可能希望用非动物来源和/或重组组分替换动物来源组分，部分地因为非动物来源和/或重组组分可以以比动物来源组分高的一致性程度生产，并且部分地因为非动物来源和/或重组组分携带比动物来源组分低的被毒性和/或致病物质污染的风险。因此，某些实施方案涉及一种非动物来源和/或重组的蛋白质。其他实施方案涉及一种培养基，其中所述培养基的一些或所有组分为非动物来源和/或重组的。
其他实施方案涉及一种用于体内转染细胞的方法。在一个实施方案中，用一种或多种核酸体内转染细胞，并且使用转染试剂如基于脂质的转染试剂执行转染。在一个实施方案中，一种或多种核酸包括至少一种RNA分子。在另一个实施方案中，细胞用一种或多种核酸转染，并且所述一种或多种核酸编码以下至少一种：p53、TERT、抗体、细胞外基质蛋白、细胞因子、分泌蛋白、膜结合蛋白、酶、基因编辑蛋白、染色质修饰蛋白、DNA结合蛋白、转录因子、组蛋白脱乙酰酶、病原体相关分子模式和肿瘤相关抗原或其生物活性片段、类似物、变体或家族成员。在另一个实施方案中，重复地转染细胞，诸如在连续约10天期间转染至少约2次，或在连续约7天期间转染至少约3 次，或在连续约6天期间转染至少约4次。一些实施方案涉及一种用于增加端粒酶在成纤维细胞、造血干细胞、间充质干细胞、心脏干细胞、毛囊干细胞、神经干细胞、肠干细胞、内皮干细胞、嗅干细胞、神经嵴干细胞、睾丸细胞和角质形成细胞中的一种中表达的方法。一些实施方案涉及一种用于增加端粒酶在成纤维细胞、造血干细胞、间充质干细胞、心脏干细胞、毛囊干细胞、神经干细胞、肠干细胞、内皮干细胞、嗅干细胞、神经嵴干细胞、睾丸细胞和角质形成细胞中的一种中的长度的方法。其他实施方案涉及一种用于从患者中分离细胞、使细胞与编码端粒酶组分(例如，TERT)的核酸药物接触以及将细胞重新引入患者的方法。各个实施方案涉及一种用于增加细胞的复制潜力的方法。
可以通过用编码一种或多种重新编程因子的一种或多种核酸转染细胞来执行重新编程。重新编程因子的实例包括但不限于：Oct4 蛋白、Sox2蛋白、Klf4蛋白、c-Myc蛋白、l-Myc蛋白、TERT蛋白、 Nanog蛋白、Lin28蛋白、Utf1蛋白、Aicda蛋白、miR200微RNA、miR302微RNA、miR367微RNA、miR369微RNA及其生物活性片段、类似物、变体和家族成员。因此，某些实施方案涉及一种用于体内重新编程细胞的方法。在一个实施方案中，通过用编码一种或多种重新编程因子的一种或多种核酸转染细胞来使细胞体内重新编程。在一个实施方案中，一种或多种核酸包括编码Oct4蛋白的RNA分子。在另一个实施方案中，一种或多种核酸还包括编码Sox2蛋白、Klf4 蛋白和c-Myc蛋白的一种或多种RNA分子。在又另一个实施方案中，一种或多种核酸还包括编码Lin28蛋白的RNA分子。在一个实施方案中，细胞为人皮肤细胞，并且将人皮肤细胞重新编程为多能干细胞。在另一个实施方案中，细胞为人皮肤细胞，并且将人皮肤细胞重新编程为葡萄糖应答性胰岛素产生细胞。可以被重新编程的其他细胞和细胞可以被重新编程为其他细胞的实例包括但不限于：皮肤细胞、多能干细胞、间质干细胞、β-细胞、视网膜色素上皮细胞、造血细胞、心脏细胞、气道上皮细胞、神经干细胞、神经元、神经胶质细胞、骨细胞、血细胞以及牙髓干细胞。在一个实施方案中，使细胞与支持重新编程细胞的培养基接触。在一个实施方案中，培养基还支持细胞。
重要地，已经报道用编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒感染皮肤细胞与在支持心肌细胞生长的培养基中培养细胞组合促使皮肤细胞重新编程为心肌细胞，而无需首先将皮肤细胞重新编程为多能干细胞(参见Efs等人，Nat Cell Biol.2011；13:215-22，其内容以引用的方式并入本文)。在某些情况下，可能希望直接重新编程(将一种体细胞重新编程为另一种体细胞而不首先将体细胞重新编程为多能干细胞，也称为“转分化”)，部分地因为培养多能干细胞可以是耗时且昂贵的，涉及建立和表征稳定的多能干细胞系的额外处理会带来增加污染的风险，并且与首次产生多能干细胞相关的额外培养时间会带来增加的基因组不稳定性和获得突变(包括点突变、拷贝数变异和核型异常)的风险。因此，某些实施方案涉及一种用于体内重新编程体细胞的方法，其中将细胞重新编程为体细胞，并且其中不产生特征化多能干细胞系。
进一步发现，在某些情况下，与根据其他方法相比，根据本发明的方法重新编程细胞可能需要更少的总转染。因此，某些实施方案涉及一种用于体内重新编程细胞的方法，其中在连续约20天内执行约1次和约12次之间的转染，或者在连续约15天内执行约4次和约10次之间转染，或者在连续约10天内执行约4次和约8次之间的转染。已经认识到，当使细胞与含有核酸分子的培养基接触时，细胞可能同时或在不同时间与多于一种核酸分子接触和/或内化多于一种核酸分子。因此，可以使细胞与核酸接触不止一次，例如，反复接触，甚至当细胞仅与含有核酸的培养基接触一次时。
值得注意的是，核酸可以含有一个或多个如本文所述的非规范或“修饰的”残基。例如，本文所述的任何非规范核苷酸均可以用于本发明的重新编程方法中。在一个实施方案中，假尿苷-5'-三磷酸可以在体外转录反应中取代尿苷-5'-三磷酸以产生合成RNA，其中合成RNA 的高达100％的尿苷残基可以用假尿苷残基替换。即使当假尿苷和5- 甲基胞苷分别完全取代尿苷和胞苷时，体外转录也可以产生具有残留免疫原性的RNA(参见，例如Angel.使用RNA将人体细胞重新编程为多能性(Reprogramming Human Somatic Cells toPluripotency Using RNA)[博士论文]。Cambridge,MA:MIT；2011，其内容以引用的方式并入本文)。出于这个原因，当用RNA转染细胞时，将免疫抑制剂添加至转染培养基中是常见的。在某些情况下，将免疫抑制剂添加至转染培养基中可能是不希望的，部分地因为最常用于该目的的重组免疫抑制剂B18R会是昂贵的并且难以制造。现在已经发现，可以根据本发明的方法体内转染和/或重新编程细胞，而不使用B18R或任何其他免疫抑制剂。进一步发现，在不使用免疫抑制剂的情况下，根据本发明的方法在体内重新编程细胞可以是快速、高效且可靠的。因此，某些实施方案涉及一种用于体内转染细胞的方法，其中转染培养基不含免疫抑制剂。其他实施方案涉及一种用于体内重新编程细胞的方法，其中转染培养基不含免疫抑制剂。在某些情况下，例如当使用高细胞密度时，将免疫抑制剂添加至转染培养基中可能是有益的。因此，某些实施方案涉及一种用于体内转染细胞的方法，其中转染培养基含有免疫抑制剂。其他实施方案涉及一种用于体内重新编程细胞的方法，其中转染培养基含有免疫抑制剂。在一个实施方案中，免疫抑制剂是B18R或其生物活性片段、类似物、变体或家族成员或地塞米松或其衍生物。在一个实施方案中，转染培养基不含免疫抑制剂，并且选择核酸剂量以防止过度毒性。在另一个实施方案中，核酸剂量小于约1 mg/cm2组织或小于约1mg/100,000个细胞或小于约10mg/kg。
根据本发明的某些实施方案产生的重新编程的细胞适于治疗和/ 或美容应用，因为它们不含不希望的外源DNA序列，并且它们不暴露于动物来源或人来源的产物，其可能是不确定的，并且可能含有毒性和/或致病性污染物。此外，本发明的某些实施方案的高速度、效率和可靠性可以减少获得和积聚突变和其他染色体异常的风险。因此，本发明的某些实施方案可以用于产生具有足以用于治疗和/或美容应用的安全性特征的细胞。例如，使用本发明的RNA和培养基重新编程细胞(其中培养基不含动物来源或人来源的组分)可以产生尚未暴露于异源材料的细胞。因此，某些实施方案涉及一种具有希望的安全性特征的重新编程的细胞。在一个实施方案中，重新编程的细胞具有正常核型。在另一个实施方案中，相对于患者基因组，重新编程的细胞具有小于约5个拷贝数变化(CNV)，诸如相对于患者基因组小于约3个拷贝数变化，或相对于患者基因组没有拷贝数变化。在又另一个实施方案中，相对于患者基因组，重新编程的细胞在编码区具有正常核型和小于约100个单核苷酸变体，或相对于患者基因组在编码区具有小于约50个单核苷酸变体，或相对于患者基因组在编码区具有小于约10个单核苷酸变体。
内毒素和核酸酶可以共同纯化和/或变得与其他蛋白质如血清白蛋白缔合。具体地讲，重组蛋白可以经常具有高水平的缔合内毒素和核酸酶，部分地归因于在它们的产生期间可以发生细胞的溶解。可以通过本发明的许多方法减少、除去、替换或以另外的方式灭活内毒素和核酸酶，所述方法包括例如通过乙酰化；通过添加稳定剂如辛酸钠，接着通过热处理；通过将核酸酶抑制剂添加至白蛋白溶液和/或培养基中；通过结晶；通过与一种或多种离子交换树脂接触；通过与木炭接触；通过制备型电泳或通过亲和色谱法。现在已经发现，部分或完全减少、除去、替换或以另外的方式灭活来自培养基和/或来自培养基的一种或多种组分的内毒素和/或核酸酶可以增加可转染和重新编程细胞的效率。因此，某些实施方案涉及一种用一种或多种核酸体内转染细胞的方法，其中处理转染培养基以部分或完全减少、除去、替换或以其他方式灭活一种或多种内毒素和/或核酸酶。其他实施方案涉及一种引起核酸最小程度降解的培养基。在一个实施方案中，培养基含有低于约1EU/mL、或低于约0.1EU/mL、或低于约0.01EU/mL。
在某些情况下，基于蛋白质的脂质载剂如血清白蛋白可以用基于非蛋白质的脂质载剂如甲基-β-环糊精替换。本发明的培养基也可以在没有脂质载剂的情况下使用，例如，当使用可能不需要或可能不受益于脂质载剂的存在的方法，例如，使用一种或多种基于脂质的转染试剂、基于聚合物的转染试剂或基于肽的转染试剂或使用电穿孔执行转染时。许多与蛋白质缔合的分子如金属可能对细胞有很高的体内毒性。该毒性可以促使活力降低以及获得突变。因此，某些实施方案具有产生不含毒性分子的细胞的额外益处。
可以通过将蛋白质悬浮在溶液中并且测量溶液的电导率来测量蛋白质的缔合分子组分。因此，某些实施方案涉及一种含有蛋白质的培养基，其中蛋白质的约10％水溶液具有小于约500pmho/cm的电导率。在一个实施方案中，溶液具有小于约50pmho/cm的电导率。在另一个实施方案中，小于约0.65％的蛋白质干重包含脂质和/或小于约 0.35％的蛋白质干重包含游离脂肪酸。
可以增加体内递送到细胞的核酸的量以增加核酸的期望作用。然而，体内递送到细胞的核酸的量增加到超过某一点可以引起细胞活力降低，部分地归因于转染试剂的毒性。现在已经发现，当核酸以固定体积(例如，组织区域中的细胞)体内递送到细胞群时，递送到每个细胞的核酸量可以取决于递送到细胞群的核酸总量和细胞密度，其中较高的细胞密度引起递送到每个细胞的核酸较少。在某些实施方案中，用一种或多种核酸体内转染细胞多于一次。在某些条件下，例如当细胞正在增殖时，细胞密度可能在一次转染至下一次转染之间变化。因此，某些实施方案涉及一种用核酸体内转染细胞的方法，其中所述细胞被转染多于一次，并且其中递送到细胞的核酸的量对于两次转染是不同的。在一个实施方案中，细胞在两次转染之间增殖，并且对于两次转染的第二次而言，递送到细胞的核酸的量比对于这两次转染的第一次而言更大。在另一个实施方案中，转染细胞多于两次，并且对于三次转染的第二次而言递送到细胞的核酸的量比对于相同的三次转染的第一次而言更大，并且对于相同的三次转染的第三次而言递送到细胞的核酸的量比对于相同的三次转染的第二次而言更大。在又另一个实施方案中，转染细胞多于一次，并且对于至少两次连续的转染而言，在每次转染期间递送到细胞的核酸的最大量足够低以产生至少约 80％活力。
现在已经发现，在一系列转染中调节体内递送到增殖细胞群的核酸的量可以引起核酸的增加作用和细胞活力增加。进一步发现，在某些情况下，当细胞与一系列转染中编码一种或多种重新编程因子的一种或多种核酸体内接触时，对于系列转染中的至少一部分而言，当随后转染中递送的核酸量大于先前转染中递送的核酸量时，重新编程效率可以增加。因此，某些实施方案涉及一种用于体内重新编程细胞的方法，其中一种或多种核酸在一系列转染中重复递送到细胞，并且对于至少一次随后转染而言递送到细胞的核酸的量比至少一次先前转染而言更大。在一个实施方案中，转染细胞约2次和约10次之间、或约3次和约8次之间、或约4次和约6次之间。在另一个实施方案中，一种或多种核酸包括至少一种RNA分子，所述细胞被转染约2 次和约10次之间，并且在每次转染中递送到细胞的核酸量与最近的先前转染中递送到细胞的核酸量相比相同或更大。在又另一个实施方案中，在第一次转染中递送到细胞的核酸量在约20ng/cm2和约250 ng/cm2之间、或在100ng/cm2和600ng/cm2之间。在又另一个实施方案中，细胞以约12小时和约48小时之间的间隔转染约5次，并且第一次转染时递送到细胞的核酸量为约25ng/cm2，第二次转染时递送到细胞的核酸量为约50ng/cm2，第三次转染时递送到细胞的核酸量为约100ng/cm2，第四次转染时递送到细胞的核酸量为约200ng/cm2，且第五次转染时递送到细胞的核酸量为约400ng/cm2。在又另一个实施方案中，在第五次转染后，细胞被进一步转染至少一次，并且递送到细胞的核酸量为约400ng/cm2。
某些实施方案涉及一种用核酸在体内转染细胞的方法，其中通过测量细胞密度并基于细胞密度的测量选择待转染的核酸的量来确定核酸的量。在一个实施方案中，细胞密度通过光学手段测量。在另一个实施方案中，重复地转染细胞，细胞密度在两次转染之间有所增加，并且对于两次转染的第二次而言转染的核酸的量比对于两次转染的第一次而言更大。
现在已经发现，在某些情况下，通过在多个施用部位向患者施用核酸，可以增加患者体内产生的循环蛋白的量。在某些实施方案中，相对于通过在单个注射部位向患者施用核酸而在患者中产生的循环蛋白的量而言，循环蛋白的量增加。在一个实施方案中，施用通过注射进行。在另一个实施方案中，注射是皮内注射。在再另一个实施方案中，注射是皮下或肌肉内注射。在一些实施方案中，多个施用部位包括皮肤中的施用部位。在其他实施方案中，所述多个施用部位为至少约1、或至少约2、或至少约5、或至少约10、或至少约20、或至少约50、或至少约100个施用部位。在一个实施方案中，施用在至少约5分钟、或至少约10分钟、或至少约30分钟、或至少约1小时、或至少约2小时、或至少约5小时、或至少约12小时、或至少约1 天内执行。在某些实施方案中，循环蛋白的量增加至少约10％、或至少约20％、或至少约50％、或至少约100％、或至少约3倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约20倍、或至少约50倍、或至少约100倍、或至少约500倍、或至少约1000倍、或大于1000倍。
现在已经发现，在某些情况下，通过调节培养基可以改善与本发明培养基接触的细胞的体内转染效率和活力。因此，某些实施方案涉及一种用于调节培养基的方法。其他实施方案涉及一种被调节的培养基。在一个实施方案中，供给者为成纤维细胞，并且培养基被调节约 24小时。其他实施方案涉及一种用于体内转染细胞的方法，其中调节转染培养基。其他实施方案涉及一种用于体内重新编程和/或基因编辑细胞的方法，其中调节培养基。在一个实施方案中，例如通过暴露于化学品如丝裂霉素-C或通过暴露于γ辐射使供给者通过有丝分裂而灭活。在某些实施方案中，仅使用自体材料可能是有益的，部分地，例如并且不希望受理论束缚，避免疾病从供给者传递到细胞或患者的风险。因此，某些实施方案涉及一种体内转染细胞的方法，其中调节转染培养基，并且其中供给者与被转染的细胞来源于相同的个体。其他实施方案涉及一种用于体内重新编程和/或基因编辑细胞的方法，其中调节培养基，并且其中供给者与正重新编程和/或基因编辑的细胞来源于相同的个体。
可以通过调节将若干分子添加至培养基中。因此，某些实施方案涉及一种补充有存在于调节的培养基中的一种或多种分子的培养基。在一个实施方案中，培养基补充有Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a或其生物活性片段、类似物、变体、激动剂或家族成员。在另一个实施方案中，培养基补充有TGF-β或其生物活性片段、类似物、变体、激动剂或家族成员。在又另一个实施方案中，根据本发明的方法体内重新编程细胞，其中培养基不补充TGF-β持续约1天至约5天，然后补充TGF-β至少约2天。在又另一个实施方案中，培养基补充有IL-6、 IL-6R或其生物活性片段、类似物、变体、激动剂或家族成员。在又另一个实施方案中，培养基补充有鞘脂或脂肪酸。在再另一个实施方案中，鞘脂是溶血磷脂酸、溶血神经鞘磷脂、鞘氨醇-1-磷酸或其生物活性类似物、变体或衍生物。
除了通过有丝分裂灭活细胞之外，在某些条件下，辐射可以改变细胞的基因表达，促使细胞产生更少的某些蛋白质和更多的非辐射细胞的某些其他蛋白质，例如蛋白质的Wnt家族的成员。另外，蛋白质的Wnt家族的某些成员可以促进细胞的生长和转化。现在已经发现，在某些情况下，通过使细胞在体内与使用经辐射的供给者而不是丝裂霉素-c处理的供给者调节的培养基接触，可以大大增加重新编程的效率。进一步发现，当使用经辐射的供给者时观察到的重新编程效率的增加部分地由供给者分泌的Wnt蛋白引起。因此，某些实施方案涉及一种体内重新编程细胞的方法，其中使细胞与Wnt1、Wnt2、 Wnt3、Wnt3a或其生物活性片段、类似物、变体、家族成员或激动剂接触，所述激动剂包括Wnt蛋白质的下游靶标的激动剂和/或模拟 Wnt蛋白质的一种或多种生物学作用的剂，例如2-氨基-4-[3,4-(亚甲基二氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶。
由于许多基于DNA的重新编程方法的低效率，这些方法可能难以或不可能与来源于患者样品的细胞一起使用，所述患者样品可能仅含有少量的细胞。相比之下，本发明的某些实施方案的高效率可以允许少量细胞(包括单细胞)的可靠重新编程。某些实施方案涉及一种用于重新编程少量细胞的方法。其他实施方案涉及一种用于重新编程单个细胞的方法。在一个实施方案中，使细胞与一种或多种酶接触。在另一个实施方案中，所述酶为胶原酶。在又另一个实施方案中，胶原酶为无动物组分的。在一个实施方案中，胶原酶以约0.1mg/mL和约10mg/mL之间、或约0.5mg/mL和约5mg/mL之间的浓度存在。在另一个实施方案中，细胞为血细胞。在又另一个实施方案中，使细胞与含有一种或多种源自患者血液的蛋白质的培养基接触。在再另一个实施方案中，使细胞与培养基接触，所述培养基包含：DMEM/F12 +2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺+约5％和约25％之间的患者源性血清、或约10％和约20％之间的患者源性血清、或约20％患者源性血清。
现在已经发现，在某些情况下，使用本发明的培养基用编码Oct4、 Sox2、Klf4和c-Myc的RNA的混合物在体内转染细胞可以引起细胞增殖速率增加。当递送到细胞的RNA的量太低而不能确保所有细胞被转染时，仅一部分细胞可以显示出增加的增殖速率。在某些情况下，诸如当产生个性化治疗剂时，增加细胞的增殖速率可能是所希望的，部分地因为这样做可以减少产生治疗剂所需要的时间，并且因此可以减少治疗剂的成本。因此，某些实施方案涉及一种用编码Oct4、Sox2、 Klf4和c-Myc的RNA的混合物在体内转染细胞的方法。在一个实施方案中，细胞表现出增加的增殖速率。在另一个实施方案中，重新编程细胞。
许多疾病与一种或多种突变相关。通过使细胞与编码蛋白质的核酸接触来校正突变，所述蛋白质单独或与其他分子组合校正突变(基因编辑的实例)。这类蛋白质的实例包括：核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶、巨核酸酶、切口酶、聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白、DNA修复蛋白、DNA修饰蛋白、碱基修饰蛋白、DNA甲基转移酶、引起DNA去甲基化的蛋白质、DNA为底物的酶或其天然或工程改造的变体、家族成员、直向同源物、片段或融合构建体。因此，某些实施方案涉及一种用核酸在体内转染细胞的方法，其中所述核酸编码蛋白质，所述蛋白质单独或与其他分子组合在DNA分子中产生单链或双链断裂。在一个实施方案中，蛋白质为锌指核酸酶或TALEN。在另一个实施方案中，核酸为RNA分子。在又另一个实施方案中，单链或双链断裂在选自以下组的基因的转录起始位点的约5,000,000个碱基内：SERPINA1、 CCR5、CXCR4、GAD1、GAD2、CFTR、HBA1、HBA2、HBB、HBD、 FANCA、XPA、XPB、XPC、ERCC2、POLH、HTT、DMD、SOD1、 APOE、PRNP、BRCA1和BRCA2或其类似物、变体或家族成员。在一个实施方案中，本发明涉及基因编辑MYC蛋白(例如，校正可以与癌症相关的一种或多种突变)，任选地具有TALEN。在又另一个实施方案中，细胞用核酸转染，所述核酸通过促使在单链或双链断裂区域中插入DNA序列或通过促使在单链或双链断裂区域中的DNA序列以其他方式改变而充当修复模板。在又另一个实施方案中，基因编辑蛋白含有DNA修饰结构域。在又另一个实施方案中，基因编辑蛋白校正突变而不产生单链断裂。在又另一个实施方案中，基因编辑蛋白校正突变而不产生双链断裂。在又另一个实施方案中，基因编辑蛋白通过促使一个碱基用另一个碱基替换来校正突变。在一个实施方案中，腺嘌呤被胞嘧啶替换。在另一个实施方案中，腺嘌呤被鸟嘌呤替换。在又另一个实施方案中，腺嘌呤被胸腺嘧啶替换。在又另一个实施方案中，胞嘧啶被腺嘌呤替换。在又另一个实施方案中，胞嘧啶被鸟嘌呤替换。在又另一个实施方案中，胞嘧啶被胸腺嘧啶替换。在又另一个实施方案中，鸟嘌呤被腺嘌呤替换。在又另一个实施方案中，鸟嘌呤被胞嘧啶替换。在又另一个实施方案中，鸟嘌呤被胸腺嘧啶替换。在又另一个实施方案中，胸腺嘧啶被腺嘌呤替换。在又另一个实施方案中，胸腺嘧啶被胞嘧啶替换。在又另一个实施方案中，胸腺嘧啶被鸟嘌呤替换。在一个实施方案中，用另一种碱基替换一种碱基是一步过程。在另一个实施方案中，用另一种碱基替换一种碱基是多步骤过程。在一些实施方案中，一种碱基被多于一种碱基替换，例如，被两种碱基替换。在其他实施方案中，多于一种碱基被一种碱基替换。在再其他实施方案中，多于一种碱基被多于一种碱基替换。在一些实施方案中，基因编辑蛋白含有脱氨酶结构域。在一个实施方案中，脱氨酶结构域包含胞苷脱氨酶结构域。在另一个实施方案中，脱氨酶结构域包含腺苷脱氨酶结构域。在又另一个实施方案中，脱氨酶结构域包含鸟苷脱氨酶结构域。在又另一个实施方案中，基因编辑蛋白包含与以下序列中的一个或多个至少约50％、或至少约60％、或至少约 70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％同源的序列：SEQ ID NO:587、588、589、590、591、592和593。在又另一个实施方案中，基因编辑蛋白包含连接子。在一个实施方案中，所述连接子为柔性连接子。在另一个实施方案中，连接子将脱氨酶结构域定位在靶碱基附近。在又另一个实施方案中，基因编辑蛋白使靶碱基脱氨化。在又另一个实施方案中，基因编辑蛋白包含糖基化酶-抑制剂结构域。在又另一个实施方案中，基因编辑蛋白包含糖基化酶-抑制剂活性。在一个实施方案中，糖基化酶抑制剂是尿嘧啶糖基化酶抑制剂。在另一个实施方案中，糖基化酶抑制剂是N-甲基嘌呤DNA糖基化酶抑制剂。在又另一个实施方案中，重新编程细胞，并且随后基因编辑细胞。在又另一个实施方案中，基因编辑细胞，并且随后重新编程细胞。在又另一个实施方案中，在彼此约7天内执行基因编辑和重新编程。在又另一个实施方案中，同时或在同一天发生基因编辑和重新编程。在又另一个实施方案中，细胞是皮肤细胞，所述皮肤细胞经基因编辑以破坏CCR5基因，所述皮肤细胞经重新编程为造血干细胞，从而产生HIV/AIDS的治疗剂，并将所述治疗剂用于治疗HIV/AIDS患者。在又另一个实施方案中，皮肤细胞来源于用所述治疗剂治疗的同一患者。
某些实施方案涉及用于治疗罕见疾病的方法和组合物。在一些实施方案中，所述罕见疾病是以下疾病中的一种或多种：罕见的代谢疾病、罕见的心血管疾病、罕见的皮肤病、罕见的神经疾病、罕见的发育疾病、罕见的遗传疾病、罕见的肺病、罕见的肝脏疾病、罕见的肾脏疾病、罕见的精神疾病、罕见的生殖疾病、罕见的肌肉骨骼疾病、罕见的骨科疾病、先天性代谢缺陷、溶酶体贮积病和罕见的眼科疾病。在一个实施方案中，疾病是α-1抗胰蛋白酶缺乏症。一些实施方案涉及一种包含编码基因编辑蛋白的核酸的治疗，所述基因编码蛋白能够促使与以下一种或多种相关的基因的缺失：功能获得性突变、功能丧失性突变、隐性突变、显性突变或显性阴性突变。其他实施方案涉及一种包含编码基因编辑蛋白的核酸的治疗，所述基因编辑蛋白能够校正以下一种或多种：功能获得性突变、功能丧失性突变、隐性突变、显性突变或显性阴性突变。在一个实施方案中，治疗减轻受试者中的一种或多种症状。在另一个实施方案中，受试者是人受试者。在又另一个实施方案中，受试者是兽医受试者。一些实施方案涉及一种对于α-1抗胰蛋白酶缺乏症的治疗，其包括向受试者施用包含能够在 SERPINA1基因中或其附近引起缺失的基因编辑蛋白的核酸。其他实施方案涉及一种对于α-1抗胰蛋白酶缺乏症的治疗，其包括向受试者施用编码能够校正SERPINA1基因中或其附近的突变的基因编辑蛋白的核酸。在一个实施方案中，突变是Z突变。在一个实施方案中，缺失或校正减少受试者细胞中聚合的α-1抗胰蛋白酶蛋白的积聚和/ 或增加来自受试者细胞的α-1抗胰蛋白酶的分泌。在另一个实施方案中，治疗的细胞再生患病器官。在又另一个实施方案中，患病器官是肝脏。在又另一个实施方案中，患病器官是肺。在又另一个实施方案中，治疗延迟或消除受试者对肝脏和/或肺移植的需要。其他实施方案涉及一种对于大疱性表皮松解症的治疗。在一个实施方案中，大疱性表皮松解症是营养不良性大疱性表皮松解症。在另一个实施方案中，大疱性表皮松解症是单纯性大疱性表皮松解症。在又另一个实施方案中，营养不良性大疱性表皮松解症是隐性营养不良性大疱性表皮松解症。在一些实施方案中，所述治疗包括向受试者施用编码能够校正COL7A1基因中或其附近的突变的基因编辑蛋白的核酸。在一个实施方案中，校正增加受试者细胞产生的功能性胶原蛋白VII的量。在另一个实施方案中，治疗减少皮肤损伤和/或水疱复发的大小、严重程度和/或频率。再其他实施方案涉及一种对于原发性高草酸尿症的治疗。在一个实施方案中，原发性高草酸尿症是I型原发性高草酸尿症。在另一个实施方案中，所述治疗包括向受试者施用编码能够校正AGXT基因中或其附近的突变的基因编辑蛋白的核酸。在又另一个实施方案中，治疗延迟或消除受试者对肾脏和/或肝脏移植的需要。
可以根据本发明的方法编辑以产生本发明的治疗剂的基因包括可以被编辑以恢复正常功能的基因以及可以被编辑以减少或消除功能的基因。这类基因包括但不限于α-1抗胰蛋白酶(SERPINA1)，其中的突变可以引起α-1抗胰蛋白酶缺乏；β球蛋白(HBB)，其中的突变可以引起镰状细胞病(SCD)和β-地中海贫血；早期发作乳癌1 (BRCA1)和早期发作乳癌2(BRCA2)，其中的突变可以增加对乳癌的敏感性；5型C-C趋化因子受体(CCR5)和4型C-X-C趋化因子受体 (CXCR4)，其中的突变可以赋予HIV感染抗性；囊性纤维化跨膜传导性调节因子(CFTR)，其中的突变可以引起囊性纤维变性；肌萎缩蛋白 (DMD)，其中的突变可以引起肌肉萎缩，包括迪谢内肌营养不良 (Duchenne muscular dystrophy)和贝克尔肌肉萎缩(Becker's muscular dystrophy)；谷氨酸脱羧酶1和谷氨酸脱羧酶2(GAD1、GAD2)，其中的突变可以防止β-细胞的自体免疫破坏；血红蛋白α1、血红蛋白α2 和血红蛋白δ(HBA1、HBA2和HBD)，其中的突变可以引起地中海贫血；桥粒斑蛋白、角蛋白5、角蛋白14、网蛋白、整合素α-6、整合素β-4、层粘连蛋白亚基α-3、层粘连蛋白亚基β-3、层粘连蛋白亚基γ-2、VII型胶原蛋白α1、XVII型胶原蛋白α1和基质金属蛋白酶抑制剂-1(DSP、KRT5、KRT14、PLEC1、ITGA6、ITGB4、LAMA3、 LAMB3、LAMC2、COL7A1、COL17A1和MMP1)其中的突变可以引起大疱性表皮松解症；亨廷顿(Huntington，HTT)，其中的突变可以引起亨廷顿氏疾病；超氧化物歧化酶1(SOD1)，其中的突变可以引起肌萎缩性侧索硬化(ALS)；XPA、XPB、XPC、XPD(ERCC6)和聚合酶(DNA引导)、η(POLH)，其中的突变可以引起着色性干皮病；富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)，其中的突变可以引起帕金森氏病和范可尼贫血；补体组A、B、C、D1、D2、E、F、G、I、J、L、M、N、 P(FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、 FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCP) 和RAD51同系物C(啤酒酵母(S.cerevisiae))(RAD51C)，其中的突变可以引起范可尼贫血。
在一个特定的实施方案中，本发明涉及调节生长因子-分化因子 -15(GDF15)的方法。在一个特定的实施方案中，提供一种治疗方法，其中施用如本文所述的RNA以调节GDF15水平。在一些实施方案中， RNA编码GDF15。在一个特定的实施方案中，编辑的基因是生长因子-分化因子-15(GDF15)。在各个实施方案中，本发明涉及靶向和/ 或表达GDF15以治疗或预防疾病或病症，诸如代谢疾病或病症(例如，糖尿病(I型和II型)、胰岛素抵抗、肥胖、血脂异常、高胆固醇血症、高血糖、高胰岛素血症、高血压、肝细胞病如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪酸肝病(NAFLD)、癌症、与脂质代谢受损相关的疾病或病症、与肾功能受损相关的疾病或病症(例如，慢性肾病、肾病如糖尿病性肾病、肾衰竭)、与肝功能受损相关的疾病或病症、与肺功能受损相关的疾病或病症、血管或心血管疾病或病症(例如，冠状动脉病、心肌病、高血压、心房颤动、先兆子痫、外周动脉病、动脉粥样硬化、心力衰竭、急性心肌梗死、急性冠状动脉综合征、肌肉萎缩、高血压性心室肥厚、高血压性心肌病、缺血性心脏病、心肌梗塞、腹主动脉瘤、血凝块、深静脉血栓形成、静脉淤滞病、静脉炎、静脉曲张等)、肌肉萎缩、炎症和呼吸道疾病。在一个特定的实施方案中，靶向GDF15通过将脂质沉积物从肝脏和/或其他组织动员到循环中以用于代谢来改善脂质代谢。
在某些病症中，身体可以增加GDF15水平以试图抵消疾病状态的一个或多个消极方面。因此，某些实施方案涉及增加GDF15水平。在一个实施方案中，GDF15的血清水平增加。在另一个实施方案中，组织和/或器官中的GDF15水平增加。在又另一个实施方案中，降低ALT水平。在又另一个实施方案中，降低AST水平。在再另一个实施方案中，降低葡萄糖水平。在再另一个实施方案中，增加血清胆固醇水平。在再另一个实施方案中，增加血清甘油三酯水平。在又另一个实施方案中，减少食物摄入。在又另一个实施方案中，减轻体重。在另一个实施方案中，治疗改善对饮食和/或锻炼方案的依从性。
在一个特定的实施方案中，表达GDF15通过将脂质沉积物从肝脏和/或其他组织动员到循环中以用于代谢来改善脂质代谢。在一个特定的实施方案中，表达和/或靶向GDF15减少肝脏炎症。在一个特定的实施方案中，表达和/或靶向GDF15治疗或预防脂肪肝、NAFLD、NASH、炎症、肝炎、纤维化、肝硬化和肝细胞癌中的一种或多种。在一个特定的实施方案中，表达和/或靶向GDF15治疗或预防慢性肾病、急性肾损伤、肾病、糖尿病性肾病、肾衰竭和肾纤维化中的一种或多种。在一个特定的实施方案中，表达和/或靶向GDF15与表达和 /或靶向TGF-β超家族的另一成员组合通过将脂质沉积物从肝脏和/或其他组织动员到循环中用于代谢来改善脂质代谢，减少肝脏炎症，和 /或治疗或预防脂肪肝、NAFLD、NASH、炎症、肝炎、纤维化、肝硬化、肝细胞癌、慢性肾病、急性肾损伤、肾病、糖尿病性肾病、肾衰竭和肾纤维化中的一种或多种。某些实施方案涉及一种包含核酸的治疗剂。在一个实施方案中，核酸编码一种或多种基因编辑蛋白。其他实施方案涉及一种包含一种或多种细胞的治疗剂，所述细胞根据本发明的方法被在体内转染、重新编程和/或基因编辑。在一个实施方案中，细胞被转染、重新编程和/或基因编辑，并且转染、重新编程和/或基因编辑的细胞被引入到患者中。在另一个实施方案中，从转染、重新编程和/或基因编辑的细胞被引入其中的相同患者中收获细胞。可以用本发明的治疗剂治疗的疾病的实例包括但不限于阿尔茨海默氏病、脊髓损伤、肌萎缩侧索硬化、囊性纤维化、心脏病(包括缺血性和扩张性心肌病)、黄斑变性、帕金森氏病、亨廷顿氏病、糖尿病、镰状细胞贫血、地中海贫血、范可尼贫血、着色性干皮病、肌营养不良症、严重联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、癌症和HIV/AIDS。在某些实施方案中，治疗剂包括化妆品。在一个实施方案中，从患者收获细胞，将细胞重新编程并扩增至大量脂肪细胞以产生化妆品，并将化妆品引入患者体内。在再另一个实施方案中，化妆品用于组织重建。
当本文提供产生特定类型的细胞和产生包含特定类型的细胞的治疗剂的详细实例时，应该认识到本发明的方法可以例如通过根据本发明的方法重新编程细胞并且通过提供与发育期间存在于细胞微环境中的条件类似的条件在模拟发育的一个或多个方面的条件下培养细胞而用来产生许多其他类型的细胞和产生包含一种或多种许多其他类型的细胞的治疗剂。
某些实施方案涉及一种具有多种人白细胞抗原(HLA)类型的细胞文库(“HLA匹配文库”)。HLA匹配文库可能是有益的，部分原因是其可以提供治疗剂的快速产生和/或分配，而患者不必等待治疗剂自患者细胞产生。这类文库可能特别有益于化妆品的产生和治疗心脏病和血液和/或免疫系统的疾病，患者可以受益于治疗剂或化妆品的即时可利用性。
通过使细胞与基因编辑蛋白接触或通过诱导细胞表达基因编辑蛋白，可以更改细胞的DNA序列。然而，先前公开的基因编辑蛋白遭受低结合效率和过度脱靶活性，这可以在细胞的DNA中引入不希望的突变，严重限制其在体内，例如在治疗和美容应用中的用途，其中在患者细胞中引入不希望的突变可能导致癌症的发展。现在已经发现包含StsI内切核酸酶裂解结构域的基因编辑蛋白(SEQ ID NO:1)在体内可以表现出比先前公开的基因编辑蛋白显著更低的脱靶活性，同时在体内维持高水平的中靶(on-target)活性。还发现其他新型工程改造的蛋白，当其被用作以下基因编辑蛋白的核酸酶结构域时，其表现出高体内中靶活性，低体内脱靶活性，小尺寸、溶解性和其他所需特性：StsI-HA(SEQ ID NO:2)、StsI-HA2(SEQ ID NO:3)、StsI-UHA (SEQ ID NO:4)、StsI-UHA2(SEQ ID NO:5)、StsI-HF(SEQ IDNO:6) 和StsI-UHF(SEQ ID NO:7)。StsI-HA、StsI-HA2(高活性)、StsI-UHA 和StsI-UHA2(超高活性)可以在体内表现出比野生型StsI和野生型 FokI高的靶内活性，部分地归因于在N-末端区域内在位置34和61 的特定氨基酸取代，而StsI-HF(高保真度)和StsI-UHF(超高保真度) 可以在体内表现出比野生型StsI和野生型FokI低的脱靶活性，部分地归因于在C-末端区域内在位置141和152的特定氨基酸取代。
因此，某些实施方案涉及一种蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质存在于体内。在其他实施方案中，蛋白质包含核酸酶结构域。在一个实施方案中，核酸酶结构域包含以下一种或多种：FokI内切核酸酶的裂解结构域(SEQ ID NO:53)、StsI内切核酸酶的裂解结构域(SEQ ID NO:1)、StsI-HA(SEQ ID NO:2)、StsI-HA2(SEQ ID NO:3)、 StsI-UHA(SEQ ID NO:4)、StsI-UHA2(SEQ ID NO:5)、StsI-HF(SEQ ID NO:6)和StsI-UHF(SEQ ID NO:7)或其生物活性片段或变体。
还发现，包含包含有某些新型重复序列的DNA结合结构域的工程改造的基因编辑蛋白可以在体内表现出比先前公开的基因编辑蛋白低的脱靶活性，同时维持高水平的体内中靶活性。这些工程改造的基因编辑蛋白中的某些可以提供优于先前公开的基因编辑蛋白的若干优点，包括例如连接重复序列的连接子区域的灵活性增加，这可以引起结合效率增加。因此，某些实施方案涉及一种包含多个重复序列的蛋白质。在一个实施方案中，至少一个重复序列含有氨基酸序列： GabG，其中“a”和“b”各自代表任何氨基酸。在一个实施方案中，蛋白质是基因编辑蛋白。在另一个实施方案中，一个或多个重复序列存在于DNA结合结构域中。在另一个实施方案中，“a”和“b”各自独立地选自以下组：H和G。在再另一个实施方案中，“a”和“b”分别是H和 G。在一个实施方案中，氨基酸序列存在于重复序列的C-末端的约5 个氨基酸内。在另一个实施方案中，氨基酸序列存在于重复序列的 C-末端。在一些实施方案中，氨基酸序列GabG中的一个或多个G被除G之外的一种或多种氨基酸如A、H或GG替换。在一个实施方案中，重复序列的长度为在约32个氨基酸和约40个氨基酸之间、或在约33个氨基酸和约39个氨基酸之间、或在约34个氨基酸和38个氨基酸之间、或在约35个氨基酸和约37个氨基酸之间、或约36个氨基酸、或大于约32个氨基酸、或大于约33个氨基酸、或大于约34 个氨基酸、或大于约35个氨基酸。其他实施方案涉及一种包含一个或多个转录激活因子样效应结构域的蛋白质。在一个实施方案中，至少一个转录激活因子样效应结构域包含重复序列。其他实施方案涉及一种包含多个重复序列的蛋白质，所述重复序列通过在转录激活因子样效应结构域的至少两个重复序列之间插入一个或多个氨基酸而产生。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸自至少一个重复序列的 C-末端的约1、或约2、或约3、或约4、或约5个氨基酸处插入。再其他实施方案涉及一种包含多个重复序列的蛋白质，其中约每隔一个重复序列具有与就在重复序列之前或之后的重复序列不同的长度。在一个实施方案中，每隔一个重复序列的长度为约36个氨基酸。在另一个实施方案中，每隔一个重复序列的长度为36个氨基酸。其他实施方案涉及一种包含多个重复序列的蛋白质，其中所述多个重复序列包含至少两个各自长度为至少36个氨基酸的重复序列，并且其中至少两个各自长度为至少36个氨基酸的重复序列被至少一个长度小于 36个氨基酸的重复序列隔开。一些实施方案涉及一种包含一个或多个选自例如以下的序列的蛋白质：SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、 SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60。
其他实施方案涉及一种包含DNA结合结构域的蛋白质。在一些实施方案中，DNA结合结构域包含多个重复序列。在一个实施方案中，多个重复序列使得能够高度特异性识别靶DNA分子中的结合位点。在另一个实施方案中，至少两个重复序列彼此具有至少约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约98％、或约99％的同源性。在另一个实施方案中，至少一个重复序列包含一个或多个能够结合靶DNA分子中的结合位点的区域。在再另一个实施方案中，结合位点包含长度在约1个碱基和约5个碱基之间的限定序列。在一个实施方案中，DNA结合结构域包含锌指。在另一个实施方案中，DNA结合结构域包含转录激活因子样效应物(TALE)。在另一个实施方案中，多个重复序列包括至少一个与TALE具有至少约 50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约98％、或约99的同源性的重复序列。在再另一个实施方案中，基因编辑蛋白包含聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白。在一个实施方案中，基因编辑蛋白包含核定位序列。在另一个实施方案中，核定位序列包含氨基酸序列：PKKKRKV(SEQ ID NO:471)。在一个实施方案中，基因编辑蛋白包含线粒体定位序列。在另一个实施方案中，线粒体定位序列包含氨基酸序列：LGRVIPRKIASRASLM (SEQ ID NO:472)。在一个实施方案中，基因编辑蛋白包含连接子。在另一个实施方案中，连接子将DNA结合结构域连接到核酸酶结构域。在另一个实施方案中，连接子的长度在约1个氨基酸和约10个氨基酸之间。在一些实施方案中，连接子的长度为约1、约2、或约 3、或约4、或约5、或约6、或约7、或约8、或约9、或约10个氨基酸。在一个实施方案中，基因编辑蛋白能够在靶DNA分子中产生切口或双链断裂。
某些实施方案涉及一种用于体内修饰细胞的基因组的方法，所述方法包括在体内向细胞中引入编码非天然存在的融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含含有一个或多个长度为36个氨基酸的人工转录激活因子样(TAL)效应物重复结构域和内切核酸酶结构域，其中重复结构域被工程改造用于识别预定的核苷酸序列，并且其中融合蛋白识别预定的核苷酸序列。在一个实施方案中，细胞为真核细胞。在另一个实施方案中，细胞为动物细胞。在另一个实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在再另一个实施方案中，细胞为人细胞。在一个实施方案中，细胞为植物细胞。在另一个实施方案中，细胞为原核细胞。在一些实施方案中，融合蛋白在细胞的核酸中引入内切核苷酸裂解，由此修饰细胞的基因组。
某些实施方案涉及一种包含核酸的用于在体内更改细胞的DNA 序列的组合物，其中所述核酸编码基因编辑蛋白。其他实施方案涉及一种包含核酸混合物的用于在体内更改细胞的DNA序列的组合物，其中所述核酸混合物包含：编码第一基因编辑蛋白的第一核酸和编码第二基因编辑蛋白的第二核酸。在一个实施方案中，第一基因编辑蛋白的结合位点和第二基因编辑蛋白的结合位点存在于同一靶DNA分子中。在另一个实施方案中，第一基因编辑蛋白的结合位点和第二基因编辑蛋白的结合位点间隔少于约50个碱基、或少于约40个碱基、或少于约30个碱基、或少于约20个碱基、或少于约10个碱基、或约10个碱基和约25个碱基之间、或约15个碱基。在一个实施方案中，第一基因编辑蛋白的核酸酶结构域和第二基因编辑蛋白的核酸酶结构域能够形成二聚体。在另一个实施方案中，二聚体能够在靶DNA 分子中产生切口或双链断裂。
某些实施方案涉及一种治疗组合物。其他实施方案涉及一种美容组合物。在一些实施方案中，组合物包含修复模板。在另一个实施方案中，修复模板是单链DNA分子或双链DNA分子。
其他实施方案涉及一种用于合成蛋白质或编码蛋白质的核酸的制品。在一个实施方案中，所述制品是核酸。在另一个实施方案中，蛋白质包含DNA结合结构域。在另一个实施方案中，核酸包含编码 DNA结合结构域的核苷酸序列。在一个实施方案中，蛋白质包含核酸酶结构域。在另一个实施方案中，核酸包含编码核酸酶结构域的核苷酸序列。在一个实施方案中，蛋白质包含多个重复序列。在另一个实施方案中，核酸编码多个重复序列。在另一个实施方案中，核酸酶结构域选自：FokI、StsI、StsI-HA、StsI-HA2、StsI-UHA、StsI-UHA2、StsI-HF和StsI-UHF或其天然或工程改造变体或生物活性片段。在一个实施方案中，核酸包含RNA聚合酶启动子。在另一个实施方案中， RNA聚合酶启动子是T7启动子或SP6启动子。在另一个实施方案中，核酸包含病毒启动子。在一个实施方案中，核酸包含非翻译区。在另一个实施方案中，核酸是体外转录模板。
某些实施方案涉及一种用于在体内诱导细胞表达蛋白质的方法。其他实施方案涉及一种体内更改细胞的DNA序列的方法，其包括用基因编辑蛋白在体内转染细胞或在体内诱导细胞表达基因编辑蛋白。再其他实施方案涉及一种用于在体内降低细胞中关注的蛋白质的表达的方法。在一个实施方案中，诱导细胞表达基因编辑蛋白，其中基因编辑蛋白能够在靶DNA分子中产生切口或双链断裂。在另一个实施方案中，切口或双链断裂引起基因失活。再其他实施方案涉及一种用于在体内产生无活性、活性降低或显性负性形式的蛋白质的方法。在一个实施方案中，蛋白质是存活蛋白。再其他实施方案涉及一种用于在体内修复细胞中的一种或多种突变的方法。在一个实施方案中，使细胞与修复模板接触。在另一个实施方案中，修复模板是DNA分子。在另一个实施方案中，修复模板不含基因编辑蛋白的结合位点。在再另一个实施方案中，修复模板编码由包含基因编辑蛋白的结合位点的DNA序列编码的氨基酸序列。
在各个实施方案中，修复模板为约20个核苷酸、或约30个核苷酸、或约40个核苷酸、或约50个核苷酸、或约60个核苷酸、或约 70个核苷酸、或约80个核苷酸、或约90个核苷酸、或约100个核苷酸、或约150个核苷酸、或约200个核苷酸、或约300个核苷酸、或约400个核苷酸、或约500个核苷酸、或约750个核苷酸、或约 1000个核苷酸。在各个实施方案中，修复模板为约20至1000个核苷酸、或约20至500个核苷酸、或约20至400个核苷酸、或约20 至200个核苷酸、或约20至100个核苷酸、或约80至100个核苷酸、或约50至100个核苷酸。
在各个实施方案中，RNA(例如，编码基因编辑蛋白的合成RNA) 与修复模板的质量比为约1:10、或约1:9、或约1:8、或约1:7、或约 1:6、或约1:5、或约1:4、或约1:3、或约1:2、或约1:1、或约2:1、或约3:1、或约4:1、或约5:1、或约6:1、或约7:1、或约8:1、或约 9:1、或约10:1。
在各个实施方案中，RNA(例如，编码基因编辑蛋白的合成RNA) 与修复模板的摩尔比为约1:10、或约1:9、或约1:8、或约1:7、或约 1:6、或约1:5、或约1:4、或约1:3、或约1:2、或约1:1、或约2:1、或约3:1、或约4:1、或约5:1、或约6:1、或约7:1、或约8:1、或约 9:1、或约10:1。
在各个实施方案中，修复模板具有双重功能，促使修复基因编辑的靶序列并防止进一步结合基因编辑蛋白，从而减少或消除另外的基因编辑(例如，经由修复模板引起修复，这使得基因编辑蛋白结合位点不再适合基因编辑蛋白结合)。因此，在一些实施方案中，本发明的基因编辑方法是可调的，以确保每个靶位点的单个基因编辑。
其他实施方案涉及一种用于治疗患者的方法，其包括向患者施用治疗或美容有效量的蛋白质或编码蛋白质的核酸。在一个实施方案中，所述治疗引起患者的一种或多种症状得到减轻。某些实施方案涉及一种用于治疗患者的方法，其包括：a.通过用编码关注的蛋白质的核酸在体内转染细胞来诱导细胞表达关注的蛋白质和/或b.在体内重新编程细胞。在一个实施方案中，将细胞重新编程为分化程度较低的状态。在另一个实施方案中，通过用编码一种或多种重新编程蛋白的一种或多种合成RNA分子转染细胞来重新编程细胞。在另一个实施方案中，细胞是分化的。在再另一个实施方案中，细胞分化成以下之一：皮肤细胞、葡萄糖应答性胰岛素生成细胞、造血细胞、心肌细胞、视网膜细胞、肾细胞、神经细胞、基质细胞、脂肪细胞、骨细胞、肌肉细胞、卵母细胞和精子细胞。其他实施方案涉及一种用于治疗患者的方法，其包括：a.通过用编码基因编辑蛋白的核酸在体内转染细胞诱导细胞表达基因编辑蛋白和/或b.在体内重新编程细胞。
其他实施方案涉及一种复合培养基。在一个实施方案中，复合培养基具有大于约7、或大于约7.2、或大于约7.4、或大于约7.6、或大于约7.8、或大于约8.0、或大于约8.2、或大于约8.4、或大于约 8.6、或大于约8.8、或大于约9.0的pH。在另一个实施方案中，复合培养基包含转铁蛋白。在另一个实施方案中，复合培养基包含 DMEM。在再另一个实施方案中，复合培养基包含DMEM/F12。再其他实施方案涉及一种用于形成核酸-转染试剂复合物的方法。在一个实施方案中，将转染试剂与复合培养基一起温育。在另一个实施方案中，温育在混合步骤之前进行。在另一个实施方案中，温育步骤在约5秒和约5分钟之间、或在约10秒和约2分钟之间、或在约15秒和约1分钟之间、或在约30秒和约45秒之间。在一个实施方案中，转染试剂选自表1。在另一个实施方案中，转染试剂为脂质或类脂质。在另一个实施方案中，转染试剂包含阳离子。在再另一个实施方案中，阳离子为多价阳离子。在再另一个实施方案中，转染试剂为 N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油烯氧基]-苯甲酰胺(亦称MVL5)或其衍生物。
某些实施方案涉及一种通过使细胞与核酸在体内接触用于诱导细胞表达蛋白质的方法。在一个实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，细胞为人细胞或啮齿动物细胞。某些实施方案涉及一种使用一种或多种本发明的方法产生的细胞。在一个实施方案中，细胞存在于患者中。在另一个实施方案中，细胞自患者分离。其他实施方案涉及一种筛选文库，其包含使用一种或多种本发明的方法产生的细胞。在一个实施方案中，筛选文库用于以下至少一种：毒性筛选，包括：心脏毒性筛选、神经毒性筛选和肝毒性筛选，功效筛选，高通量筛选，高含量筛选，和其他筛选。
其他实施方案涉及一种含有核酸的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒含有递送试剂(亦称“转染试剂”)。在另一个实施方案中，试剂盒是重新编程试剂盒。在另一个实施方案中，试剂盒是基因编辑试剂盒。其他实施方案涉及一种用于产生核酸的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒含有以下中的至少两种：假尿苷-三磷酸、5-甲基尿苷三磷酸、5-甲基胞苷三磷酸、5-羟甲基胞苷三磷酸、N4-甲基胞苷三磷酸、 N4-乙酰基胞苷三磷酸和7-脱氮鸟苷三磷酸或一种或多种其衍生物。其他实施方案涉及一种包含核酸的治疗剂或化妆品。在一个实施方案中，所述治疗剂或化妆品为药物组合物。在另一个实施方案中，所述药物组合物是配制的。在另一个实施方案中，制剂包含脂质体的水性悬浮液。说明性脂质体组分列于表1中，并且通过举例而不是限制给出。在一个实施方案中，脂质体包括一个或多个聚乙二醇(PEG)链。在另一个实施方案中，PEG为PEG2000。在另一个实施方案中，脂质体包括1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)或其衍生物。在一个实施方案中，治疗剂包含一种或多种配体。在另一个实施方案中，治疗剂包括以下中的至少一种：雄激素、CD30(TNFRSF8)、细胞穿透肽、CXCR、雌激素、表皮生长因子、EGFR、HER2、叶酸、胰岛素、胰岛素样生长因子-I、白细胞介素-13、整联蛋白、孕酮、基质源因子-1、凝血酶、维生素D和转铁蛋白或其生物活性片段或变体。再其他实施方案涉及一种包含使用一种或多种本发明的方法产生的细胞的治疗剂或化妆品。在一个实施方案中，将治疗剂施用到患者用于治疗包括而不限于以下的任何本文所述的疾病或病症：1型糖尿病、心脏病(包括缺血性和扩张性心肌病)、黄斑变性、帕金森氏病、囊性纤维化、镰状细胞贫血、地中海贫血、范可尼贫血、严重联合免疫缺陷、遗传性感觉神经病、色素性干皮病、亨廷顿氏病、肌肉营养不良、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默氏病、癌症和传染性疾病(包括肝炎和HIV/AIDS)。
其他实施方案涉及一种用于在体内重新编程细胞的方法。在一个实施方案中，通过使细胞与一种或多种核酸接触来重新编程细胞。在一个实施方案中，使细胞与编码以下中的至少一种的多种核酸接触： Oct4蛋白、Sox2蛋白、Klf4蛋白、c-Myc蛋白、Lin28蛋白或其生物活性片段、变体或衍生物。在另一个实施方案中，使细胞与编码多种蛋白质的多种核酸接触，所述蛋白质包括：Oct4蛋白、Sox2蛋白、 Klf4蛋白和c-Myc蛋白或其一种或多种生物活性片段、变体或衍生物。再其他实施方案涉及一种用于在体内基因编辑细胞的方法。在一个实施方案中，通过使细胞与一种或多种核酸分子接触来基因编辑细胞。
某些实施方案涉及一种在体内诱导细胞表达关注的蛋白质的方法，其包括使细胞与包含用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白和一种或多种核酸分子的溶液在体内接触，其中所述一种或多种核酸分子中的至少一种编码关注的蛋白质。在一个实施方案中，所述方法产生表达关注的蛋白质的细胞。在另一个实施方案中，一种或多种核酸分子包括合成RNA分子。在一个实施方案中，细胞为皮肤细胞。在另一个实施方案中，细胞为肌肉细胞。在又另一个实施方案中，细胞为表皮成纤维细胞。在又另一个实施方案中，细胞为成肌细胞。在一个实施方案中，关注的蛋白质是细胞外基质蛋白质。在另一个实施方案中，关注的蛋白质选自：弹性蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、赖氨酰氧化酶、弹性蛋白结合蛋白、生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、粒细胞集落刺激因子、基质金属蛋白酶、肌动蛋白、原纤维蛋白、微纤维相关糖蛋白、赖氨酰氧化酶样蛋白和血小板源性生长因子。在一个实施方案中，将溶液递送到真皮。在另一个实施方案中，递送通过注射进行。在又另一个实施方案中，递送使用微针阵列注射进行。在一个实施方案中，溶液还包含生长因子。在另一个实施方案中，生长因子选自：成纤维细胞生长因子和转化生长因子β。在又另一个实施方案中，溶液还包含胆固醇。其他实施方案涉及一种在体内诱导细胞表达关注的蛋白质的方法，其包括使细胞与包含胆固醇和一种或多种核酸分子的溶液在体内接触，其中一种或多种核酸分子中的至少一种编码关注的蛋白质。在一个实施方案中，所述方法产生表达关注的蛋白质的细胞。再其他实施方案涉及一种用核酸分子在体内转染细胞的方法，其包括使细胞与包含用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白和核酸分子的溶液在体内接触。在一个实施方案中，所述方法产生用核酸分子转染的细胞。在另一个实施方案中，核酸分子为以下中的一种：dsDNA分子、ssDNA分子、dsRNA 分子、ssRNA分子、质粒、寡核苷酸、合成RNA分子、miRNA分子、 mRNA分子、siRNA分子。再其他实施方案涉及一种用于治疗患者的方法，其包括向患者递送包含用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白和一种或多种核酸分子的组合物，其中所述一种或多种核酸分子中的至少一种编码关注的蛋白质。在一个实施方案中，所述方法引起关注的蛋白质在患者中表达。在另一个实施方案中，所述方法引起关注的蛋白质在患者的真皮中表达。
某些实施方案涉及一种包含用离子交换树脂或木炭处理的白蛋白和核酸分子的美容组合物。其他实施方案涉及一种美容治疗制品。在一个实施方案中，所述美容治疗制品包括被构造成将组合物递送到患者的装置。在另一个实施方案中，核酸分子编码弹性蛋白或胶原蛋白。再其他实施方案涉及一种用于在体内转染细胞的溶液，其包含胆固醇或胆固醇类似物和一种或多种核酸分子。在一个实施方案中，胆固醇或胆固醇类似物与一种或多种核酸分子中的至少一种共价键合。在另一个实施方案中，胆固醇类似物是氧甾醇。在又另一个实施方案中，胆固醇类似物包括以下中的一种或多种：A-环取代、B-环取代、 D-环取代、侧链取代、胆甾烷酸、胆甾酸、多不饱和部分、氘代部分、氟化部分、磺化部分、磷酸化部分和荧光部分。在又另一个实施方案中，所述方法包括用以下中的一种或多种治疗患者：表皮填充剂、神经毒素(通过说明钠通道抑制剂(例如，河豚毒素)、钾通道抑制剂(例如，四乙基铵)、氯通道抑制剂(例如，氯毒素和箭毒)、钙通道抑制剂 (例如，芋螺毒素)、突触小泡释放抑制剂(例如，肉毒杆菌毒素和破伤风毒素)和血脑屏障抑制剂(例如，铝和汞))和修复诱导治疗。
尽管转染试剂核酸复合物倾向于在储存超过几分钟时沉淀，形成团块或以其他方式降解，但本发明人惊奇地发现根据本发明的一些实施方案产生的转染试剂核酸复合物可以是冷冻的和/或可以在包括室温、约4℃、约-20℃、约-80℃和约-196℃的各种温度下储存延长的时间，例如几小时、约1天、约1周、约1个月、约1年和大于约1 年。因此，一些实施方案涉及一种包含合成RNA和转染试剂的药物制剂，其中所述药物制剂以固体形式提供。其他实施方案涉及一种包含合成RNA转染试剂复合物的药物制剂，其中所述合成RNA转染试剂复合物以固体形式提供。在各个实施方案中，合成RNA转染试剂复合物以冷冻形式提供。各个实施方案涉及一种用于稳定核酸转染试剂复合物的方法，其包括形成核酸转染试剂复合物和使核酸转染试剂复合物或容纳其的容器与低温液体接触以产生稳定化核酸转染试剂复合物。在一个实施方案中，核酸转染试剂复合物被稳定化以便运输或储存。
说明性受试者或患者是指任何脊椎动物，包括而不限于人和其他灵长类动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴类)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如，犬和猫)、实验动物(例如，啮齿类动物，诸如小鼠、大鼠和豚鼠)和鸟类(例如，家养、野生和猎禽类，诸如鸡、火鸡和其他鹑鸡类、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。
定义
“分子”意指分子实体(分子、离子、复合物等)。
“RNA分子”意指包含RNA的分子。
“合成RNA分子”意指使用生物工程在细胞外产生或在细胞内产生的RNA分子，作为非限制性实例，在体外-转录反应中产生的RNA 分子、通过直接化学合成产生的RNA分子或在基因工程改造的大肠杆菌细胞中产生的RNA分子。
“转染”意指使细胞与分子接触，其中分子被细胞内化。
“转染后”意指在转染期间或之后。
“转染试剂”意指与分子缔合并促进分子递送到细胞和/或由细胞内化分子的物质或物质混合物，作为非限制性实例，阳离子脂质、带电的聚合物或细胞穿透肽。
“基于试剂的转染”意指使用转染试剂的转染。
“培养基”意指溶剂或包含溶剂和溶质的溶液，作为非限制性实例，杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)、DMEM+10％胎牛血清 (FBS)、盐水或水。
“复合培养基”意指如下培养基，向其中添加了转染试剂和待转染的分子，并且其中转染试剂与待转染的分子缔合。
“转染培养基”意指可用于转染的培养基，作为非限制性实例，杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)、DMEM/F12、盐水或水。
“重组蛋白质”意指并非在动物或人中产生的蛋白质或肽。非限制性实例包括在细菌中产生的人转铁蛋白、在小鼠细胞的体外培养物中产生的人纤连蛋白以及在稻米植物中产生的人血清白蛋白。
“Oct4蛋白质”意指由POU5F1基因编码的蛋白质或其天然或工程改造的变体、家族成员、直向同源物、片段或融合构建体，作为非限制性实例，人Oct4蛋白(SEQ ID NO:8)、小鼠Oct4蛋白、Oct1蛋白、由POU5F1假基因2编码的蛋白、Oct4蛋白的DNA结合结构域或Oct4-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，Oct4蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少70％同一性或者在其他实施方案中与SEQ ID NO:8具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Oct4蛋白包含相对于SEQ ID NO:8具有1至20处氨基酸插入、缺失或取代(总共)的氨基酸序列。或者在其他实施方案中，Oct4蛋白包含相对于SEQ ID NO:8具有1至15处或1至10处氨基酸插入、缺失或取代(总共)的氨基酸序列。
“Sox2蛋白质”是指由SOX2基因编码的蛋白质或其天然或工程改造的变体、家族成员、直向同源物、片段或融合构建体，作为非限制性实例，人Sox2蛋白(SEQ ID NO:9)、小鼠Sox2蛋白、Sox2蛋白的DNA结合结构域或Sox2-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，Sox2 蛋白包含与SEQ ID NO:9具有至少70％同一性或者在其他实施方案中与SEQ ID NO:9具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Sox2蛋白包含相对于SEQ ID NO:9 具有1至20处氨基酸插入、缺失或取代(总共)的氨基酸序列。或者在其他实施方案中，Sox2蛋白包含相对于SEQ ID NO:9具有1至15处或1至10处氨基酸插入、缺失或取代(总共)的氨基酸序列。
“Klf4蛋白质”是指由KLF4基因编码的蛋白质或其天然或工程改造的变体、家族成员、直向同源物、片段或融合构建体，作为非限制性实例，人Klf4蛋白(SEQ ID NO:10)、小鼠Klf4蛋白、Klf4蛋白的 DNA结合结构域或Klf4-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，Klf4蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少70％同一性或者在其他实施方案中与SEQ ID NO:10具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Klf4蛋白包含相对于SEQ ID NO:10 具有1至20处氨基酸插入、缺失或取代(总共)的氨基酸序列。或者在其他实施方案中，Klf4蛋白包含相对于SEQ ID NO:10具有1至15 处或1至10处氨基酸插入、缺失或取代(总共)的氨基酸序列。
“c-Myc蛋白质”是指由MYC基因编码的蛋白质或其天然或工程改造的变体、家族成员、直向同源物、片段或融合构建体，作为非限制性实例，人c-Myc蛋白(SEQ ID NO:11)、小鼠c-Myc蛋白、l-Myc 蛋白、c-Myc(T58A)蛋白、c-Myc蛋白的DNA结合结构域或c-Myc-GFP 融合蛋白。在一些实施方案中，c-Myc蛋白包含与SEQ ID NO:11具有至少70％同一性或者在其他实施方案中与SEQ ID NO:11具有至少75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，c-Myc蛋白包含相对于SEQ ID NO:11具有1至20处氨基酸插入、缺失或取代(总共)的氨基酸序列。或者在其他实施方案中，c-Myc 蛋白包含相对于SEQ ID NO:11具有1至15处或1至10处氨基酸插入、缺失或取代(总共)的氨基酸序列。
“促红细胞生成素”或“促红细胞生成素蛋白”意指由EPO基因编码的蛋白质或其天然或工程改造的变体、家族成员、直向同源物、片段或融合构建体，作为非限制性实例，人促红细胞生成素(SEQ ID NO: 164)、小鼠促红细胞生成素、达贝泊汀、阿法达贝泊汀、NOVEPOETIN、促红细胞生成素的结合结构域或促红细胞生成素-GFP融合蛋白。在一些实施方案中，促红细胞生成素包含与SEQ ID NO:164具有至少 70％同一性，或者在其他实施方案中与SEQ ID NO:164具有至少 75％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，促红细胞生成素包含相对于SEQ ID NO:164具有1至20处氨基酸插入、缺失或取代(总共)的氨基酸序列。或者在其他实施方案中，促红细胞生成素包含相对于SEQ IDNO:164具有1至15处或1至10 处氨基酸插入、缺失或取代(总共)的氨基酸序列。
“重新编程”意指引起细胞表型的改变，作为非限制性实例，引起β-细胞祖细胞分化成成熟β-细胞，引起成纤维细胞去分化成多能干细胞，引起角质形成细胞转分化成心脏干细胞，引起细胞端粒延长或引起神经元轴突生长。
“重新编程因子”意指当细胞与分子接触和/或细胞表达分子时，可以单独或与其他分子组合引起重新编程的分子，作为非限制性实例， Oct4蛋白、Tert蛋白或促红细胞生成素。
“生殖细胞”意指精子细胞或卵细胞。
“多能干细胞”意指可以在体内分化成所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞的细胞。
“体细胞”意指不是多能干细胞或生殖细胞的细胞，作为非限制性实例，皮肤细胞。
“造血细胞”意指血细胞或可以分化成血细胞的细胞，作为非限制性实例，造血干细胞或白细胞。
“心脏细胞”意指心脏细胞或可以分化成心脏细胞的细胞，作为非限制性实例，心脏干细胞或心肌细胞。
“视网膜细胞”意指视网膜的细胞或可以分化成视网膜的细胞的细胞，作为非限制性实例，视网膜色素上皮细胞。
“皮肤细胞”意指通常在皮肤中见到的细胞，作为非限制性实例，成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、脂肪细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或血细胞。
“免疫抑制剂”意指可以抑制免疫系统的一个或多个方面并且通常不存在于哺乳动物中的物质，作为非限制性实例，B18R或地塞米松。
“单链断裂”意指如下单链或双链DNA的区域，其中连接核苷酸的一个或多个共价键在一条或两条链中的一条中断裂。
“双链断裂”意指如下双链DNA的区域，其中连接核苷酸的一个或多个共价键在两条链的每一条中断裂。
“核苷酸”意指核苷酸或其片段或衍生物，作为非限制性实例，核碱基、核苷、核苷酸-三磷酸等。
“核苷”意指核苷酸或其片段或衍生物，作为非限制性实例，核碱基、核苷、核苷酸-三磷酸等。
“基因编辑”意指更改细胞的DNA序列，作为非限制性实例，通过用引起细胞的DNA中的突变的蛋白质转染细胞或通过用引起细胞的DNA中的化学改变的蛋白质转染细胞。
“基因编辑蛋白”意指可以单独或与一种或多种其他分子组合更改细胞的DNA序列的蛋白质，作为非限制性实例，核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶、巨核酸酶、切口酶、聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白、DNA修复蛋白、 DNA修饰蛋白、碱基修饰蛋白、DNA甲基转移酶、引起DNA去甲基化的蛋白质、DNA为底物的酶或其天然或工程改造的变体、家族成员、直向同源物、片段或融合构建体。
“修复模板”意指含有与基因编辑蛋白的靶位点的10kb内的序列具有至少约70％同源性的区域的核酸。
“重复序列”意指在蛋白质中存在多于一个在至少约10％同源性内的拷贝的氨基酸序列，作为非限制性实例，转录激活因子样效应物的单体重复序列。
“DNA结合结构域”意指能够结合DNA分子的分子区域，作为非限制性实例，包含一个或多个锌指的蛋白质结构域、包含一个或多个转录激活因子样(TAL)效应物重复序列的蛋白结构域或能够结合 DNA分子的小分子的结合口袋。
“结合位点”意指能够被基因编辑蛋白、DNA结合蛋白、DNA结合结构域或其生物活性片段或变体识别的核酸序列或者基因编辑蛋白、DNA结合蛋白、DNA结合结构域或其生物活性片段或变体对其具有高亲和力的核酸序列，作为非限制性实例，在人BIRC5基因的外显子1中的DNA的约20个碱基对的序列。
“靶”意指含有结合位点的核酸。
其他定义在美国申请号13/465,490、美国临时申请号61/664,494、美国临时申请号61/721,302、国际申请号PCT/US12/67966、美国临时申请号61/785,404、美国临时申请号61/842,874、国际申请号PCT/US13/68118、美国临时申请号61/934,397、美国申请号 14/296,220、美国临时申请号62/038,608、美国临时申请号62/069,667 和国际申请号PCT/US2015/013949中阐述，其内容以引用的方式整体并入本文。
选择的序列
本发明还通过以下非限制性实施例进行说明。
实施例
实施例1 RNA合成
编码绿色荧光蛋白(“GFP”)、NOVEPOETIN(“EPO”)、弹性蛋白 (“ELN”)、酪氨酸酶(“TYR”)、黑皮质素-1受体(“MC1R”)、HAS1、HAS2、HAS3、COL3A1、COL7A1、COL1A1、COL1A2、hTERT、 Holly GFP、Fresno RFP、Blitzen Blue、RIBOSLICE基因编辑蛋白、 TALEN、Cas9、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc-2(T58A)、Lin28、IL2、IL6、IL15、IL22、BMP2、BMP7、BDNF、LIF、BMP6、IL15RA、 FGF21、LIF、PTH、KRT5、KRT5-GFP、KRT14、KRT14-GFP、GDF15 和ESM1并且包含规范核苷酸和非规范核苷酸的各种组合的RNA根据制造商的说明书和本发明人先前公开的发明(美国申请号 13/465,490(现为美国专利号8,497,124)、国际申请号PCT/US12/67966、美国申请号13/931,251、国际申请号PCT/US13/68118和国际申请号 PCT/US2015/013949，其全部内容以引用的方式整体并入本文中)使用 T7高产量RNA合成试剂盒和具有mRNA帽2'-O-甲基转移酶的牛痘加帽系统试剂盒(Vaccinia Capping System kit)(均来自New EnglandBiolabs,Inc.)自DNA模板合成(表4)。然后将RNA用无核酸酶的水稀释至100ng/pL和2000ng/pL之间。对于某些实验，以1μL/100μg 的RNA的浓度添加RNA酶抑制剂(Superase·In,Life Technologies Corporation)。RNA溶液在室温、4℃、-20℃或-80℃下储存。对于重新编程实验，编码Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc-2(T58A)和Lin28的RNA 以3:1:1:1:1的摩尔比混合。
表4.RNA合成
“A”是指腺苷-5'-三磷酸，“G”是指鸟苷-5'-三磷酸，“U”是指尿苷 -5'-三磷酸，“C”是指胞苷-5'-三磷酸，“7dG”是指7-脱氮鸟嘌呤-5'-三磷酸，“sG”是指噻吩鸟苷-5'-三磷酸，“5mC”是指5-甲基胞苷-5'-三磷酸，“5hmC”是指5-羟甲基胞苷-5'-三磷酸，“5cC”是指5-羧基胞苷-5'- 三磷酸，“5fC”是指5-甲酰基胞苷-5'-三磷酸，“5hC”是指5-羟基胞苷 -5'-三磷酸，“psU”是指5-假尿苷-5'-三磷酸，“5mU”是指5-甲基尿苷-5'- 三磷酸，“5hmU”是指5-羟甲基尿苷-5'-三磷酸，“5cU”是指5-羧基尿苷-5'-三磷酸，并且“5moU”是指5-甲氧基尿苷-5'-三磷酸。
实施例2 RNA-转染试剂复合物的制备
对于每微克RNA，首先在复合培养基(Opti-MEM，Life Technologies Corporation或DMEM/F12+10pg/mL胰岛素+5.5 pg/mL转铁蛋白+6.7ng/mL亚硒酸钠+2pg/mL乙醇胺)中分别稀释 1μg RNA和1μL转染试剂(LIPOFECTAMINE 3000，Life Technologies Corporation)到各自总体积在5μL和100μL之间。然后根据转染试剂-制造商的说明书将稀释的RNA和转染试剂混合并在室温下温育10分钟。
实施例3用合成RNA转染细胞
根据实施例2制备复合物，然后将其直接添加到培养物中的细胞中。对于在6孔板中的转染，将10μL和250μL之间的复合物添加到6孔板的每个孔中，其每个孔已经含有2mL转染培养基。轻轻摇动板以将复合物分配在整个孔中。在用新鲜转染培养基(2mL/孔)替换培养基之前，将细胞与复合物温育4小时至过夜。或者，不替换培养基。放大体积规模以便在24孔板和96孔板中转染。
实施例4含有非规范核苷酸的合成RNA的毒性和自其蛋白质翻译
使用根据实施例1合成的RNA，根据实施例2转染原代人成纤维细胞。固定细胞并在转染后使用针对Oct4的抗体染色20-24小时。通过评估固定时的细胞密度来确定RNA的相对毒性。
实施例5合成RNA递送到皮肤
使用根据实施例1合成的编码绿色荧光蛋白(GFP)或VII型胶原蛋白αI(COL7)的RNA制备表5中所示的复合反应。RNA原液的浓度为500pg/mL。
表5.RNA复合反应
每个管通过移液混合，并将转染试剂溶液管在室温下温育30s。然后将转染试剂溶液转移到RNA溶液中，并且通过快速上下吸移10 次来混合内容物。温育10min后，根据表6制备稀释液。
表6.注射溶液
| 部位 | RNA | 复合体积 | FactorPlex<sup>TM</sup>体积 | RNA量 |
| 1 | GFP | 7.5μL | 22.5μL | 0.3μg |
| 2 | GFP | 15μL | 15μL | 0.6μg |
| 3 | GFP | 30μL | 0μL | 1.2μg |
| 4 | COL7 | 30μL | 0μL | 1.2μg |
对于每次注射，将相应的溶液吸到具有8mm 31号针头的3cc 胰岛素注射器中(Becton，Dickinson and Company，部件编号：328291) 并除去气泡。在健康的33岁男性人受试者的左前臂上选择清晰的视野，并用70％异丙醇消毒并使其干燥。将针头定位成与前段(掌)前臂成约10°的角度，斜面朝上，并且插入直到斜面刚好被覆盖。在约10 s的时间内皮内注射30μL的RNA溶液。在注射过程期间出现明显的水疱。取出针头，水疱保持约1分钟，并且没有流体从注射部位漏出。根据表6执行总共4次注射，并且在准备RNA复合反应后11分钟和 28分钟之间执行所有的注射。没有出现因注射引起的肿胀、发红或疼痛。当针从部位2和4移除时发生少量出血，导致在这些部位出现小红点。
对注射部位根据表7的时间表获得图像，并且此后每24小时获得图像持续6天。使用配备有EXFO X-CiteTM 120荧光照射系统和表 7所示的滤光镜套件的倒置显微镜(NikonEclipse TS100)获得荧光图像。使用Sony NEX-7数码相机捕获荧光图像(图9-12)。
表7.测量参数
使用1.2μg剂量的GFP RNA进行独立实验，得到类似的结果(图 12)。
表8.滤光镜套件
实施例6用编码NOVEPOETIN的RNA转染人角质形成细胞
根据实施例1合成编码NOVEPOETIN的RNA，其具有三种核苷酸组合：1)U、G、U、C，2)U、G、5moU、C和3)U、G、psU、 C。在EpiLife培养基中培养的原代人角质形成细胞的亚汇合层根据实施例3在6孔板的孔中用每孔1μgRNA转染。转染后12小时、24 小时、36小时和48小时，除去0.5mL培养基并向板中添加0.5mL 新鲜的EpiLife培养基。在最终培养基取样后，通过胰蛋白酶消化收获细胞，并使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)分离总RNA。使用DNA 酶I消化基因组DNA并纯化RNA。通过RT-PCR测量干扰素-β和 GAPDH的表达(图5)。
实施例7用编码hTERT的RNA转染人细胞
编码人端粒酶逆转录酶(hTERT)的RNA根据实施例1合成，其具有以下核苷酸：U、G、5moU、C。在DMEM+10％FBS中培养的原代人真皮成纤维细胞的亚汇合层在24孔板的孔中根据实施例3用每孔0.25μg RNA转染。转染后12h，固定细胞并使用1:50稀释的兔抗hTERT抗体(Millipore，部件编号：MABE14)染色(图16)。
实施例8：通过用RIBOSLICE重复转染进行高效基因编辑
将原代人成纤维细胞在涂有重组人纤连蛋白和重组人玻连蛋白 (各自在DMEM/F12中稀释至浓度为1pg/mL、1mL/孔，并在室温下温育1小时)的6孔板中在转染培养基中以10,000个细胞/孔的密度接种。接下来的一天，如实施例2中那样用根据实施例1合成的RNA转染细胞。接下来的一天，将一个孔中的细胞第二次转染。第二次转染后两天，使用突变特异性核酸酶测定测量基因编辑的效率。
实施例9用含有非规范核苷酸的合成RNA和编码修复模板的 DNA转染细胞
对于在6孔板中的转染，1μg编码靶向人APP基因的外显子16 的基因编辑蛋白的RNA、1μg含有靶细胞中不存在的PstI限制性位点的单链修复模板DNA和6μL转染试剂(LIPOFECTAMINE RNAiMAX,Life Technologies Corporation)首先在复合培养基 (Opti-MEM,Life Technologies Corporation)中单独地稀释至总体积为 120μL。然后根据转染试剂-制造商的说明书将稀释的RNA、修复模板和转染试剂混合并在室温下温育15分钟。将复合物添加到培养物中的细胞中。将约120μL的复合物添加到6孔板的每个孔中，其每个孔已经含有2mL的转染培养基。轻轻摇动板以将复合物分配在整个孔中。在用新鲜的转染培养基(2mL/孔)替换培养基之前，将细胞与复合物温育4小时至过夜。次日，将培养基变为DMEM+10％FBS。转染后两天，分离并纯化基因组DNA。通过PCR扩增APP基因内的区域，并且用PstI消化扩增产物并通过凝胶电泳分析。
实施例10体内RIBOSLICE安全性研究
向40只雌性NCr nu/nu小鼠皮下注射50％Matrigel(BD Biosciences)中的5×106个MDA-MB-231肿瘤细胞。细胞注射体积为 0.2mL/小鼠。研究开始时小鼠的年龄为8至12周。进行配对匹配，并且当肿瘤达到100mm3至150mm3的平均大小时，将动物分成4 组，每组10只动物，并开始治疗。在前5天每天测量体重，然后每两周测量一次，直至研究结束。治疗由与媒剂复合的RIBOSLICE BIRC5-1.2(LIPOFECTAMINE 2000，Life TechnologiesCorporation) 组成。为了制备每组的给药溶液，将308μL复合缓冲液(Opti-MEM， LifeTechnologies Corporation)移液到两个无菌的无RNA酶的1.5mL 管中的每一个中。将22μLRIBOSLICE BIRC5-1.2(500ng/pL)添加到两个管中的一个中，并通过移液混合管的内容物。将22μL媒剂添加到第二管中。将第二管的内容物混合，然后转移到第一管中，并通过移液与第一管的内容物混合以形成复合物。将复合物在室温下温育 10分钟。在温育期间，装载注射器。用60μL总体积/动物中1μg RNA/ 动物的总剂量静脉内或肿瘤内注射动物。总共给予5次治疗，每隔一天执行一次注射。剂量未根据体重进行调整。跟踪动物17天。没有观察到平均体重的显著降低，表明RIBOSLICE基因编辑RNA的体内安全性。
实施例11用于将核酸递送到细胞的试剂的筛选
针对转染效率和体外毒性筛选包括聚乙烯亚胺(PEI)、各种商业基于脂质的转染试剂、基于肽的转染试剂(N-TER,Sigma-Aldrich Co. LLC.)和几种基于脂质和基于甾醇的递送试剂的递送试剂。将递送试剂与RIBOSLICE BIRC5-1.2复合，并将复合物递送到培养物中的 HeLa细胞。通过在转染后24小时分析细胞密度来评估毒性。通过分析形态变化评估转染效率。测试的试剂表现出广泛的毒性和转染效率。含有较高比例酯键的试剂表现出比含有较低比例酯键或不含酯键的试剂低的毒性。
实施例12高浓度脂质体RIBOSLICE
通过将1μg RNA以500ng/pL与3μL复合培养基(Opti-MEM， Life TechnologiesCorporation)和每μg RNA 2.5μL转染试剂 (LIPOFECTAMINE 2000，Life TechnologiesCorporation)与2.5μL复合培养基混合制备高浓度脂质体RIBOSLICE。然后将稀释的RNA和转染试剂混合并在室温下温育10分钟以形成高浓度脂质体 RIBOSLICE。或者，使用含有DOSPA或DOSPER的转染试剂。
实施例13体内RIBOSLICE功效研究-皮下神经胶质瘤模型
向40只雌性NCr nu/nu小鼠皮下注射1×107个U-251肿瘤细胞。细胞注射体积为0.2mL/小鼠。研究开始时小鼠的年龄为8至12周。进行配对匹配，并且当肿瘤达到35mm3至50mm3的平均大小时，将动物分成4组，每组10只动物，并开始治疗。在前5天每天测量体重，然后每两周测量一次，直至研究结束。每两周进行卡尺测量，并计算肿瘤大小。治疗由与媒剂复合的RIBOSLICE BIRC5-2.1 (LIPOFECTAMINE 2000,Life TechnologiesCorporation)组成。为了制备给药溶液，将294μL复合缓冲液(Opti-MEM,LifeTechnologies Corporation)移液到含有196μL RIBOSLICE BIRC5-1.2(500ng/pL)的管中，并通过移液混合管的内容物。将245μL复合缓冲液移液到含有245μL媒剂的管中。将第二管的内容物混合，然后转移到第一管中，并通过移液与第一管的内容物混合以形成复合物。将复合物在室温下温育10分钟。在温育期间，装载注射器。用20μL或50μL总体积/动物中2μg或5μg RNA/动物的总剂量肿瘤内注射动物。总共给予5次治疗，每隔一天执行一次注射。剂量未根据体重进行调整。跟踪动物25天。
实施例14脂质体配制和核酸包封
使用以下配方制备脂质体：3.2mg/mL N-(羰基-乙氧基聚乙二醇 2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(MPEG2000-DSPE)、 9.6mg/mL完全氢化的磷脂酰胆碱、3.2mg/mL胆固醇、2mg/mL硫酸铵和组氨酸作为缓冲剂。使用氢氧化钠控制pH并使用蔗糖维持等渗性。为了形成脂质体，将脂质在有机溶剂中混合，干燥，在搅拌下水合，并通过经平均孔径为800nm的聚碳酸酯过滤器挤出进行尺寸分配。通过每1μg核酸组合10μg的脂质体制剂并在室温下温育5 分钟来将核酸包封。
实施例15叶酸靶向脂质体制剂
使用以下配方制备脂质体：3.2mg/mL N-(羰基-乙氧基聚乙二醇 2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(MPEG2000-DSPE)、 9.6mg/mL完全氢化的磷脂酰胆碱、3.2mg/mL胆固醇、2mg/mL硫酸铵和组氨酸作为缓冲剂以及添加到脂质混合物中的0.27mg/mL 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-5000](FA-MPEG5000-DSPE)。使用氢氧化钠控制pH并使用蔗糖维持等渗性。为了形成脂质体，将脂质在有机溶剂中混合，干燥，在搅拌下水合，并通过经平均孔径为800nm的聚碳酸酯过滤器挤出进行尺寸分配。通过每1μg核酸组合10μg的脂质体制剂并在室温下温育5分钟来将核酸包封。
实施例16包含脂质体蛋白编码RNA的疗法
根据实施例14或实施例15制备包封根据实施例1合成的编码治疗性蛋白质的合成RNA的脂质体。脂质体通过注射或静脉内输注施用。
实施例17弹性蛋白ivT-RNA模板的产生
根据制造商的说明书，使用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN GmbH) 自新生儿人真皮成纤维细胞提取总RNA。使用MonsterScriptTM逆转录酶(Epicentre Biotechnologies)和引物：AAAAAAACCGGT TCATTTTCTCTTCCGGCCAC(SEQ ID NO:483)制备编码人弹性蛋白的cDNA。使用引物：F:AAAAAAGCTAGCATGGCGGGTCTGACG (SEQ ID NO:484)和R: AAAAAAACCGGTTCATTTTCTCTTCCGGCCAC(SEQ ID NO:485) 通过PCR扩增弹性蛋白编码序列(CDS)由cDNA制备体外转录(ivT) 模板。然后使用琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒 (QIAGEN GmbH)纯化PCR产物，并将其克隆到含有人β珠蛋白 (HBB)5'和3'非翻译区和强Kozak序列的载体中。在RNA合成之前，将载体扩增，纯化并线性化。
实施例18酪氨酸酶ivT-RNA模板的产生
根据制造商的说明书，使用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN GmbH) 自人表皮黑素细胞提取总RNA。使用MonsterScriptTM逆转录酶 (Epicentre Biotechnologies)制备编码人酪氨酸酶的cDNA。通过PCR 扩增酪氨酸酶编码序列(CDS)由cDNA制备体外转录(ivT)模板。然后使用琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN GmbH) 纯化PCR产物，并将其克隆到含有人β珠蛋白(HBB)5'和3'非翻译区和强Kozak序列的载体中。在RNA合成之前，将载体扩增，纯化并线性化。
实施例19酪氨酸酶RNA的合成
根据实施例1，使用实施例18的DNA模板和T7高产量RNA合成试剂盒(New EnglandBiolabs,Inc.)根据制造商的说明书合成编码人酪氨酸酶的RNA(表4)。通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA的样品以评估RNA的质量。然后将RNA稀释至1μg/μL。将RNA溶液在4℃下储存。
实施例20通过经由注射器透皮注射编码酪氨酸酶的RNA增加皮肤中的黑色素产生
将实施例19的RNA加载到注射器中，并通过皮内注射在约30 秒的时间内将其递送到健康的33岁男性患者的前臂腹侧。
实施例21通过组合编码酪氨酸酶的RNA的递送和电穿孔来增加皮肤中的黑色素产生
使用电连接到电容器的双电极阵列将实施例20中治疗的皮肤区域暴露于10V和155V之间以及约10毫秒和约1秒之间的电脉冲。患者报告在所有电压和穿透深度处都有刺痛感。治疗区域在24-48小时后变暗。该实验重复几次，结果相似。
实施例22通过局部或皮内应用编码酪氨酸酶的RNA来增加皮肤中的黑色素产生
使用每平方厘米1微克或更少的剂量将实施例19的RNA或实施例16的脂质体直接应用到皮肤，其中有或没有角质层的破坏，或皮内注射，或通过注射到表皮而递送。任选地，如实施例21中或使用表面接触贴片施加电场以增强RNA的递送。
实施例23通过透皮递送编码弹性蛋白的RNA增加皮肤中的弹性蛋白产生
根据实施例1制备编码弹性蛋白的RNA。如实施例20、21或22 中递送RNA。
实施例24通过透皮递送编码胶原蛋白的RNA增加皮肤中的胶原蛋白产生
根据实施例1制备编码胶原蛋白的RNA。如实施例20、21或22 中递送RNA。
实施例25包含递送编码NOVEPOETIN的RNA的贫血疗法
根据实施例1制备编码NOVEPOETIN的RNA。如实施例20、 21或22中递送RNA。
实施例26通过肌肉内递送编码肌动蛋白的RNA增加骨骼肌中肌动蛋白的产生
根据实施例1制备编码肌动蛋白的RNA。如实施例20、21或22 中，在使用或不使用电场的情况下经由肌肉内注射将RNA递送到患者。
实施例27伤口愈合治疗
根据实施例1制备编码碱性成纤维细胞生长因子或IL22的RNA。如实施例20、21或22中递送RNA。
实施例28抗疤痕形成治疗
根据实施例1制备编码胶原酶的RNA。如实施例20、21或22 中递送RNA。
实施例29肉毒杆菌毒素的产生
根据实施例1制备编码肉毒杆菌毒素的RNA。如实施例20、21 或22中递送RNA。
实施例30通过用编码胶原蛋白I的RNA转染增加皮肤细胞中的胶原蛋白产生
根据实施例1合成包含人COL1A1基因的编码序列的RNA。将原代人真皮成纤维细胞在24孔板的孔中接种，并根据实施例2转染。转染后24小时和72小时之间，固定细胞并使用靶向胶原蛋白I的抗体染色。在转染的孔中可见许多细胞外胶原蛋白沉积物。
实施例31通过用编码胶原蛋白VII的RNA转染增加皮肤细胞中的胶原蛋白产生
根据实施例1合成包含人COL7基因的编码序列的RNA。将原代人真皮成纤维细胞在24孔板的孔中接种，并根据实施例2转染。转染后24小时和72小时之间，固定细胞并使用靶向胶原蛋白VII的抗体染色。与未转染的对照相比，转染的细胞表现出高水平的胶原蛋白VII。
实施例32通过经由注射器透皮注射编码胶原蛋白I或胶原蛋白 VII的RNA增加皮肤中的胶原蛋白产生
根据实施例1合成包含人COL1A1基因或人COL7基因的编码序列的RNA。将RNA加载到注射器中并在约30秒的时间内或如实施例20、21或22中所述递送到患者的真皮。
实施例33通过组合编码胶原蛋白I或胶原蛋白VII的RNA的递送和电穿孔来增加皮肤中的胶原蛋白产生
使用电连接到电源的多电极阵列将实施例32中治疗的皮肤区域暴露于10V和155V之间以及约50毫秒和约1秒之间的电脉冲。
实施例34合成RNA复合物的储存和稳定性
根据实施例5制备使用编码GFP的RNA的复合反应。温育10 分钟之后，将复合反应分成三等份，其中一份在FactorPlexTM复合培养基中以1:10稀释，其中一份在无菌无核酸酶的水中以1:10稀释，并且其中一份未稀释。然后将三份中的每一份进一步分成四等份，其中一份根据实施例3应用于原代人真皮成纤维细胞，其中一份在室温下放置6小时，然后根据实施例3应用到原代人真皮成纤维细胞，其中一份在4℃下放置6小时，然后根据实施例3应用到原代人真皮成纤维细胞，并且其中一份在液氮中快速冷冻并在-80℃下放置6小时，然后根据实施例3应用到原代人真皮成纤维细胞。在第一次转染后约 24小时使用荧光显微镜对细胞获得图像(图17)。所有孔均含有GFP 阳性细胞，表明合成RNA复合物在所有测试的储存条件下都是稳定的并维持活性。
实施例35：NOVECRIT的体内分析
根据实施例1合成编码NOVEPOETIN的RNA，其具有核苷酸组合A、G、5moU、C。在该实施例中，NOVECRIT用脂质递送媒剂，具体为LIPOFECTAMINE 3000配制。在该实施例中，NOVECRIT编码NOVEPOETIN，一种新型的高稳定性红细胞生成刺激剂。
执行15天最大耐受剂量(MTD)研究以评价安全性(大鼠，n＝62)。评价体内毒理学和生物分布以及药效学和剂量应答以及具体地对红细胞生成的治疗作用。此外，通过分析所治疗动物中的细胞因子来监测免疫应答。
使用69只初次接受实验的(naive)8周龄雄性斯普拉格-杜勒大鼠 (褐家鼠(Ratius norvegicus))，获得时体重为253克至274克(HARLAN LABORATORIES)。在给药之前使动物适应研究室至少七天。在第-2 天，将所有动物在腰背侧区域剃毛，并使用永久性标记在背部指定四个皮内部位(左上、右上、右下和左下)。将64只动物随机分配到4 个治疗组，其余5只动物作为备用。由于给药不完全，两只动物从研究中除去。
使用以下研究设计(总剂量体积(μL)恒定)：
ID：a 第15天对毒理学动物尸检，在给药后6天(b)和24小时(c) 以及在第3天(d)、第4天(e)、第6天(*)、第8天(3)和第15天(h)对TK 动物收集末端组织
在尸体剖检或末端组织收集之前，从麻醉的动物的腔静脉收集血液。只要有可能，经由单次抽取收集血液，然后适当地分开。在给药后6小时和第15天，对于第1组，每个时间点从两只动物收集用于毒代动力学分析(toxicokinetic analysis)的血液标本。对于第2组至第4 组，在给药后6小时和24小时以及在第3天、第4天、第6天、第 8天和第15天收集血液标本。
在禁食过夜后第15天自所有毒理学动物收集用于血液学评估的血液标本，并且所有TK动物计划在给药后6小时和24小时以及在第8天和第15天进行末端组织收集。将全血(1.3mL)沉积到K2EDTA 管中并使用Advia 120自动分析仪分析。
在禁食过夜后第15天自所有毒理学动物收集用于凝结评估的血液标本。将凝结标本(1.8mL)收集到3.2％柠檬酸钠管中，根据标准工序加工并使用STA Compact自动分析仪分析。
在禁食过夜后第15天自所有毒理学动物收集用于血清化学评估的血液标本。将血清化学标本(1mL)收集到血清分离管中，根据标准工序加工并使用AU680分析仪分析。
在给药后5小时和24小时以及在第8天自计划用于末端组织收集的动物收集用于细胞因子分析的血液标本。将细胞因子标本(1mL) 收集到K2EDTA管中并根据标准工序加工成血浆。研究血浆样品中的TNFa、IL-6和IFNa细胞因子水平。该研究在第1天(给药后6小时)、第2天(给药后24小时)和第8天用测试制品给药后测量血浆样品中TNFa、IL-6和IFNa细胞因子的产生。
细胞因子分析样品的研究概要：
b＝给药后6小时收集的血浆样品，c＝给药后24小时收集的血浆样品，g＝给药后8天收集的血浆样品。
对于TNFa分析，使用来自R&D SYSTEMS(目录号RTA00)的市售测定试剂盒分析血浆样品。大鼠TNFa ELISA是固相酶联免疫吸附测定。ELISA试剂盒采用TNFa特异性抗大鼠单克隆抗体进行固相固定(预涂在微量滴定板上)，并将HRP与抗大鼠TNFa多克隆抗体缀合以进行检测。用试剂盒提供的参考标准品是重组大鼠TNFa。对于每个测定，血浆样品和标准品用各个相应试剂盒中提供的稀释剂稀释。对于TNFa ELISA，血浆样品以1:2稀释。标准曲线由范围为800 pg/mL至12.5pg/mL的六(6)种连续2倍浓度组成。对照物用稀释剂复原，并且空白仅含有稀释剂。
在样品、标准品、对照物或稀释剂添加(每孔50μL，每种一式两份)后，将板在室温下温育2小时。在洗涤步骤以除去未结合的物质后，将HRP缀合物添加到每个孔(100μL/孔)中，并将板在室温下温育2小时。在第二洗涤步骤后，将100μL/孔TMB底物添加到板中。将板在室温下温育30分钟，避光，以使显色反应显色。在添加HCl 停止溶液(100μL/孔)后反应停止。在添加停止溶液后30分钟内，在 SpectraMax 340(MOLECULAR DEVICES)酶标仪上在450nm处读取光密度。测量的颜色的强度与初始步骤中结合的大鼠TNFa的量成比例。为每个测定板产生标准曲线，并通过内插来自标准曲线的吸光度A450值和稀释因子来确定测试样品TNFa浓度。TNFa试剂盒的测定范围为12.5pg/mL至800pg/mL，其中最小可检测浓度小于10pg/mL(血浆样品需要的最小稀释度为1:2)。
对于IL-6分析，使用来自R&D SYSTEMS(目录号R6000B-IL-6) 的市售测定试剂盒分析血浆IL-6样品。大鼠IL-6ELISA是固相酶联免疫吸附测定。ELISA试剂盒采用抗大鼠IL-6单克隆抗体进行固相固定(预涂在微量滴定板上)，并将HRP与IL-6特异性抗大鼠多克隆抗体缀合以进行检测。用试剂盒提供的参考标准品是重组大鼠IL-6。在不稀释的情况下使用血浆样品(如提供的)，并用试剂盒中提供的稀释剂稀释标准品。标准曲线由范围为4,000pg/mL至62.5pg/mL的六 (6)种连续2倍浓度组成。对照物用稀释剂复原，并且空白仅含有稀释剂。在样品、标准品、对照物或稀释剂添加(每孔50μL，每种一式两份)后，将板在室温下温育2小时。在洗涤步骤以除去未结合的物质后，将HRP缀合物添加到每个孔(100μL/孔)中，并将板在室温下温育2小时。在第二洗涤步骤后，将100μL/孔TMB底物添加到板中。将板在室温下温育30分钟，避光，以使显色反应显色。在添加HCl 停止溶液(100μL/孔)后反应停止。在添加停止溶液后30分钟内，在 SpectraMax 340(MOLECULAR DEVICES)酶标仪上在450nm处读取光密度。测量的颜色的强度与初始步骤中结合的大鼠IL-6的量成比例。为每个测定板产生标准曲线，并通过内插来自标准曲线的吸光度 A450值和稀释因子来确定测试样品IL-6浓度。IL-6试剂盒的测定范围为62.5pg/mL至4,000pg/mL，其中最小可检测浓度小于21pg/mL。
对于IFNa分析，使用来自NOVATEINBIO(目录号 BG-RAT11380)的市售测定试剂盒分析血浆IFNa样品。ELISA是固相酶联免疫吸附测定。ELISA试剂盒采用抗大鼠IFNa单克隆抗体进行固相固定(预涂在微量滴定板上)，并将HRP与IFNa特异性抗体缀合以进行检测。将血浆样品以1:4稀释，并使用如试剂盒中提供的标准品。标准品由范围为100pg/mL至3.1pg/mL的六(6)种连续2倍浓度组成。空白仅包含稀释剂。在样品、标准品或稀释剂添加(每孔50μL，每种一式两份)后，将HRP缀合物添加到每个孔(100μL/孔)中，并将板在37℃下温育1小时。在洗涤步骤之后，将50μL/孔的每种色原溶液A和色原溶液B添加到板中。将板在37℃下温育15分钟，避光，以使显色反应显色。在添加停止溶液(50μL/孔)后反应停止。在SpectraMax 340(MOLECULAR DEVICES)酶标仪上在450nm处读取光密度。测量的颜色的强度与初始步骤中结合的大鼠IFNa的量成比例。为每个测定板产生标准曲线，并通过内插来自标准曲线的吸光度 A450值和稀释因子来确定测试IFNa浓度。IFNa试剂盒的测定范围为3.1pg/mL至100pg/mL，其中最小可检测浓度小于1pg/mL(4 pg/mL，血浆样品需要以1:4稀释)。
该研究的结果尤其是在给药后24h未在注射部位检测到 NOVECRIT(如通过RT-PCR测定)。更具体地讲，在任何以下样品中未检测到NOVECRIT(RT-PCR)：血清(给药后6h、24h、48h和72h)、肝脏(给药后6h和24h)和肾脏(给药后6h和24h)。另外，阳性对照 (掺杂NOVECRIT)在所有组织中产生稳健的信号(如通过RT-PCR测定的)。图18描绘单次施用NOVECRIT诱导NOVEPOIETIN在血清中的快速增加和持续水平。Y轴显示NOVEPOIETIN蛋白的浓度 (mU/mL)。这表明，不希望受理论束缚，所研究的RNA治疗剂能够提供治疗上重要的药效学性质。事实上，相对于野生型EPO(本领域已知其具有约4-12小时的半衰期)，该PD行为得到极大改善。
此外，掺杂NOVECRIT的血清显示RNA几乎立即降解(如通过 RT-PCR测定)。不希望受理论束缚，该数据指示本发明的RNA治疗剂是安全的并且几乎没有毒性极限如肝或肾毒性的可能性。
图19描绘单次施用NOVECRIT刺激红细胞生成，产生升高的血细胞比容，持续至少14天。左图在Y轴上显示血细胞比容％，而右图显示网织红细胞％。因此，研究的RNA治疗剂是完全功能性的。
关于细胞因子，在该研究中评价的每个时间点，IL-6和TNFa细胞因子水平低于所有动物的测定检测阈值。仅在第3组和第4组的动物的第8天样品中可检测到低水平的IFN-a。图20描绘汇总在雄性斯普拉格杜勒大鼠中从最大耐受剂量的NOVECRIT收集的血浆样品中 TNFa、IL-6和IFNa细胞因子水平的表格。不希望受理论束缚，该数据指示本发明的RNA治疗剂不刺激不利的免疫原性，这限制某些 RNA治疗剂的治疗效用。
实施例36：COL7A1基因的基因编辑
将本发明的基于RNA的基因编辑方法应用于COL7A1基因。该基因是所关注的，因为其尤其常参与营养不良性大疱性表皮松解症。图21描绘使用用靶向位于COL7A1基因内的序列 TGAGCAGAAGTGGCTCAGTG(SEQ ID NO:467)和 TGGCTGTACAGCTACACCCC(SEQ ID NO:468)的RNA TALEN转染的原代成人真皮成纤维细胞的DNA的SURVEYOR测定。+RNA 泳道中存在的条带指示常参与营养不良性大疱性表皮松解症的基因区域的编辑。图22描绘使用用现在靶向位于COL7A1基因内的序列 TTCCACTCCTGCAGGGCCCC(SEQ ID NO:469)和TCGCCCTTCAGCCCGCGTTC(SEQ ID NO:470)的RNA TALEN转染的原代成人真皮成纤维细胞的DNA的另一SURVEYOR测定。 +RNA泳道中存在的条带指示常参与营养不良性大疱性表皮松解症的基因区域的编辑。该数据尤其指出一种基因编辑方法，其用于治疗某些遗传性病症，诸如营养不良性大疱性表皮松解症。
实施例37：使用具有非规范核苷酸的合成RNA基因编辑MYC 基因
用含有非规范核苷酸且编码基因编辑蛋白的体外转录的合成 RNA分子进行实验。评价体外转录的合成RNA分子(以及对照物)的免疫原性和基因编辑效率，所述合成RNA分子具有(1)仅假尿苷(psU) 作为非规范核苷酸；(2)仅5-甲基胞苷(5mC)作为非规范核苷酸；和(3) 假尿苷和5-甲基胞苷两者作为非规范核苷酸。
具体地讲，根据本文所述的方法合成含有以下核苷酸组合：(i)A、 G、U、C，(ii)A、G、psU、C，(iii)A、G、U、5mC，和(iv)A、G、 psU、5mC且编码靶向下列DNA序列的TALEN对的RNA，所述DNA 序列可以在MYC基因中见到：TCGGCCGCCGCCAAGCTCGT(SEQ ID NO:474)和TGCGCGCAGCCTGGTAGGAG(SEQ ID NO:475)。将人真皮成纤维细胞(MA001SK)在6孔组织培养板和24孔组织培养板中在具有10％FBS的DMEM中分别以100,000个细胞/孔和10,000 个细胞/孔接种。次日，根据本文所述的方法，在6孔板中用2μg RNA (TALEN对的每种组分，1μg)转染细胞，并在24孔板中用0.2μg RNA (TALEN对的每种组分，0.1μg)转染细胞。转染后24小时，使用RNeasy 微型试剂盒(74106；QIAGEN)分离来自24孔培养板中的细胞的总 RNA，包括自未用RNA转染的细胞样品中分离总RNA(阴性对照物；在图23中的“Neg.”)。通过用DNA酶I(无RNA酶)(M0303L；NEW ENGLAND BIOLABS)消化15分钟除去基因组DNA，并使用RNeasy 微型试剂盒纯化反应。使用1μL的总RNA以使用被设计用于检测免疫原性标志物TLR3、IFIT1和IFIT2的表达的TAQMAN基因表达测定(APPLIED BIOSYSTEMS)通过实时RT-PCR评估基因表达(图23)。将数据标准化为阳性实验对照样品(“A、G、U、C”)和加载对照物 (GAPDH)两者。
转染后48小时，使用DNeasy血液和组织试剂盒(69506；QIAGEN) 自6孔培养板中的细胞中分离基因组DNA，包括自未用RNA转染的细胞样品(阴性对照物，在图24中的“Neg.”)。使用含有以下引物的 35个循环的两步PCR反应扩增预测的TALEN切割位置周围的MYC 基因的970bp区域：TAACTCAAGACTGCCTCCCGCTTT(SEQ ID NO:476)和AGCCCAAGGTTTCAGAGGTGATGA(SEQ ID NO: 477)。在5μL的来自RNA处理的细胞的扩增序列中的160ng与在5 μL的来自未处理的MA001SK细胞的扩增序列中的160ng通过混合这两个序列与0.5μL的1M KCl和0.5μL的25mM MgCl2并在热循环仪中运行以下程序来杂交：95℃，10分钟；95℃至85℃，0.625C/s；85℃至25℃，0.125C/s。通过将0.5pL的SURVEYOR核酸酶和0.5μL 的来自SURVEYOR突变检测试剂盒(706020I；INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES)的增强子添加到杂交产物中，混合并在42℃下温育25分钟来执行SURVEYOR测定。上述方案也用于加工用作为 SURVEYOR测定的阳性实验对照物的SURVEYOR突变检测试剂盒提供的阳性对照DNA样品(图24中的“测定阳性”)。样品通过琼脂糖凝胶电泳分析(图24)。对于每个样品，基因编辑效率计算为消化条带的强度(图24中用“*”指示)与未消化条带强度的比率。
如下图23所示，来自用阳性对照RNA(A、G、U、C)转染的细胞的样品和来自用含有假尿苷或5-甲基胞苷的RNA转染的细胞的样品表现出所有三种免疫原性标志物TLR3、IFIT1和IFIT2的上调。来自用含有假尿苷和5-甲基胞苷两者的RNA转染的细胞的样品表现出免疫原性标志物的可忽略的上调(小于阳性对照的0.01倍)，表明具有假尿苷和5-甲基胞苷两者且编码基因编辑蛋白的体外转录的合成 RNA可以逃避由哺乳动物细胞的先天免疫系统进行的检测。
另外，如下图24所示，来自用含有假尿苷和5-甲基胞苷两者的 RNA转染的细胞的样品表现出高效的基因编辑(41.7％)，其大于由来自用仅含有假尿苷的RNA转染的细胞的样品表现出的效率(35.2％)，表明包含假尿苷和5-甲基胞苷两者并编码基因编辑蛋白的体外转录的合成RNA可以(i)高效率地基因编辑哺乳动物细胞，和(ii)以比包含假尿苷且不包含5-甲基胞苷的体外转录的合成RNA高的效率基因编辑哺乳动物细胞。
实施例38：在人细胞中的COL7A1基因编辑和修复
根据实施例1合成编码靶向COL7A1基因中的以下序列的基因编辑蛋白的RNA：TGAGCAGAAGTGGCTCAGTG(SEQ ID NO:473) 和TGGCTGTACAGCTACACCCC(SEQ ID NO:468)(也参见下表)。
RNA合成
将50,000个原代人表皮角质形成细胞(HEKn，Gibco)在6孔板的孔中在EpiLife+Supplement S7中接种。次日，根据实施例3用1μg 的编码基因编辑对的每种组分的RNA和2μg的长度为60、70、80、 90或100个核苷酸(“nt”)的单链DNA修复模板转染细胞。转染后48 小时，纯化基因组DNA。使用引物GCATCTGCCCTGCGGGAGATC (SEQ ID NO:478)和CCACGTTCTCCTTTCTCTCCCCGTTC(SEQ ID NO:479)扩增一段COL7A1基因，其产生535 bp的扩增子。根据制造商的说明书使用T7核酸内切酶I(“T7E1”，New England Biolabs) 评估基因编辑的效率。约385bp和150bp的条带指示成功的基因编辑。图25和图29显示通过琼脂糖凝胶电泳分析的用T7EI消化的结果。图27和图29显示通过琼脂糖凝胶电泳分析的用MluI-HF消化的结果。因为修复模板含有序列ACGCGT(SEQ ID NO:480)，用MluI-HF (New EnglandBiolabs)消化扩增的产物在成功基因修复的情况下产生约385bp和150bp的条带。
根据实施例1合成编码靶向COL7A1基因中的以下序列的基因编辑蛋白的RNA：TGAGCAGAAGTGGCTCAGTG(SEQ ID NO:473) 和TGGCTGTACAGCTACACCCC(SEQ ID NO:468)。将50,000个原代人表皮角质形成细胞(HEKn，Gibco)在6孔板的孔中在EpiLife+ SupplementS7中接种。次日，根据实施例3用1μg的编码基因编辑对的每种组分的RNA和1-4μg的80个核苷酸的单链DNA修复模板转染细胞。转染后48小时，纯化基因组DNA。使用引物GCATCTGCCCTGCGGGAGATC(SEQ ID NO:481)和 CCACGTTCTCCTTTCTCTCCCCGTTC(SEQ ID NO:482)扩增一段 COL7A1基因，其产生535bp的扩增子。根据制造商的说明书使用 T7核酸内切酶I(“T7E1”，New England Biolabs)评估基因编辑的效率。约385bp和150bp的条带指示成功的基因编辑。图26显示通过琼脂糖凝胶电泳分析的用T7EI消化的结果。图28显示通过琼脂糖凝胶电泳分析的用MluI-HF消化的结果。因为修复模板含有序列 ACGCGT(SEQ ID NO:480)，用MluI-HF(New England Biolabs)消化扩增的产物在成功基因修复的情况下产生约385bp和150bp的条带。
实施例39：BMP7变体在人细胞中的表达
根据实施例1合成编码野生型BMP7的RNA和编码BMP7变体的RNA(也参见下表)。
RNA合成
| 模板 | 核苷酸 | 反应体积/μL | ivT产量/μg |
| BMP7野生型 | A、G、5moU、C | 15 | 125.8 |
| BMP7变体A | A、G、5moU、C | 15 | 120.36 |
| BMP7变体B | A、G、5moU、C | 15 | 143.14 |
| BMP7变体C | A、G、5moU、C | 15 | 106.42 |
将50,000个原代人真皮成纤维细胞(MA001SK，Factor Bioscience) 或100,000个原代人表皮角质形成细胞(HEKn，Gibco)分别在DMEM +10％FBS或EpiLife+Supplement S7中接种。根据实施例3用1μg 的编码野生型BMP7或其变体的RNA转染细胞。转染后24小时，对培养基取样，并根据制造商的说明书用人BMP7ELISA试剂盒 (ab99985，Abeam)使用稀释10倍的培养基测量分泌的BMP7水平。通过使用酶标仪(EMax Plus,Molecular Devices)测量450nm下的吸光度来确定分泌的BMP7水平。分泌的BMP7水平显示在图30中。
实施例40：甲状旁腺激素(PTH)在人细胞中的表达
根据实施例1合成编码PTH的RNA(也参见下表)。
RNA合成
| 模板 | 核苷酸 | 反应体积/μL | ivT产量/μg |
| PTH | A、G、5moU、C | 15 | 51.68 |
将100,000个人表皮角质形成细胞(HEKn，Gibco)在EpiLife+ Supplement S7中接种。根据实施例3用1μg的编码PTH的RNA转染细胞。转染后24小时，对培养基取样，并根据制造商的说明书使用人PTH ELISA试剂盒(EIA-PTH-1,Ray Biotech)测量分泌的PTH水平。通过使用酶标仪(EMax Plus,Molecular Devices)测量450nm下的吸光度来确定分泌的PTH水平。分泌的PTH水平显示在图31中。
实施例41：皮内、皮下、直肠和鼻腔施用NOVECRIT以治疗贫血
对于贫血治疗进行Novecrit的重复剂量毒性研究。具体地讲，在第1天、第8天和第15天，每天一次经由皮内、皮下、直肠或鼻途径对8-10周龄雄性斯普拉格杜勒大鼠施用Novecrit。将动物分配到组中并如下表所指示进行治疗：
注：总剂量体积(μL/动物)是恒定的。
a 毒性动物(也称为主要研究动物)，在第44天进行尸检
b TK动物，在第2天、第16天、第23天和第44天使其安乐死， n＝2/时间点
更具体地讲，第1组经由皮内注射给药。每一剂量以50pL/注射的四次皮内注射施用，每只动物总共接受200uL。在腰背部区域中线附近的先前标记部位(左上、右上、左下和右下象限)进行注射。第2 组给予四次皮内注射到腰背部区域中线附近的先前标记部位(左上、右上、左下和右下象限)，每次注射0.25μg(总共1.0μg)。第3组通过皮下注射给药到位于下背侧胸/腰部区域的背部区域。第4组通过直肠施用给药。手动限制动物并手动触诊每只大鼠的腹部以除去任何粪便物质。如果认为有必要，则将直肠用最多2ml的生理盐水冲洗灌肠，然后手动触诊腹部以除去粪便物质(如果有的话)。将Novecrit吸入注射器中，并将具有圆形尖端(球)的适当大小的管饲针连接到注射器上。将润滑剂胶状物应用到插入装置上以帮助插入；其被推进到大肠腔内约1cm，并且滴注Novecrit。然后将大鼠维持成头低位置约20秒至30秒以限制溶液的排出。第5组经由鼻途径给药。将动物麻醉(根据SNBL USA SOP)。使动物仰卧，头抬高。将剂量缓慢分配到鼻孔中。将约一半的剂量体积施用到一只鼻孔。将剩余的剂量体积施用到另一个鼻孔。第1天施用第一剂量，且第15天施用最后剂量。
临床监测大鼠，包括食物消耗和体重。此外，收集血液用于血液学、凝结和血清化学分析，如下指示：
毒性组标本收集频率
x＝执行工序的次数
对毒代动力学组进行如下分析：
文本表3：毒代动力学组标本收集频率
x＝执行工序的次数
TK＝毒代动力学
毒性动物的终末尸检发生在第44天。在第2天、第16天、第 23天和第44天使TK动物安乐死。对动物进行病理学分析。
如图32所示，与对照相比，在所有四个研究组中施用NOVECRIT 刺激红细胞生成引起血细胞比容升高至少14天。
实施例42：皮内施用编码BMP7变体的RNA用于治疗糖尿病性肾病
利用ZDSD大鼠模型来研究编码BMP7变体的RNA对预防和治疗糖尿病性肾病的作用。具体地讲，用皮内施用的编码BMP7变体的 RNA治疗ZDSD大鼠。研究设计的示意图提供在图33中。将动物分配到组中并如下表所指示进行治疗：
a 将“预防”组结束的第1组动物随机分到第6组和第7组(分别地各自，n＝20或10)以限定“治疗”组。使来自第1组的剩余6只动物安乐死以进行肾脏收集并在“预防”组结束抽血。
为了研究RNA对预防糖尿病性肾病的作用，将动物从围栏 (PCO-5638)运送到动物园(PCO-Rm C)并允许3天适应环境。将所有动物置于5SCA致糖尿病饮食持续3周(每周进行体重测量)。然后在研究期间使动物恢复到常规5008饮食(每周进行体重测量)。在5008 饮食2周后，对所有动物执行体重测量、抽血(500ul)和24小时基线尿液收集(尿白蛋白和肌酸酐测量)。基于体重、葡萄糖和尿白蛋白将 36只大鼠随机分到第1组、第2组和第3组。第1组、第2组、第3 组和第4组经由皮内施用(2次/周，周一和周四)接受媒剂或测试制品 (i.d.)。第5组施用混和在5008饮食中的赖诺普利(食物消耗将对这组动物开始)。在前2周每次给药后24小时，从第2组、第3组和第4 组抽取血液(500ul，尾静脉)，然后每周抽血1次。给药4周后，从所有动物(第1组至第5组)中经由尾静脉抽取血液样品(500ul)。在给药8周结束时，执行24小时尿液收集(尿白蛋白和肌酸酐测量)以及自第1组的尾静脉(500ul)血液取样(n＝18进入治疗组)。尿量、肌酸酐和白蛋白的结果显示在图35中。如图35所示，与对照相比，用编码 BMP7变体A的RNA治疗引起患有糖尿病性肾病的大鼠中尿白蛋白水平降低，指示与对照动物(安慰剂组)相比，所治疗的动物具有较优的肾功能。为了结束研究，用CO2窒息使所有动物安乐死，并且经由心脏穿刺执行抽血以收集血清用于BUN、肌酸酐和葡萄糖以及收集血浆用于化合物暴露和生物标志物分析。将两个肾切开并固定用于组织学。图34显示第1组、第2组、第3组和第4组中BMP7蛋白的血清水平。结果指示，这些组中BMP7蛋白的血清水平如下：第4 组、第3组>第2组、第1组。
还进行了一项研究以分析编码BMP7变体的RNA对治疗糖尿病性肾病的作用。具体地讲，将来自第1组(预防组，n＝18)的媒剂动物基于体重、葡萄糖和尿白蛋白进行随机分组(第6组，n＝20；第7 组，n＝10)。动物分别接受媒剂或编码BMP7变体的RNA(皮内，2 次/周，周一和周四)，第6组和第7组。治疗4周后，用CO2窒息使动物安乐死，并且经由心脏穿刺执行抽血以收集血清用于BUN、肌酸酐和葡萄糖以及收集血浆用于化合物暴露和生物标志物分析。将两个肾切开并固定用于组织学。如图36所示，用编码BMP7变体A的 RNA治疗显著降低患有糖尿病性肾病的大鼠的尿白蛋白水平(p＝ 0.0015)，指示在所治疗的动物中具有较优的肾功能。此外，治疗组显示结束时肾脏重量显著降低(p＝0.018)，且结束时血清肌酐显著降低 (p＝0.016)。这些结果表明，与对照动物(安慰剂组)相比，编码BMP7 变体的RNA有效地治疗糖尿病性肾病并促进优异的肾功能。
下面提供一种说明性研究方案：
*BW：体重测量
在一项说明性研究中，将方案根据上述到研究结束进行如下修改：
在两项研究期间，病理分析如下进行：
总之，这些结果提示编码BMP-7变体的RNA有效地防止大鼠中糖尿病性肾病的发展。此外，这些RNA还有效地治疗并恢复已经患有糖尿病性肾病的大鼠的肾功能。编码BMP7变体A的RNA在预防和治疗大鼠的糖尿病性肾病方面特别有效。
实施例43：用编码BDNF、BMP-2、BMP-6、IL-2、IL-6、IL-15、 IL-22、LIE或FGF-21的RNA转染人角质形成细胞
将100,000个人表皮角质形成细胞(HEK，Gibco)在EpiLife+ Supplement S7中接种。根据实施例3用2μg的编码BDNF、BMP-2、BMP-6、IL-2、IL-6、IL-15、IL-22、LIF或FGF-21的RNA转染细胞。转染后24小时，对培养基取样，并根据制造商的说明书使用人ELISA 试剂盒(参见下表)测量分泌的蛋白质水平。通过使用微酶标仪(EMax Plus,Molecular Devices)测量450nm下的吸光度来确定分泌的蛋白质水平。分泌的蛋白质水平显示在图34，图37 中的 A-I中。
| 蛋白质 | 部件编号 | 供应商 |
| BDNF | DBNTOO | R&D Systems |
| BMP-2 | DBP200 | R&D Systems |
| BMP-6 | ab99984 | Abeam |
| IL-2 | D2050 | R&D Systems |
| IL-6 | D6050 | R&D Systems |
| IL-15 | D1500 | R&D Systems |
| IL-22 | D2200 | R&D Systems |
| LIF | DLFOO | R&D Systems |
| FGF-21 | DF2100 | R&D Systems |
实施例44：用编码IL-15和/或IL-15RA的RNA转染人角质形成细胞
将100,000个人表皮角质形成细胞(HEK，Gibco)在EpiLife+ Supplement S7中接种。根据实施例3用2μg的编码IL-15的RNA或各1μg的编码IL-15的RNA和编码IL-15RA的RNA转染细胞。转染后24小时，对培养基取样，并根据制造商的说明书使用人IL-15 ELISA试剂盒(D1500,R&D Systems)测量分泌的IL-15水平。通过使用酶标仪(EMax Plus,MolecularDevices)测量450nm下的吸光度来确定分泌的IL-15水平。分泌的IL-15平显示在图35中。如图35所表明，与单独用IL-15转染相比，IL-15和IL-15RA的共转染显著增加分泌的IL-15水平。
实施例45：经由在大鼠中皮内注射进行的药代动力学研究
进行研究以评价斯普拉格杜勒大鼠对皮内施用各种RNA的响应。具体地讲，对于该研究使用体重为约200g至约350g的8至10 周龄的雌性斯普拉格杜勒大鼠。测试总共33只大鼠，并将动物分配到研究组并如下表所指示进行治疗：
a 总剂量体积(μL/动物)是恒定的。每只动物接受50μL/注射的四次皮内注射，每只动物总共接受200μL。
b 动物，在第3天使其安乐死，未经检查或尸检
皮内＝ID
对于该研究，用4ug RNA治疗动物。所有组均经由皮内注射给药。每一剂量以50pL/注射的四次皮内注射施用，每只动物总共接受 200uL。在腰背侧部区域中线附近的先前标记部位(左上、右上、左下和右下象限)进行注射。记录给药时间(最后注射后)。根据需要进行额外的标记以允许识别给药部位。在第1天对动物施用RNA并且在第3天使其安乐死。每天两次对大鼠进行临床观察。还监测食物消耗和体重。
在研究期间，从颈静脉收集约1ml的血液样品用于如下药代动力学分析：
| 时间点 | PK<sup>a</sup> |
| 适应环境 | - |
| 第1天 | 给药后12小时 |
| 第2天 | 给药后24小时 |
| 第3天 | 给药后48小时 |
a 血液收集的时间点(n＝3只动物/组/时间点)
PK＝药代动力学
结果指示，在施用编码FGF21、IL15、IL15和IL15R、IL6、IL22 和NOVEPOEITIN的RNA后，在血液中容易检测到这些蛋白质，在注射后约12小时蛋白质水平达到峰值(图39)。值得注意的是，在该研究中测试的蛋白质可以被细胞和组织吸收和/或可以在表达位点附近发挥作用而在体循环中没有明显的积聚。
实施例46：包含编码IL22的RNA的伤口愈合疗法
将原代人表皮角质形成细胞(HEKn-APF)在涂有重组人1型胶原蛋白的6孔板中在角质形成细胞培养基(EpiLife+Supplement S7)中以 200,000个细胞/孔的密度接种。2 4h后，用2μg/孔根据实施例1合成的编码IL22的RNA转染细胞，并向孔中添加50mM D-葡萄糖。接下来的一天，使用塑料10μL移液管尖端在每个孔中划线。在划线后 0h和24h对孔获得图像。使用两次测量划痕的大小，并通过计算24 h的划痕的大小与0h的划痕的大小的比率来确定愈合(图40)。
实施例47：在人细胞中的A1AT基因编辑和修复
根据实施例1合成编码靶向A1AT基因中的以下序列的基因编辑蛋白的RNA：L1：TAAGGCTGTGCTGACCATCG(SEQ ID NO:611)、 R1：TAAAAACATGGCCCCAGCAG(SEQ ID NO:612)和R2： TCTAAAAACATGGCCCCAGC(SEQ ID NO:613)。对细胞进行基因编辑，并根据实施例38测量基因编辑效率(图41)。另外，用靶向序列L1和R1的基因编辑蛋白和包含序列： cccctccaggccgtgcataaggctgtgctgaccatcgacgtcaaagggactgaagctgctggggccat gtttttagaggcc(SEQID NO：614)的修复模板共转染细胞，并且使用AatII 酶根据实施例38测量基因修复效率(图42)。用靶向A1AT基因中的以下序列的基因编辑蛋白转染另一个细胞样品：L2：TGCCTGGTCCCTGTCTCCCT(SEQ ID NO:615)和R3： TGTCTTCTGGGCAGCATCTC(SEQ ID NO:616)。根据实施例38测量基因编辑效率(图43)。
实施例48：包含编码基因编辑蛋白的RNA和修复模板的α-1抗胰蛋白酶缺乏症疗法
编码靶向以下序列的基因编辑蛋白的RNA：L： TAAGGCTGTGCTGACCATCG(SEQ IDNO:611)和R： TAAAAACATGGCCCCAGCAG(SEQ ID NO:612)和包含序列：RT： cccctccaggccgtgcataaggctgtgctgaccatcgacgagaaagggactgaagctgctggggccat gtttttagaggcc(SEQ IDNO:617)的修复模板根据本发明的方法用媒剂配制并通过门静脉内施用递送到患有A1AT缺乏症的受试者，引起受试者的肝细胞中Z突变校正、受试者的肝细胞中聚合的Z蛋白积聚减少、功能性A1AT的分泌和血清水平增加、以及一种或多种受试者症状减轻。
实施例49：包含编码基因编辑蛋白的RNA的弗里德里希氏共济失调疗法
编码能够在FXNA(SEQ ID NO：582)中产生一处或多处双链断裂的一种或多种基因编辑蛋白的RNA和编码能够在FXNB(SEQ ID NO: 583)中产生一处或多处双链断裂的一种或多种基因编辑蛋白的RNA 根据实施例1合成。RNA根据本发明的方法配制，并使用导管将其递送到患有弗里德里希氏共济失调的患者的心脏。靶序列对选自：对 1：TCCCACACGTGTTATTTGGC(SEQ ID NO:618)和 TGGCAACCAATCCCAAAGTT(SEQ ID NO:619)；对2： TAATAAATAAAAATAAAAAA(SEQ ID NO:620)和 TTGCCTATTTTTCCAGAGAT(SEQ ID NO:621)。
实施例50：包含编码基因编辑蛋白的RNA的α-1抗胰蛋白酶缺乏症疗法
编码能够在A1AT_A(SEQ ID NO:584)中产生一处或多处双链断裂的一种或多种基因编辑蛋白的RNA根据实施例1合成。RNA根据本发明的方法配制，并且通过门静脉内注射递送到患有A1AT缺乏症的患者的肝脏。
实施例51：包含编码基因编辑蛋白的RNA和短修复模板的α-1 抗胰蛋白酶缺乏症疗法
编码能够在A1AT_B(SEQ ID NO:585)中产生一处或多处双链断裂的一种或多种基因编辑蛋白的RNA根据实施例1合成。RNA和含有序列：A1AT_RT(SEQ ID NO:586)的单链DNA序列根据本发明的方法配制，并且通过门静脉内注射递送到患有A1AT缺乏症的患者的肝脏。
实施例52：包含DNA结合和脱氨酶活性的基因编辑蛋白
编码包含两个或多个重复序列，然后是：BASE_EDIT_FRONT (SEQ ID NO:587)，其次是：BASE_EDIT_ADA1(SEQ ID NO:588)、 BASE_EDIT_ADA2(SEQ ID NO:589)、BASE_EDIT_ADA3(SEQ ID NO:590)、BASE_EDIT_ADA4(SEQ ID NO:591)、BASE_EDIT_CDA1 (SEQ ID NO:592)和BASE_EDIT_CDA2(SEQ ID NO:593)中的任一个的基因编辑蛋白的RNA根据实施例1合成。基因编辑蛋白能够校正靶序列下游1至50个碱基内的一处或多处突变。
实施例53：A1AT、COL7A1、HBB和PD-1的基因编辑
参考实施例1，表4，使用以下模板和靶标：
将约100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞在EpiLife+ Supplement S7中接种，并且根据实施例3用编码靶向序列L： TGCCTGGTCCCTGTCTCCCT(SEQ ID NO:615)和R：TGTCTTCTGGGCAGCATCTC(SEQ ID NO:616)的基因编辑蛋白的 RNA转染，所述序列位于距α-1抗胰蛋白酶(A1AT)起始密码子约75 bp处。对细胞进行基因编辑，并且如先前所述测量基因编辑效率。如图46所示的结果表明由基因编辑蛋白实现的高效基因编辑。
将约100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞在EpiLife+ Supplement S7中接种，并且根据实施例3用编码靶向序列L： TATTCCCGGGCTCCCAGGCA(SEQ ID NO:622)和R：TCTCCTGGCCTTCCTGCCTC(SEQ ID NO:612)的基因编辑蛋白的 RNA转染，这些序列位于COL7A1的外显子73的末端附近。对细胞进行基因编辑，并且如先前所述测量基因编辑效率。如图47所示的结果表明由基因编辑蛋白实现的高效基因编辑。
将约50,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞在EpiLife+ Supplement S7中接种，并且根据实施例3用编码靶向序列L： TATTCCCGGGCTCCCAGGCA(SEQ ID NO:622)和R：TCTCCTGGCCTTCCTGCCTC(SEQ ID NO:612)的各种基因编辑蛋白的RNA转染，这些序列位于COL7A1的外显子73的末端附近。具体地讲，基因编辑蛋白包含FokI的内切核酸酶裂解结构域及其变体。变体包括具有增强活性的FokI变体(S35P、K58E)、FokI异二聚体(即L：Q103E、N113D、I116L；和R：E107K、H154R、I155K) 及其组合(即，L：S35P、K58E、Q103E、N113D、I116L；和R：S35P、 K58E、E107K、H154R、I155K)。对细胞进行基因编辑，并且如先前所述测量基因编辑效率。如图48所示的结果表明由基因编辑蛋白实现的高效基因编辑。
将约100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(无动物蛋白)在EpiLife+Supplement S7中接种。根据实施例3用2μg的编码HBB 外显子1TALEN L和HBB外显子1TALENR基因编辑蛋白(各1μg) 的RNA转染细胞。在转染后48小时，收获DNA并分析基因编辑(T7E1测定；正向引物：gccaaggacaggtacggctgtcatc(SEQ ID NO:627)；反向引物：cttgccatgagccttcaccttagggttg(SEQ ID NO:628)；产物大小：518 nt；预测的条带大小：300nt、218nt)。如图61所示的结果表明由基因编辑蛋白实现的高效基因编辑。
将约100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(无动物蛋白)在 EpiLife+Supplement S7中接种。根据实施例3用2μg的编码PD1外显子1TALEN L和PD1外显子1TALENR基因编辑蛋白(各1μg)的 RNA转染细胞。在48小时后，收获DNA并分析基因编辑(T7E1测定；正向引物：tcctctgtctccctgtctctgtctctctctc(SEQ ID NO:594)；反向引物：ggacttgggccaggggaggag(SEQ ID NO:595)；产物大小：612nt；预测的条带大小：349nt、263nt)。如图62所示的结果表明由基因编辑蛋白实现的高效基因编辑。
实施例54：用编码GDF15、IFKB、KRT5、KRT14、SOD3或hESM1 的RNA转染原代人角质形成细胞
如图49所示，将100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞在 EpiLife+Supplement S7中接种。根据实施例3用2μg的编码hGDF15 的RNA转染细胞。转染后，在不同时间点对培养基取样，并且根据制造商的说明书使用ELISA(R&D DGD150)分析hGDF15水平。图 49表明转染后hGDF15水平以时间依赖性方式上调。
如图50所示，将100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞在 EpiLife+Supplement S7中接种。根据实施例3用2μg的编码IFKB 或IFKB变体(S32A和S36A)的RNA转染细胞。转染后，在不同时间点对培养基取样，并且根据制造商的说明书使用ELISA(Abeam,ab176644)分析IFKB水平。图50表明转染后IFKB或IFKB变体的水平增加。
如图51所示，将100,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞在6 孔板中在EpiLife+Supplement S7中接种。根据实施例3用2μg的编码KRT5或KRT14(或KRT5或KRT14的GFP标记形式)的RNA转染细胞。转染后，获得GFP图像以确定KRT5或KRT14表达。图51 表明高效转染和转染后KRT5-GFP或KRT14-GFP的水平增加。
如图52所示，将20,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞在24 孔板中在EpiLife+Supplement S7中接种。根据实施例3用0.2μg编码SOD3的RNA转染细胞。转染后，固定细胞并用1:100稀释的 NBP2-38493(Novus)兔抗人SOD3一抗和1:1000稀释的488驴抗兔二抗染色24小时。结果表明高效转染和转染细胞中SOD3的稳健水平。
如图60所示，将约200,000个原代人新生儿表皮角质形成细胞(无动物蛋白)在6孔板中在EpiLife+Supplement S7中接种。根据实施例 3用2μg编码hESM1的RNA转染细胞。转染后52小时，通过 ELISA(Abeam ab213776)分析培养基的ESM1。结果表明高效转染和转染细胞中hESMI的稳健水平。
实施例55：体内靶向GDF15(MIC1)
进行研究以评价Zucker肥胖(ZDF)大鼠对施用编码hGDF15的 RNA的响应。Zucker肥胖大鼠(ZDF)是模仿人疾病的许多方面的经过充分研究的肥胖模型。具体地讲，将8-10周龄雄性大鼠用于该研究。测试总共15只ZDF和15只野生型对照斯普拉格杜勒大鼠，并将动物分配到研究组并如下表所示进行治疗：
a 注：总剂量体积(μL/动物)是恒定的。
第1组至第4组通过皮内(ID)注射给药。每一剂量以50μL/注射的十次皮内注射施用在背部，每只动物总共接受500uL。
每个给药部位如下：
每周一次(第1天、第8天和第15天)施用RNA或对照物，第一剂量在第1天开始，最后剂量在第15天施用。使动物安乐死，在第 44天不进行检查。
根据以下时间表从大鼠收集血液并用于血清化学和药代动力学分析：
-＝不适用
PK＝药代动力学
x＝执行工序的次数
c 给药后24小时收集样品
使用AU680分析仪进行血清化学分析，如下所示：白蛋白、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、钙、总胆固醇、肌酸激酶、肌酐、葡萄糖、无机磷、总蛋白、甘油三酯、钠、钾、氯化物、球蛋白、白蛋白/球蛋白比率和血尿素氮。图53-58 提供ALT、AST、总胆固醇、甘油三酯和葡萄糖的血清水平的变化的结果。如图58所示、施用编码GDF15的RNA到ZDF大鼠引起血清中ALT、AST和葡萄糖水平降低，但总胆固醇和甘油三酯水平升高。这些结果提示，用编码GDF15的RNA治疗的糖尿病性肥胖动物表现出改善的肝脏健康，如由降低的ALT和AST的血清水平所指示；改善的(较低的)血糖水平和脂质动员，如由增加的血清胆固醇和甘油三酯水平所指示。因此，这些结果提示编码GDF15的RNA可以用于治疗尤其是糖尿病、肥胖症、脂肪肝和其他疾病(包括肝脏炎症、血糖升高和/或脂质代谢异常)。
如图59所示，确认所治疗的大鼠中GDF15的血清水平。如所示，在注射编码GDF15的RNA的ZDF和对照斯普拉格杜勒大鼠两者中，甚至在第16天(即，第15天+24h)观察到稳健的GDF15水平。
等效案
仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文具体描述的具体实施方案的许多等效案。这些等效案意图涵盖在以下权利要求书的范围中。
以引用的方式并入
本文引用的所有专利和出版物都以引用的方式整体并入本文。
Claims (15)
1.编码靶向免疫检查点分子基因的基因编辑蛋白的合成RNA在制备用于治疗患有癌症或自体免疫疾病的受试者的药剂中的用途，
其中所述基因编辑蛋白包括：
(a)包含多个重复序列的DNA结合结构域，并且所述重复序列中的至少一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:629LTPvQVVAIAwxyzGHGG并且长度在36个氨基酸和39个氨基酸之间，其中：
“v”为Q、D或E，
“w”为S或N，
“x”为H、N或I，
“y”为D、A、I、N、G、H、K、S或空，并且
“z”为SEQ ID NO:630GGKQALETVQRLLPVLCQD或SEQ ID NO:631GGKQALETVQRLLPVLCQA；和
(b)包含Fokl或Stsl核酸酶的催化结构域的核酸酶结构域，
其中所述合成RNA包括5-甲氧基尿苷；和
其中所述免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1和PD-L2。
2.细胞在制备用于治疗患有癌症或自体免疫疾病的受试者的药剂中的用途，其包括：
(a)获得包含检查点分子基因的细胞和
(b)使所述细胞与编码能够在所述免疫检查点分子基因中产生双链断裂的基因编辑蛋白的合成RNA接触，
其中所述合成RNA包含5-甲氧基尿苷；以及
所述基因编辑蛋白包括：
(i)包含多个重复序列的DNA结合结构域，并且所述重复序列中的至少一个包含氨基酸序列SEQ ID NO:629LTPvQVVAIAwxyzGHGG并且长度在36个氨基酸和39个氨基酸之间，其中：
“v”为Q、D或E，
“w”为S或N，
“x”为H、N或I，
“y”为D、A、I、N、G、H、K、S或空，并且
“z”为SEQ ID NO:630GGKQALETVQRLLPVLCQD或SEQ ID NO:631GGKQALETVQRLLPVLCQA；和
(ii)包含Fokl或Stsl核酸酶的催化结构域的核酸酶结构域；和
其中所述免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1和PD-L2。
3.如权利要求2所述的用途，其还包括以下步骤：
(c)获得步骤(b)中接触的所述细胞；和
(d)向有需要的受试者施用所述细胞。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中所述核酸酶结构域能够与另一个核酸酶结构域形成二聚体。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述核酸酶结构域包含Fokl催化结构域，其包含SEQID NO:53
QLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF；或Stsl催化结构域，其包含SEQID NO:1
VLEKSDIEKFKNQLRTELTNIDHSYLKGIDIASKKKTSNVENTEFEAISTKIFTDELGFSGKHLGGSNKPDGLLWDDDCAIILDSKAYSEGFPLTASHTDAMGRYLRQFTERKEEIKPTWWDIAPEHLDNTYFAYVSGSFSGNYKEQLQKFRQDTNHLGGALEFVKLLLLANNYKTQKMSKKEVKKSILDYNISY,SEQ ID NO:2
VLEKSDIEKFKNQLRTELTNIDHSYLKGIDIASKKKTSNVENTEFEAISTKIFTDELGFSGEHLGGSNKPDGLLWDDDCAIILDSKAYSEGFPLTASHTDAMGRYLRQFTERKEEIKPTWWDIAPEHLDNTYFAYVSGSFSGNYKEQLQKFRQDTNHLGGALEFVKLLLLANNYKTQKMSKKEVKKSILDYNISY,SEQ ID NO:3
VLEKSDIEKFKNQLRTELTNIDHSYLKGIDIASKPKTSNVENTEFEAISTKIFTDELGFSGKHLGGSNKPDGLLWDDDCAIILDSKAYSEGFPLTASHTDAMGRYLRQFTERKEEIKPTWWDIAPEHLDNTYFAYVSGSFSGNYKEQLQKFRQDTNHLGGALEFVKLLLLANNYKTQKMSKKEVKKSILDYNISY,SEQ ID NO:4
VLEKSDIEKFKNQLRTELTNIDHSYLKGIDIASKPKTSNVENTEFEAISTKIFTDELGFSGEHLGGSNKPDGLLWDDDCAIILDSKAYSEGFPLTASHTDAMGRYLRQFTERKEEIKPTWWDIAPEHLDNTYFAYVSGSFSGNYKEQLQKFRQDTNHLGGALEFVKLLLLANNYKTQKMSKKEVKKSILDYNISY,SEQ ID NO:5
VLEKSDIEKFKNQLRTELTNIDHSYLKGIDIASKPVENTEFEAISTKIFTDELGFSGEHLGGSNKPDGLLWDDDCAIILDSKAYSEGFPLTASHTDAMGRYLRQFTERKEEIKPTWWDIAPEHLDNTYFAYVSGSFSGNYKEQLQKFRQDTNHLGGALEFVKLLLLANNYKTQKMSKKEVKKSILDYNISY,SEQ ID NO:6
VLEKSDIEKFKNQLRTELTNIDHSYLKGIDIASKKKTSNVENTEFEAISTKIFTDELGFSGKHLGGSNKPDGLLWDDDCAIILDSKAYSEGFPLTASHTDAMGRYLRQFTERKEEIKPTWWDIAPEHLDNTYFAYVSGSFSGDYKEQLQKFRQDTNHLGGALEFVKLLLLANNYKTQKMSKKEVKKSILDYNISY,或SEQ ID NO:7
VLEKSDIEKFKNQLRTELTNIDHSYLKGIDIASKKKTSNVENTEFEAISTKIFTDELGFSGKHLGGSNKPDGLLWDDDCAIILDSKAYSEGFPLTASHTDAMGRYLRQFTERKEEIKPTWWDIAPEHLDNTYFAYVSGSFSGDYKEQLQKFRQNTNHLGGALEFVKLLLLANNYKTQKMSKKEVKKSILDYNISY的一个。
6.如权利要求1或2所述的用途，其中所述免疫检查点分子为PD-1。
7.如权利要求3所述的用途，其中所述施用刺激或增强所述受试者中的免疫应答。
8.如权利要求3所述的用途，其中所述施用抑制或降低所述受试者中的免疫应答。
9.如权利要求3所述的用途，其中所述施用是皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脑内、阴道内、透皮、门静脉内、直肠内、吸入或局部施用。
10.如权利要求1或2所述的用途，其中所述基因编辑蛋白引起所述受试者中PD-1的量减少。
11.如权利要求5所述的用途，其中蛋白的催化结构域包括氨基酸序列SEQ ID NO:53
QLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF。
12.如权利要求1或2所述的用途，其中至少20％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少90％、或至少100％的合成RNA的尿苷残基是5-甲氧基尿苷。
13.如权利要求1或2所述的用途，其中合成RNA包括以下的一种或多种：2-硫尿苷、5-氮杂尿苷、假尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基尿苷、5-氨基假尿苷、5-羟基尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲氧基假尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羟甲基假尿苷、5-羧基尿苷、5-羧基假尿苷、5-甲酰基尿苷、5-甲酰基假尿苷、5-甲基-5-氮杂尿苷、5-氨基-5-氮杂尿苷、5-羟基-5-氮杂尿苷、5-甲基假尿苷、5-氨基假尿苷、5-羟基假尿苷、4-硫-5-氮杂尿苷、4-硫假尿苷、4-硫-5-甲基尿苷、4-硫-5-氨基尿苷、4-硫-5-羟基尿苷、4-硫-5-甲基-5-氮杂尿苷、4-硫-5-氨基-5-氮杂尿苷、4-硫-5-羟基-5-氮杂尿苷、4-硫-5-甲基假尿苷、4-硫-5-氨基假尿苷、4-硫-5-羟基假尿苷、2-硫胞苷、5-氮杂胞苷、假异胞苷、N4-甲基胞苷、N4-氨基胞苷、N4-羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-氨基胞苷、5-羟基胞苷、5-甲氧基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-甲基-5-氮杂胞苷、5-氨基-5-氮杂胞苷、5-羟基-5-氮杂胞苷、5-甲基假异胞苷、5-氨基假异胞苷、5-羟基假异胞苷、N4-甲基-5-氮杂胞苷、N4-甲基假异胞苷、2-硫-5-氮杂胞苷、2-硫假异胞苷、2-硫-N4-甲基胞苷、2-硫-N4-氨基胞苷、2-硫-N4-羟基胞苷、2-硫-5-甲基胞苷、2-硫-5-氨基胞苷、2-硫-5-羟基胞苷、2-硫-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫-5-甲基假异胞苷、2-硫-5-氨基假异胞苷、2-硫-5-羟基假异胞苷、2-硫-N4-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-甲基假异胞苷、N4-甲基-5-甲基胞苷、N4-甲基-5-氨基胞苷、N4-甲基-5-羟基胞苷、N4-甲基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-甲基-5-甲基假异胞苷、N4-甲基-5-氨基假异胞苷、N4-甲基-5-羟基假异胞苷、N4-氨基-5-氮杂胞苷、N4-氨基假异胞苷、N4-氨基-5-甲基胞苷、N4-氨基-5-氨基胞苷、N4-氨基-5-羟基胞苷、N4-氨基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-氨基-5-甲基假异胞苷、N4-氨基-5-氨基假异胞苷、N4-氨基-5-羟基假异胞苷、N4-羟基-5-氮杂胞苷、N4-羟基假异胞苷、N4-羟基-5-甲基胞苷、N4-羟基-5-氨基胞苷、N4-羟基-5-羟基胞苷、N4-羟基-5-甲基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-氨基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-羟基-5-氮杂胞苷、N4-羟基-5-甲基假异胞苷、N4-羟基-5-氨基假异胞苷、N4-羟基-5-羟基假异胞苷、2-硫-N4-甲基-5-甲基胞苷、2-硫-N4-甲基-5-氨基胞苷、2-硫-N4-甲基-5-羟基胞苷、2-硫-N4-甲基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-甲基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-甲基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-甲基-5-甲基假异胞苷、2-硫-N4-甲基-5-氨基假异胞苷、2-硫-N4-甲基-5-羟基假异胞苷、2-硫-N4-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-氨基假异胞苷、2-硫-N4-氨基-5-甲基胞苷、2-硫-N4-氨基-5-氨基胞苷、2-硫-N4-氨基-5-羟基胞苷、2-硫-N4-氨基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-氨基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-氨基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-氨基-5-甲基假异胞苷、2-硫-N4-氨基-5-氨基假异胞苷、2-硫-N4-氨基-5-羟基假异胞苷、2-硫-N4-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-羟基假异胞苷、2-硫-N4-羟基-5-甲基胞苷、N4-羟基-5-氨基胞苷、2-硫-N4-羟基-5-羟基胞苷、2-硫-N4-羟基-5-甲基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-羟基-5-氨基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-羟基-5-羟基-5-氮杂胞苷、2-硫-N4-羟基-5-甲基假异胞苷、2-硫-N4-羟基-5-氨基假异胞苷、2-硫-N4-羟基-5-羟基假异胞苷、N6-甲基腺苷、N6-氨基腺苷、N6-羟基腺苷、7-去氮腺苷、8-氮杂腺苷、N6-甲基-7-去氮腺苷、N6-甲基-8-氮杂腺苷、7-去氮-8-氮杂腺苷、N6-甲基-7-去氮-8-氮杂腺苷、N6-氨基-7-去氮腺苷、N6-氨基-8-氮杂腺苷、N6-氨基-7-去氮-8-氮杂腺苷、N6-羟基腺苷、N6-羟基-7-去氮腺苷、N6-羟基-8-氮杂腺苷、N6-羟基-7-去氮-8-氮杂腺苷、6-硫鸟苷、7-去氮鸟苷、8-氮杂鸟苷、6-硫-7-去氮鸟苷、6-硫-8-氮杂鸟苷、7-去氮-8-氮杂鸟苷、6-硫-7-去氮-8-氮杂鸟苷和5-甲氧基尿苷。
14.如权利要求13所述的用途，其中至少20％、或30％、或40％、或50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或100％的尿苷残基是5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-羟甲基尿苷、5-羧基尿苷、5-甲酰基尿苷、假尿苷、5-羟基假尿苷、5-甲基假尿苷、5-羟甲基假尿苷、5-羧基假尿苷、5-甲酰基假尿苷和5-甲氧基假尿苷。
15.如权利要求13所述的用途，其中至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或100％的胞苷残基是5-羟基胞苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羧基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-甲氧基胞苷。
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