CN112079835A

CN112079835A - 一种5型磷酸二酯酶抑制剂的钾盐晶型b及其制备方法和应用

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Publication number: CN112079835A
Application number: CN201910505948.5A
Authority: CN
Inventors: 赵子建; 穆云萍; 李芳红; 赵正刚; 朱惠丹
Original assignee: Guangzhou Huazhen Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shenzhen Hanhui Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2039-06-12
Also published as: US20220251093A1; ZA202110585B; GB2599528B; AU2020293524A1; WO2020249139A1; AU2020293524B2; GB202117860D0; CN112079835B; GB2599528A

Abstract

本发明公开了一种5型磷酸二酯酶抑制剂的钾盐晶型B及其制备方法和应用。所述5型磷酸二酯酶抑制剂的结构式如式(I)所示，所述钾盐晶型B的X‑射线粉末衍射(XRPD)图在下述2θ角有特征峰：5.71°±0.2°，8.23°±0.2°，11.37°±0.2°，13.22°±0.2°，17.09°±0.2°，21.56°±0.2°，23.99°±0.2°，25.85°±0.2°。本发明还公开了该钾盐晶型在制备在治疗肺动脉高压、特发性肺纤维化、肾脏纤维化、心肌肥大或勃起功能障碍的药物中的应用。

Description

一种5型磷酸二酯酶抑制剂的钾盐晶型B及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化学制药领域，具体涉及一种5型磷酸二酯酶抑制剂的钾盐晶型B及其制备方法和应用。

背景技术

磷酸二酯酶抑制剂(phosphodiesterase inhibitors，PDEi)是一种抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDEs)活性的药物，在心衰、哮喘、勃起功能障碍等疾病中具有广泛的应用前景。环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷 (cGMP)是细胞内两种重要的第二信使，通过激活蛋白激酶A(protein kinase C，PKA)和蛋白激酶G(protein kinase C，PKG)途径参与机体的多种新陈代谢活动，其细胞内浓度的调节主要由腺(鸟)苷酸环化酶的合成和PDE的水解作用之间的平衡决定。PDE能特异性地催化细胞内的cGMP 和cAMP水解生成相应的无活性的5’-核苷酸，其中，5型磷酸二酯酶(PDE5) 可特异性水解cGMP，主要分布于肺、胰腺、大脑、阴茎海绵体、血管平滑肌细胞、血小板、骨骼肌细胞以及心肌细胞中。已有研究表明，PDE-5i可以调节阴茎海绵体和肺部血管平滑肌的收缩力，同时参与脑部NO-cGMP 信号途径的传导，以及乳腺癌癌细胞的生长和凋亡过程。但是，PDE-5i对 IPF的治疗作用尚未见报道，还有待进一步研究。

西地那非(Sildenafil)为cGMP特异性PDE5的选择性抑制药，是一种研发治疗心血管疾病药物时意外发明出的治疗男性勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)药物。Sildenafil通过选择性抑制PDE5，能阻止cGMP 的降解，升高细胞内cGMP水平，从而提高一氧化氮舒张血管平滑肌、降低血管阻力的作用，是最早作为治疗心血管疾病的候选药物而进入临床研究。2005年，美国FDA批准了Sildenafil用于治疗肺动脉高压(PAH)，2009 年又批准了另外一种PDE5i他达拉非(Tadalafil)，目前均作为PAH的一线治疗用药。PDE5i能够增加肺动脉血管扩张，抑制肺血管重塑，从而降低肺动脉压和肺血管阻力，显著提高患者的存活率并改善其生存质量。但 Sildenafil存在使用量大(100mg/天)、生物半衰期短的缺点，生物利用度低 (约41％)，患者需要每天多次服药，大大增加了药物的不良反应以及治疗成本。此外，Sildenafil对PDE5的选择性作用仅是对PDE6的10倍，PDE6 是存在于视网膜中的一种酶，因此，高剂量或者高血药浓度的Sildenafil可能会引起畏光和视力模糊等色觉异常。与Sildenafil相比，Tadalafil生物半衰期显著延长(约17.5小时)，每天所需治疗剂量也降低(40mg/天)，大大减少了患者的治疗费用。然而，由于Tadalafil对其他PDE也有一定的抑制作用，所以不良反应也比较显著，如头痛、胃部不适或疼痛、腹泻、背痛和肌肉疼痛等。

为了克服Sildenafil和Tadalafil临床表现出的副作用，中国专利文献(CN102020645A)公开了一种吡唑并嘧啶酮衍生物，副作用小，可用于制备治疗男性阳痿、肺动脉高压、下尿路综合征、良性前列腺肿大、慢性心衰、中风、冠脉疾病和神经性垂体功能疾病等的治疗药物。该中国专利文献还具体公开了一种化合物WYQ：5-(2-H-5(N-丁氧羰基氨基磺酰基) 苯基)-1-甲基-3-丙基-1,6-二氢-7H-吡唑[4,3-d]嘧啶-7-酮，具有如式(I)所示的结构式，与具有如式(II)所示结构式的Sildenafil相比，化合物WYQ 保留了Sildenafil上与环磷酸鸟苷(cGMP)分子结构高度相似的母环，保证了衍生物活性，同时去除了侧链苯环上可能被分解的乙氧基，并将环状的甲基哌嗪替换成链状的正丁氧甲酰胺以降低张力，从而提高药物在生物体内的稳定性。

化合物WYQ是Sildenafil的一种衍生物，具有与Sildenafil和Tadalafil 相同的疗效，且相比Sildenafil，化合物WYQ具有低剂量高药效的特点。由于化合物WYQ的疗效与治疗剂量存在依赖关系，更重要的是化合物 WYQ在水中的溶解度非常低，这更加大了化合物WYQ的每日使用量，且其主要依靠肝肾代谢，如果肝肾功能不全者给予大剂量的长期治疗时，会加重其肝肾的负担，引起严重的不良反应，也显著增加患者的治疗费用。鉴于现有技术尚存不足，本领域仍需要开发具有良好的水溶性和理化稳定性的PDE5i晶型，以满足临床用药对于活性物质的形态、水溶性及纯度等理化性质的严格要求。目前尚未有化合物WYQ的钾盐晶型的相关报道。

发明内容

因此，本发明旨在提供一种水溶性良好、理化性质稳定的化合物WYQ 的钾盐晶型。

本发明提供一种化合物的钾盐晶型B，所述化合物的结构式如式(I) 所示，

所述钾盐晶型B的X-射线粉末衍射(XRPD)图在下述2θ角有特征峰： 5.71°±0.2°，8.23°±0.2°，11.37°±0.2°，13.22°±0.2°，17.09° ±0.2°，21.56°±0.2°，23.99°±0.2°，25.85°±0.2°。

进一步地，所述钾盐晶型B的X-射线粉末衍射(XRPD)图在下述2 θ角还有特征峰：15.88°±0.2°，16.35°±0.2°，18.47°±0.2°，19.70° ±0.2°，22.90°±0.2°，23.64°±0.2°，31.92°±0.2°。

进一步地，所述钾盐晶型B的X-射线粉末衍射(XRPD)图在下述2 θ角还有特征峰：25.04°±0.2°，26.54°±0.2°，28.36°±0.2°，29.94° ±0.2°，35.48°±0.2°，37.83°±0.2°。

进一步地，所述钾盐晶型B具有如图1所示的X-射线粉末衍射(XRPD) 图。

进一步地，所述钾盐晶型B的差示扫描量热法图谱(DSC)在峰值 191.3℃和217.9℃处具有特征熔融吸收峰。

进一步地，所述钾盐晶型B具有如图2所示的TG-DSC图谱。

进一步地，所述钾盐晶型B的分子式为：C₂₀H₂₄KN₅O₅S。

进一步地，所述钾盐晶型B的结构式为：

本发明还提供一种上述式(I)所示化合物的钾盐晶型B的制备方法，包括：

将如式I所示化合物和溶剂混合形成悬浊液1；

向所述悬浊液1中加入氢氧化钾溶解，形成悬浊液2，搅拌结晶，析出固体料；

真空抽滤，分离得到所述固体料并真空干燥，得到所述化合物的钾盐晶型B。

进一步地，所述溶剂选用丙酮、四氢呋喃、乙酸乙酯或乙醇。

进一步地，所述如式I所示的化合物和溶剂的质量体积比为 25-30mg/mL，所述氢氧化钾和所述如式I所示的化合物的质量比为1: (7-10)。

进一步地，所述搅拌结晶为：将悬浊液2依次在45-50℃下搅拌5-10min，在20-30℃下搅拌20-24h，在45-50℃下搅拌8-10h。

进一步地，所述的化合物的钾盐晶型B的制备方法包括：

将如式I所示化合物和丙酮按质量体积比28mg/mL混合形成悬浊液1；

向所述悬浊液1中加入氢氧化钾，超声助溶，形成悬浊液2，其中，氢氧化钾和如式I所示的化合物的质量比为1:8；

将悬浊液2依次在50℃下搅拌5min，在25℃下搅拌24h，在50℃下搅拌9h，析出固体料；

本发明还提供一种药物组合物，包括上述式(I)所示化合物的钾盐晶型B和药学上可接受的载体。

本发明还提供了上述式(I)所示化合物的钾盐晶型B在制备治疗肺动脉高压的药物中的应用。

本发明还提供了上述式(I)所示化合物的钾盐晶型B在制备治疗特发性肺纤维化的药物中的应用。

本发明还提供了上述式(I)所示化合物的钾盐晶型B在制备治疗肾脏纤维化的药物中的应用。

本发明还提供了上述式(I)所示化合物的钾盐晶型B在制备治疗心肌肥大的药物中的应用。

本发明还提供了上述式(I)所示化合物的钾盐晶型B在制备治疗勃起功能障碍的药物中的应用。

本发明技术方案，具有如下优点：本发明通过对化合物WYQ成盐或共晶所成晶型筛选，得到了一种化合物WYQ的钾盐晶型B，水溶性较优、理化性质稳定；在肺动脉高压和勃起功能障碍等疾病的治疗中具有低剂量、高药效的特点，尤其是还发现了该钾盐晶型B对特发性肺纤维化、肾脏纤维化和心肌肥大的治疗作用，同样具有低剂量、高药效的特点；制备方法简单、易于操作、稳定性好，具有被开发为治疗以上疾病的药物的潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例1制备的钾盐晶型B的X-射线粉末衍射图；

图2是本申请实施例1制备的钾盐晶型B的TG-DSC图谱；

图3是本申请实施例1制备的钾盐晶型B的偏光显微镜图；

图4是本申请实施例1制备的钾盐晶型B的变温X-射线粉末衍射测试图；

图5是本申请实施例1制备的钾盐晶型B的DVS测试图；

图6是本申请实施例1制备的钾盐晶型B的DVS测试前后的XRPD对比图；

图7是实施例1制备的钾盐晶型B在水中37℃条件下的动态溶解度图；

图8是实施例1制备的钾盐晶型B在SGF中37℃条件下的动态溶解度图；

图9是实施例1制备的钾盐晶型B在FaSSIF中37℃条件下的动态溶解度图；

图10是实施例1制备的钾盐晶型B在FeSSIF中37℃条件下的动态溶解度图；

图11是化合物WYQ样品在水和SGF中37℃条件下所得固体的XRPD 结果对比图；

图12是化合物WYQ样品在FaSSIF和FeSSIF中37℃条件下所得固体的XRPD结果对比图；

图13是实施例1制备的钾盐晶型B在水中37℃条件下所得固体的 XRPD结果对比图；

图14是实施例1制备的钾盐晶型B在SGF中37℃条件下所得固体的 XRPD结果对比图；

图15是实施例1制备的钾盐晶型B在FaSSIF中37℃条件下所得固体的XRPD结果对比图；

图16是实施例1制备的钾盐晶型B在FeSSIF中37℃条件下所得固体的XRPD结果对比图；

图17是化合物WYQ样品在固态稳定性测试条件下放置后的XRPD结果对比图；

图18是实施例1制备的钾盐晶型B在固态稳定性测试条件下放置后的 XRPD结果对比图；

图19是2.0mg·kg^-1实施例1制备的钾盐晶型B在大鼠体内的平均血药浓度-时间曲线图；

图20为不同剂量WYQ钾盐晶型B及sildenafil和tadalafil治疗PAH 大鼠21天后，对大鼠RVSP的影响图；

图21为不同剂量WYQ钾盐晶型B及sildenafil和tadalafil治疗PAH 大鼠21天后，对大鼠RVMI的影响图；

图22为不同剂量WYQ钾盐晶型B及sildenafil和tadalafil治疗PAH 大鼠21天后，放大200倍的不同组大鼠肺小动脉H&E染色标准图；

图23为不同剂量WYQ钾盐晶型B及sildenafil和tadalafil治疗PAH 大鼠21天后，不同组大鼠肺小动脉中膜厚度统计图；

图24为不同剂量WYQ钾盐晶型B及sildenafil和tadalafil治疗PAH 大鼠21天后，不同组大鼠肺小动脉中膜厚度百分比(WT％)统计图；

图25为WYQ钾盐晶型B微剂量治疗(Mini-dose)对大鼠阴茎勃起功能的影响；

图26为WYQ钾盐晶型B低剂量治疗(Low-dose)对大鼠阴茎勃起功能的影响。

图27为WYQ钾盐晶型B中剂量治疗(Medium-dose)对大鼠阴茎勃起功能的影响；

图28为WYQ钾盐晶型B高剂量治疗(High-dose)对大鼠阴茎勃起功能的影响；

图29为sildenafil治疗对大鼠阴茎勃起功能的影响；

图30为tadalafil治疗对大鼠阴茎勃起功能的影响；

图31为不同剂量WYQ钾盐晶型B和目前临床批准的阳性对照药物尼达尼布(BIBF)治疗IPF大鼠23天后，对大鼠左肺重量的影响图；

图32为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，对大鼠左肺体积的影响图。

图33为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶和病灶范围变化对比图(H&E染色)，其中，A为模型组、 B为BIBF-50mg/kg组、C为CPD-1-2.5mg/kg组、D为CPD-1-10mg/kg 组；

图34为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶和病灶范围变化对比图(Masson Trichrom染色)，其中，A 为模型组、B为BIBF-50mg/kg组、C为CPD-1-2.5mg/kg组、D为 CPD-1-10mg/kg组；

图35为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶内细支气管和肺细小动脉的组织学变化对比图(HE染色，图片放大倍率：×200)，其中，A为模型组对侧肺组织、B为模型组、C 为BIBF-50mg/kg组、D为CPD-1-2.5mg/kg组、E为CPD-1-10mg/kg组；

图36为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶边缘细支气管和肺细小动脉的组织学变化对比图(HE染色，图片放大倍率：×200)，其中，A为模型组对侧肺组织、B为模型组、 C为BIBF-50mg/kg组、D为CPD-1-2.5mg/kg组、E为CPD-1-10mg/kg 组；

图37为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶内肺泡组织结构变化对比图(HE染色，图片放大倍率：× 200)，其中，A为模型组对侧肺组织、B为模型组、C为BIBF-50mg/kg 组、D为CPD-1-2.5mg/kg组、E为CPD-1-10mg/kg组；

图38为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶肺泡的组织结构变化对比图(Masson Trichrom染色，图片放大倍率：×200)，其中，A为模型组对侧肺组织、B为模型组、C为 BIBF-50mg/kg组、D为CPD-1-2.5mg/kg组、E为CPD-1-10mg/kg组；

图39为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化面积的变化对比图；

图40为肺纤维化病理评分(Masson Trichrome染色)标准，图A-I依次为Ashcroft评分系统中纤维化分级0-8级的Masson Trichrome染色标准图片；

图41为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶评分的变化对比图；

图42为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶评分百分比的变化对比图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

试剂来源

氢氧化钾购自中国国药集团股份有限公司；

化合物WYQ由药明康德新药开发有限公司合成(批号：ET2951-2-P1)，具体合成路线如下：

(1)将化合物1(50.0g，274mmol，1.00eq)和化合物1A(41.5g，274mmol，1.00eq)在二氧杂环乙烷(350ml)中混合成悬浊液，然后通过薄层色谱分析(TLC)形成亚胺后，在80℃下将混合物搅拌3小时，在O₂条件下添加 CuCl₂(36.9g，274mmol，1.00eq)，同样在O₂(15psi)条件下将混合物在 80℃搅拌2小时，TLC(石油醚/乙酸乙酯＝3/1，Rf＝0.43)显示反应完成，将反应混合物倒入冰水(500ml)中搅拌20分钟，过滤并减压浓缩，得到残渣，用甲基叔丁基醚(MTBE，500ml)洗涤反应混合物，过滤，减压浓缩过滤，得到白色固体化合物2(50.0g，160mmol，58.2％产率)：

(2)在N₂条件下将化合物2(50.0g，160mmol，1.00eq)溶于甲醇 (MeOH，250ml)和四氢呋喃(THF，250ml)中，添加钯碳催化剂(Pd/C， 5.00g，10％纯度)，真空条件下对悬浮液脱气并用H₂吹扫数次，在50℃下将混合物在H₂(50psi)下搅拌5小时，TLC(石油醚/乙酸乙酯＝0/1，Rf＝0.33) 表明反应完全，过滤反应混合物并浓缩滤液，用MTBE(200ml×3)洗涤粗产物，得到白色固体化合物3(40.0g，118.6mmol，74.3％产率，84.0％纯度)：

(3)化合物3(40.0g，141mmol，1.00eq)溶于乙腈(MeCN，500mL)，添加BF₃.HF(18.6g，212mmol，1.50eq)和第三丁基亚硝酸盐(21.8g，212mmol， 1.50eq)，然后在0℃下在N₂条件下将混合物搅拌0.5小时，在MeCN(100ml) 中添加SO₂(90.4g，1.41mol，10.0eq)和CuCl(20.9g，212mmol，1.50eq) 并用N₂吹扫3次，然后在25℃下在N₂条件下搅拌2.5小时，TLC(石油醚 /乙酸乙酯＝0/1，Rf＝0.36)表明反应完全，将反应混合物添加到冰水(500ml)中，将混合物在0℃搅拌0.5小时，过滤后，滤饼在低压下浓缩，得到残渣，粗产物用MTBE(200ml)洗涤，过滤，滤饼减压浓缩，得到白色固体化合物4(40.0g，109mmol，77.2％产率)：

(4)化合物4(40.0g，109mmol，1.00eq)溶于NH₃.H₂O(300ml，25％纯度)中形成混合物，用N₂吹扫3次，然后在30℃下N₂条件将混合物搅拌12小时，TLC(石油醚/乙酸乙酯＝0/1，Rf＝0.24)表明反应完全，反应混合物是浓缩过滤，减压浓缩滤饼，得到残渣，用THF(300ml)稀释残余物，经Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，得到呈蓝色固体的化合物5(30.0g，86.4mmol，79.2％产率)：

(5)化合物5(15.0g，43.2mmol，1.00eq)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF， 75.0ml)和二氯甲烷(DCM，75.0ml)中形成混合物，添加4-二甲氨基吡啶(DMAP，2.64g，21.6mmol，0.50eq)和三乙基胺(TEA，8.74g，86.4mmol， 2.00eq)，0℃条件下添加化合物5A(11.8g，86.4mmol，2.00eq)，用N₂吹扫3次，25℃下在N₂条件下搅拌12小时，TLC(二氯甲烷/甲醇＝10/1， Rf＝0.31)表明反应完全，使反应混合物在乙酸乙酯(EtOAc，200ml)和盐水(300ml)中分离，有机相分离出来，用盐水(200ml×3)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤，减压浓缩，得到残渣，通过柱层析法(SiO₂，二氯甲烷-甲醇 101)纯化残余物，然后通过制备高效液相色谱法(TFA条件，柱：Phenomene ×LunaC18250×50mm×10um，流动相：[水0.1％乙腈]，B％：35％65％， 20分钟后得到化合物WYQ(10.2g，22.5mmol，52.2％产率，98.8％纯度) 白色固体：

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

化合物WYQ的钾盐晶型B的制备方法：

称取400.1mg化合物WYQ于20mL小瓶中，加入14.4mL的丙酮(丙酮:水＝19:1，v/v)混合形成悬浊液1；

称取50.5mg氢氧化钾，加入悬浊液1中，超声助溶30s，形成悬浊液 2；

真空抽滤，分离上述固体料，将其在25℃下真空干燥24h，得到290.1mg 结晶固体(质量收率：72.5％)。

X-射线粉末衍射(XRPD)图见图1；TG-DSC图谱见图2；HPLC纯度 98.7area％；IC测试(Thermo ICS1100)结果表明化合物WYQ与钾离子的化学计量比为1:7～1:10；偏光显微镜(PLM，Axio Lab.A1)图如图3所示，表明制备的钾盐晶型B由小颗粒组成，且伴有团聚。

实施例2

化合物WYQ的钾盐晶型B的制备方法：

称取480mg化合物WYQ于40mL小瓶中，加入20mL的四氢呋喃(四氢呋喃:水＝19:1，v/v)混合形成悬浊液1；

称取69mg氢氧化钾，加入悬浊液1中，超声助溶60s，形成悬浊液2；

将悬浊液2依次在45℃下搅拌10min，在20℃下搅拌24h，在45℃下搅拌10h，析出固体料；

真空抽滤，分离上述固体料，将其在室温下真空干燥12h，得到290.1mg 结晶固体(质量收率：72.5％)。

X-射线粉末衍射(XRPD)图与图1基本一致；TG-DSC图谱与图2基本一致；HPLC纯度99area％。

实施例3

化合物WYQ的钾盐晶型B的制备方法：

称取600mg化合物WYQ于40mL小瓶中，加入20mL的乙酸乙酯(乙酸乙酯:水＝19:1，v/v)混合形成悬浊液1；

称取60mg氢氧化钾，加入悬浊液1中，超声助溶40s，形成悬浊液2；

将悬浊液2依次在50℃下搅拌8min，在30℃下搅拌20h，在50℃下搅拌8h，析出固体料；

真空抽滤，分离上述固体料，将其在室温下真空干燥20h，得到290.1mg 结晶固体(质量收率：72.5％)。

本发明提供了化合物WYQ的钾盐晶型B，并采用多种方式和仪器对实施例1制备得到的化合物WYQ的钾盐晶型B的性质进行了研究。

一、X-射线粉末衍射(XRPD)

本发明采用(X’Pert³)型号的X-射线粉末衍射仪，以2°每分钟的扫描速度，采用铜铬射靶获取实施例1制备的钾盐晶型B的XRPD图谱如图1所示。XRPD测试参数设置见表1，图1中各详细X-射线粉末衍射参数见表2。

表1 XRPD测试参数

表2实施例1制备得到的钾盐晶型B的X-射线粉末衍射参数

二、热分析和变温XRPD测试

采用(美国TA公司Discovery系列DSC2500)差示扫描量热分析仪，获得实施例1制备的钾盐晶型B的差示扫描量热扫描图谱(DSC曲线)；采用(美国TA公司Q系列Q500/5000)热重分析仪，获得实施例 1制备的钾盐晶型B的热重曲线(TG曲线)，得到如图2所示的实施例1制备的钾盐晶型B的TG-DSC图谱。DSC和TGA测试参数设置见表3。

表3 DSC和TGA测试参数

参数	TGA	DSC
			方法	线性升温	线性升温
样品盘	铝盘，敞开	铝盘，压盖
			温度范围	室温-目标温度	25℃-目标温度
扫描速率(℃/min)	10	10
			保护气体	氮气	氮气

如图2所示，实施例1制备的钾盐晶型B在150℃前存在0.9％的失重，且在在峰值191.3℃(起点温度188.5℃)和217.9℃(起点温度208.7℃) 处具有吸热峰。结合该钾盐晶型B在熔化分解前具有较小的失重，推测实施例1制备的钾盐晶型B为无水晶型。

进一步进行变温X-射线粉末衍射(VT-XRPD)测试，测试条件分别为30℃下无氮气保护、30℃下氮气吹扫30分钟、氮气保护下升温至150℃、氮气保护下降温至30℃，得到测试结果如图4所示，将实施例1制备的钾盐晶型B样品在30℃氮气吹扫30分钟后，晶型无变化，氮气保护下升温至150℃后观察到部分衍射峰偏移，降温至30℃后，晶型与钾盐晶型B一致，证实化合物WYQ的钾盐晶型B为无水晶型。

三、动态蒸汽吸附(DVS)实验

采用SMS(Surface Measurement Systems)的DVS Intrinsic仪器在 25℃条件下进行动态蒸汽吸附实验，以对实施例1制得的钾盐无水晶型 B进行引湿性测试。将测试样品预先在0％相对湿度(RH)条件下干燥去除吸附的溶剂或水后开始测试，目标相对湿度为0-95％。如图5所示，钾盐晶型B样品在25℃/80％RH条件下质量变化(水分吸附量)为0.6％，表明其略有引湿性。如图6所示，XRPD对比图显示DVS测试前后测试样品的晶型未发生改变。DVS测试参数设置见表4。

表4 DVS测试参数

四、动态溶解度测试

在37℃/60％RH的条件下对实施例1制备的钾盐晶型B样品在水、人工胃液(SGF)、禁食态人工肠液(FaSSIF)、喂食态人工肠液(FeSSIF) 四种溶媒中的动态溶解度进行测试，并收集化合物WYQ样品相同条件下的动态溶解度数据。在动态溶解度测试实验中，分别称取约16mg钾盐晶型B样品/化合物WYQ样品与3.2mL溶媒在4mL离心管中混合，并将离心管密封固定在转速为25r/min的旋转盘上，在37℃条件下旋转混合1h、4h和24h后取样，检测各取样点的溶解度(S，mg/mL)、pH 值和经XRPD检测后的晶型变化(FC，其中“是”代表晶型部分或全部变成了化合物WYQ)，检测结果如表5所示。钾盐晶型B样品在水、SGF、FaSSIF、FeSSIF中的溶解度曲线图如图7-10所示，化合物WYQ样品在不同溶媒中1h和24h取样点的XRPD结果对比如图11-12所示(XRPD 检测参数设置见表1)，钾盐晶型B样品在不同溶媒中1h和24h取样点的XRPD结果对比如图13-16所示。

表5各取样点的溶解度、pH值和经XRPD检测后的晶型变化

以上结果均显示，实施例1制备的钾盐晶型B在37℃条件下在水、 SGF、FaSSIF、FeSSIF中的溶解度均高于化合物WYQ样品，且在水中溶解度最高，可达12.9mg/mL。

五、固态稳定性测试

对实施例1制备的钾盐晶型B的固态稳定性进行测试，称取5.22mg 钾盐晶型B样品在25℃/60％RH条件下敞口放置，并称取5.19mg钾盐晶型B样品在40℃/75％RH条件下敞口放置，一周后对所有样品进行 XRPD表征(XRPD检测参数设置见表1)和HPLC纯度测试(Agilent 1100)，以检测晶型和纯度变化，HPLC纯度测试参数见表6。同时，称取4.59mg化合物WYQ样品在25℃/60％RH条件下敞口放置，并称取 5.11mg化合物WYQ样品在40℃/75％RH条件下敞口放置，在相同条件下进行了固态稳定性测试，用于比较参考。

表6 HPLC纯度测试参数

测试结果结果汇总于表7，XRPD测试结果如图17及图18所示。结果表明，实施例1制备的化合物WYQ的钾盐晶型B的HPLC纯度为 98.71area％，钾盐晶型B样品放置一周后，晶型不变且未观察到明显的纯度变化，在两种测试条件下具有良好的理化稳定性；化合物WYQ样品在25℃/60％RH条件下放置一周后纯度无明显下降，在40℃/75％RH 条件下放置一周后，检测到约1％的HPLC纯度(area％)降低。

表7实施例1制备的钾盐晶型B的固态稳定性测试结果

综上所述，本发明实施例1制备得到的化合物WYQ的钾盐晶型B 样品与化合物WYQ样品相比，具有更优异的引湿性、溶解度和理化稳定性。以下将结合具体实验对本发明实施例制备的钾盐晶型B的药物用途进行具体说明。

实验例实施例1制备的钾盐晶型B的药物活性检测实验

一、实施例1制备的钾盐晶型B的药代动力学实验

1.实验材料

1.1试剂

化合物WYQ的钾盐晶型B为实施例1中制备得到；羧甲基纤维素钠、生理盐水、戊巴比妥钠购自中国国药集团股份有限公司；乙腈、甲酸、甲醇购自中国百灵威化学试剂有限公司。

1.2仪器

美国Ag-ilentSeries1200液相色谱及Agilent6410质谱仪。

1.3实验动物

雄性SPF级SD大鼠，体重180～200g，购于北京维通利华实验动物有限公司，实验动物许可证号:SCXK(京)-2002-0011，饲养于南京医科大学实验动物房，所有小鼠置于温度(22±2)℃、湿度(60±5)℃，12h 明暗交替环境中。

2.实验方法

健康雄性SD大鼠6只，禁食自由饮水12h后，将实施例1制备的钾盐晶型B按2mg.kg^-1灌胃给药，分别于给药后0.2h、0.5h、1h、1.5h、 2h、4h、6h和8h眼球静脉丛取血，加入乙腈:水(1:1)离心取上清液，进行色谱分析。色谱条件：色谱柱Thermo FisherHypersil gold column (3μm，20mm×2.1mm)，进样量10μL，流速为0.3mL/min，柱温40℃，流动相水(1％甲酸)和甲醇，梯度洗脱：甲醇10％(0min)；10％(1min)； 90％(4min)；90％(8min)；10％(9min)。质谱条件：多反应监测(MRM)，电喷雾离子化(ESI)，驻留时间(DwellTime)200ms，检测离子 m/z448.0-347.8，血药浓度数据用Winnonlin6.3软件进行分析，得到药代动力学参数，形成平均血药浓度-时间曲线图如图19所示。

3.实验结果

化合物WYQ的钾盐晶型B在雄性SD大鼠体内的口服半衰期(t_1/2) ＝(2.30±0.27)h，给药(0.63±0.12)h后药物浓度达到峰值，最大药物浓度(C_max)＝(333.8±23.7)ng.mL^-1，给药后8h内的平均血药浓度- 时间曲线下面积AUC_(0－t)＝(638.8±72.4)h.ng.mL^-1，平均血药浓度- 时间曲线下总面积AUC_(0－∞)＝(650.2±70.8)h.ng.mL^-1。

二、肺动脉高压(PAH)大鼠实验

1.实验材料

1.1试剂

化合物WYQ的钾盐晶型B为实施例1中制备得到；Sildenafil、 Tadalafil由药明康德新药开发有限公司合成(批号:EW10443-180-P1、 EW10443-228-P1)；野百合碱(monocrotaline，MCT)、羧甲基纤维素钠为美国Sigma试剂公司产品；肝素(heparin)、乌拉坦溶液、二甲苯、石蜡购自中国国药集团股份有限公司；苏木素-伊红、中性树胶购自中国碧云天生物科技有限公司。

1.2仪器

日本Nikon光学显微镜摄像系统；包埋机：HistoCore Arcadia，Leica；切片机：RM2235，Leica；自动染色机：LEICA Autostainer ST5020；切片扫描仪：HamamatsuNanoZoomer Digital Pathology(S210)；分析天平： METTLERToledo，ALT104；体重秤：常熟市双杰测试仪器厂，T1000；手术显微镜：Luckbird XTS-4A；RM6240E生理记录仪(成都仪器厂)。

1.3实验动物

SPF级雄性SD大鼠，由山东济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁)20140007，批号No.37009200014851，体重：150 ±5克。

广州呼吸疾病研究所动物房，实验单位使用许可证编号：SYXK(粤) 2013-0093，动物房温度20-25℃，湿度55％-65％，12h明暗交替，自由摄食饮水。

2.实验方法

2.1实验分组

SD大鼠随机分8组，15只/组，分别为：正常对照组(Vehicle)；PAH 模型组(MCT)；PAH+WYQ钾盐晶型B微剂量组(Mini-dose，下称微剂量组)；PAH+WYQ钾盐晶型B低剂量组(Low-dose，下称低剂量组)； PAH+WYQ钾盐晶型B中剂量组(Medium-dose，下称中剂量组)；PAH+WYQ钾盐晶型B高剂量组(High-dose，下称高剂量组)； PAH+Sildenafil对照组(下称西地那非组)；PAH+Tadalafil对照组(下称他达拉非组)。

2.2动物造模

MCT用1M稀HCl充分溶解后，加双蒸水稀释，再用3M的NaOH 调至pH＝7.2，配成终浓度为20mg/ml的MCT药液备用。

正常对照组于腹腔下注射生理盐水(50mg/kg)，其余各组于腹腔下一次性注射MCT(50mg/kg)。

2.3给药量及给药方式

正常对照组：不给药处理；

PAH模型组：不给药处理；

微剂量组：WYQ钾盐晶型B用生理盐水配成0.4mg/ml的药液(现用现配)，灌胃给药，给药量2mg.kg^-1.d^-1；

低剂量组：WYQ钾盐晶型B用生理盐水配成1mg/ml的药液(现用现配)，灌胃给药，给药量5mg.kg^-1.d^-1；

中剂量组：WYQ钾盐晶型B用生理盐水配成2mg/ml的药液(现用现配)，灌胃给药，给药量10mg.kg^-1.d^-1；

高剂量组：WYQ钾盐晶型B用生理盐水配成4mg/ml的药液(现用现配)，灌胃给药，给药量20mg.kg^-1.d^-1；

西地那非组：Sildenafil用0.5％羧甲基纤维素钠配成5mg/ml的药液 (现用现配)，灌胃给药，给药量25mg.kg^-1.d^-1；

他达拉非组：Tadalafil用0.5％羧甲基纤维素钠配成2mg/ml的药液 (现用现配)，灌胃给药，给药量10mg.kg^-1.d^-1。

注射当天为实验起始日，造模7天后开始给药，每天1次，连续14 天。

2.4试验指标及检测方法

2.4.1 PAH大鼠右心室收缩压(RVSP)

实验起始日起3周后，在RM-6240E多导生理记录仪上采集各组大鼠RVSP数据。

2.4.2 PAH大鼠右心室肥大指数(RVMI)

实验起始日起3周后，麻醉动物，进行血流动力学检测(RM-6240E 多导生理记录仪)，测压完处死动物，立即剖取心肺组织，用眼科剪沿房室交界处剪去左右心房及大血管，分离出右心室(RV)及左心室+室间隔(left ventricular wall plus septum，LV+S)，滤纸吸去水分后分别称质量，并计算RV/(LV+S)即RVMI。

2.4.3 PAH大鼠肺小动脉病理学观察及定量分析

实验起始日起3周后，大鼠肝素化(heparin，50IU/100g，腹腔注射) 处理5min，注射20％乌拉坦溶液(0.5ml/100g)麻醉动物，检测并记录血压各项指标；

剖取心脏，分离右心室壁，分离左心室和室间隔，滤纸吸干后分别称重，计算右心室肥大指数；

剖取肺，结扎右肺，用固定液(4％多聚甲醛)灌注左肺叶后将其置于固定液内固定，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、切片(4μm)、苏木素-伊红(HE)染色，中性树胶封片后显微镜下观察，取不同切片随机观察6个视野中小动脉中膜厚度和厚度的变化情况，与对照组对比确定各组动物肺组织学变化。

应用图像采集分析系统测量肺小动脉(直径为50～150μM)中膜厚度、外径，然后计算肺小动脉中膜厚度及厚度百分比(WT％)，WT％＝(2×中膜厚度)/外径×100％。

2.4.4 PAH大鼠阴茎勃起功能观察

灌胃处理后，观察动物阴茎勃起状况，记录各组灌胃后出现阴茎勃起现象的时间。

3.实验结果

3.1 PAH大鼠右心室收缩压(RVSP)

图20为不同剂量WYQ钾盐晶型B及sildenafil和tadalafil治疗PAH 大鼠21天后，对大鼠RVSP的影响图。结果显示：与正常对照组 (22.9±0.5mmHg)相比，PAH模型组大鼠的RVSP(72.5±4.5mmHg) 显著升高(^**P<0.01)；微剂量组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的RVSP 均明显下降和改善(微剂量组：56.2±0.5mmHg，^#P<0.05；低剂量组： 47.6±1.9mmHg，^##P<0.01；中剂量组:40.7±1.5mmHg，^##P<0.01；高剂量组：29.8±1.6mmHg，^##P<0.01)，且对RVSP的抑制作用呈剂量依赖性，高剂量组的RVSP已接近正常水平；他达拉非组与PAH模型组相比， RVSP也明显下降(52.5±2.4mmHg，^##P<0.01)，下降的幅度相当于低剂量组；西地那非组与PAH模型组相比，RVSP也有所下降，但下降的幅度不如WYQ钾盐晶型B各剂量给药组和他达拉非组，与PAH模型组相比无显著统计学意义(60.4±5.0mmHg，P＝0.089)；与微剂量组相比，低剂量组的RVSP显著下降(^$P＜0.05)，与低剂量组相比，中剂量组的 RVSP显著下降(^$P＜0.05)，与中剂量组相比，高剂量组的RVSP显著下降(^$$P＜0.01)。

3.2 PAH大鼠右心室肥大指数(RVMI)

图21为不同剂量WYQ钾盐晶型B及sildenafil和tadalafil治疗PAH 大鼠21天后，对大鼠RVMI的影响图。结果显示：与正常对照组 (24.2±0.7％)相比，PAH模型组大鼠的RVMI(51.7±2.3％)显著升高 (^**P<0.01)；WYQ钾盐晶型B给药的微剂量组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的RVSP均明显下降和改善(微剂量组：42.8±2.1％，#P<0.05；低剂量组：40.6±2.7％，^##P<0.01；中剂量组：38.7±2.1％，^##P<0.01；高剂量组：34.6±19％，^##P<0.01)，与对RVSP的抑制作用不同，WYQ 钾盐晶型B对RVMI的抑制作用不呈剂量依赖性；他达拉非组与PAH 模型组相比，RVMI也明显下降(41.8±1.9％，^##P<0.01)，下降幅度相当于WYQ钾盐晶型B低剂量组；西地那非组与PAH模型组相比，RVMI 也有所下降，但下降的幅度不如WYQ钾盐晶型B各剂量组和他达拉非组，与PAH模型组相比无显著统计学意义(48.4±1.0％，P＝0.468)；与微剂量组相比，高剂量组的RVMI显著下降(^$$P＜0.01)。

3.3 PAH大鼠肺小动脉病理学观察及定量分析

对各组大鼠肺小动脉中膜厚度和WT％数据进行统计。图22为不同剂量WYQ钾盐晶型B及sildenafil和tadalafil治疗PAH大鼠21天后，放大200倍的不同组大鼠肺小动脉H&E染色标准图。图23和图24结果显示：与正常对照组相比，PAH模型组大鼠肺小动脉中膜厚度和WT％均显著增加(P<0.05)；WYQ钾盐晶型B给药的低剂量组、中剂量组、高剂量组的中膜厚度和WT％均明显下降和改善；他达拉非组与PAH模型组相比，肺小动脉中膜厚度及WT％也明显下降；西地那非组与PAH 模型组相比，中膜厚度有所下降，但下降的幅度不如WYQ钾盐晶型B 各剂量组和他达拉非组，且WT％与PAH模型组相比无显著统计学意义 (P＝0.468)。

3.4 PAH大鼠阴茎勃起功能观察

图25-30显示了不同剂量WYQ钾盐晶型B和sildenafil、tadalafil 治疗组大鼠灌胃1h/40min/30min后的阴茎勃起情况对比。观察结果： WYQ钾盐晶型B微剂量组灌胃后1小时，有30％大鼠出现阴茎勃起；低剂量组灌胃后1小时，有50％大鼠出现阴茎勃起；中剂量组灌胃后1 小时，有80％大鼠出现阴茎勃起；高剂量组灌胃后40分钟，有80％大鼠出现阴茎勃起，随着药物剂量增大，勃起后的阴茎尺寸更粗、颜色更红。他达拉非组灌胃后30分钟，有80％大鼠出现阴茎勃起，同样，西地那非组灌胃后30分钟，也有80％大鼠出现阴茎勃起，且与WYQ钾盐晶型B相比，Sildenafil和Tadalafil灌胃后出现阴茎勃起现象的时间更短、效果更显著。

三、特发性肺纤维化(IPF)大鼠实验

1.实验材料

1.1试剂

盐酸博莱霉素为日本化药株式会社产品；HPLC级水，BIBF由凯斯艾生物科技(苏州)有限公司提供；羧甲基纤维素钠为美国Sigma试剂公司产品；化合物WYQ的钾盐晶型B为实施例1中制备得到；异氟烷、戊巴比妥钠麻醉剂、福尔马林购自中国国药集团股份有限公司。

1.2仪器

日本Nikon光学显微镜摄像系统；动物呼吸机(HX-300S)、呼吸麻醉机(R580)：深圳市瑞沃德生命科技有限公司；组织脱水机：HistoCore Pearl，Leica；包埋机：HistoCoreArcadia，Leica；切片机：RM2235， Leica；自动染色机：LEICA Autostainer ST5020；切片扫描仪：Hamamatsu NanoZoomer Digital Pathology(S210)；分析天平：METTLERToledo，ALT104；体重秤：常熟市双杰测试仪器厂，T1000；电热毯：Jwilch， China；手术显微镜：Luckbird XTS-4A；足趾容量测量仪：(上海欣软信息科技有限公司)。

1.3实验动物

SPF级雄性SD大鼠。动物饲养于凯斯艾生物科技(苏州)有限公司动物中心SPF级屏障系统内，实验单位使用许可证号：SYXK(苏) 2017-0041，遵循国际标准温、湿、光控制系统。本实验动物操作方案经由凯斯艾生物科技(苏州)有限公司IACUC委员会联合审批确认。严格遵循凯斯艾生物科技(苏州)有限公司(KCI)的相关标准操作规程 (SOP)实行一切操作和管理。

2.实验方法

2.1实验分组

雄性SD大鼠32只，根据体重随机分为4组，8只/组：模型组、尼达尼布50mg/kg组(BIBF-50mg/kg)、WYQ钾盐晶型B 2.5mg/kg组 (CPD-1-2.5mg/kg)、WYQ钾盐晶型B 10mg/kg组(CPD-1-10mg/kg)。

2.2动物造模

在KCI动物实验操作SOP指导原则下实施本实验所涉及到的一切操作。动物购入后，适应性饲养3-7天后开始建模。动物称重后采用异氟烷吸入麻醉，确认动物麻醉之后，消毒颈部，剪开颈部皮肤，顿性分离肌肉暴露主气管，沿气管环之间切开一小口，插入PE-20管至左侧主支气管，直接注入博莱霉素(剂量：3mg/kg，体积：1.0ml/kg)，缝合气管以及皮肤。手术完毕后，将动物置于37℃电热毯保温至动物完全苏醒，确认能够自由采食和饮水后将动物返回饲养笼正常饲养。

2.3给药量及给药方式

模型组：按体重给予生理盐水灌胃，剂量为1ml.100g^-1.d^-1；

尼达尼布50mg/kg组(BIBF-50mg/kg)：BIBF用0.5％羧甲基纤维素钠配成10mg/ml的溶液，灌胃给药，给药量50mg.kg^-1.d^-1；

WYQ钾盐晶型B 2.5mg/kg组(CPD-1-2.5mg/kg)：WYQ钾盐晶型 B用生理盐水稀释成0.5mg/ml的溶液，灌胃给药，给药量2.5mg.kg^-1.d^-1；

WYQ钾盐晶型B10mg/kg组(CPD-1-10mg/kg)：WYQ钾盐晶型B 用生理盐水稀释成2mg/ml的溶液，灌胃给药，给药量10mg.kg^-1.d^-1；

各组大鼠于造模当天开始灌胃给药，每天一次，共计给药23天。

2.4试验指标及检测方法

2.4.1 IPF大鼠左肺重量和体积

连续给药23天后，各组动物按照KCI动物安乐死标准操作规程，给予动物腹腔注射戊巴比妥钠麻醉剂(100mg/kg)安乐死全部动物，经低温PBS全身灌注，再进行全身福尔马林灌注固定，取左肺，进行肺内等量福尔马林液灌注，进行称重及后续肺病理相关检测。

左肺大体病理检测：左肺等量福尔马林液灌注后采用微量天平分别称取并记录灌注后左肺湿重；采用足趾容量测量仪测量并记录灌注后左肺体积。

2.4.2 IPF大鼠肺组织病理学检测

按照KCI病理标准SOP进行左肺整肺脱水，石蜡块制作，左肺整肺石蜡切片，片厚3-4μm；遵循KCI病理标准染色SOP进行HE染色、 Masson Trichrome染色，并通过HamamatsuNanoZoomer Digital Pathology (S210)切片扫描仪进行切片全景扫描；通过MassonTrichrome染色切片进行肺病变面积计算，左肺纤维化面积(％)为纤维化面积占左肺面积的百分比；在病变区域内随机选择10个面积大小为1mm²的视野，病理学家根据Ashcroft评分系统(如表8和图40所示)在双盲条件下进行半定量评分。

表8 Ashcroft评分标准

3.实验结果

3.1 IPF大鼠左肺重量和体积

连续给药23天后各组IPF大鼠左肺重量和体积的统计结果如表9 所示，图31为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，对大鼠左肺重量的影响图；图32为不同剂量WYQ钾盐晶型B和 BIBF治疗IPF大鼠23天后，对大鼠左肺体积的影响图。

表9 连续给药23天后各组IPF大鼠左肺重量和体积的统计结果

组别	动物数(只)	左肺重量(g)	左肺体积(mm<sup>3</sup>)
				模型组	8	1.56±0.11	1739±116.23
BIBF-50mg/kg	8	1.58±0.12	1736.9±136.10
				CPD-1-2.5mg/kg	8	1.59±0.10	1779.9±105.76
CPD-1-10mg/kg	8	1.47±0.16	1604.5±153.72

结果显示：各给药组和模型组间左肺重量和体积在统计学上无显著性差异。

3.2 IPF大鼠大鼠肺组织病理学检测

3.2.1左肺肺纤维化病灶和病灶范围

由图33-34可见肺部组织界限较为清晰的显著性肺损伤，两种不同的肺组织学染色(H&E和Masson Trichrom染色)清晰可见左肺均匀一致的纤维化病灶以及病灶分布范围。不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF 治疗IPF大鼠23天后，与模型组相比，左肺肺纤维化病灶和病灶范围无显著性差异。

3.2.2 IPF大鼠左肺肺纤维化病灶内细支气管和肺细小动脉的组织学变化

观察表现为细支气管、终末细支气管、肺泡管上皮细胞不同程度的增生，部分上皮乃至全层上皮杯状细胞化，管腔内可见不等量粘液组织。肺细小动脉管壁不同程度的炎细胞浸润，部分管壁增厚，平滑肌增生以及管壁外模膜肉芽组织增生。图35为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF 治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶内细支气管和肺细小动脉的组织学变化对比图(HE染色)，图36为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF 治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶边缘细支气管和肺细小动脉的组织学变化对比图。由图35-36可见治疗后左肺肺纤维化病灶内细支气管和肺细小动脉，病灶边缘细支气管和肺细小动脉平滑肌增生及炎细胞浸润状况得到改善。与模型组相比，CPD-1-10mg/kg治疗组效果更明显。

3.2.3 IPF大鼠左肺肺纤维化病灶内肺泡组织损伤

IPF大鼠左肺肺纤维化病灶内肺泡组织不同程度损伤，表现为肺泡上皮脱落与再生，肺泡壁增厚，纤维化；肺泡腔内不同程度的纤维组织沉积，炎性渗出，炎细胞浸润；纤维化病灶内片状肺泡结构损伤、消失，由大量渗出的炎细胞和增生的结缔组织充填，残存肺泡腔内可见炎性渗出物和增生的结缔组织。

图37为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶内肺泡组织结构变化对比图(HE染色，图片放大倍率：×200)。结果显示：BIBF-50mg/kg治疗组，纤维化病灶内部分肺泡结构仍有损伤，残存肺泡壁增厚，壁内炎细胞浸润；CPD-1-2.5mg/kg治疗组，纤维化病灶内部分肺泡结构损伤，残存肺泡壁增厚，壁内有炎细胞浸润；CPD-1-10mg/kg治疗组，纤维化病灶内肺泡结构保存，肺泡壁增厚，壁内炎细胞浸润。

图38为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶肺泡的组织结构变化对比图(Masson Trichrom染色，图片放大倍率：×200)。结果显示：BIBF-50mg/kg治疗组，纤维化病灶内部分肺泡结构消失，残存肺泡壁增厚；CPD-1-2.5mg/kg治疗组，纤维化病灶内部分肺泡结构保存，肺泡壁增厚，肺泡壁损伤区域可见炎性渗出物和增生的结缔组织；CPD-1-10mg/kg治疗组，纤维化病灶内大部分肺泡结构保存，肺泡壁增厚，部分修复的肺泡壁结构，肺泡腔内可见少量炎性渗出物。

3.2.4 IPF大鼠左肺肺纤维化病灶面积

图39为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化面积的变化对比图(图中正常对照组是指模型组未给药的一侧肺)，结果显示：模型组和各给药组之间病灶面积基本相同，提示本模型的稳定和均匀一致性。

3.2.5 IPF大鼠左肺肺纤维化病灶评分和评分百分比

图40为肺纤维化病理评分(Masson Trichrome染色)标准。表10 为肺纤维化Ashcraft评分和评分百分比统计结果，图41为不同剂量WYQ 钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶评分的变化对比图(图中正常对照组是指模型组未给药的一侧肺)；图42为不同剂量WYQ钾盐晶型B和BIBF治疗IPF大鼠23天后，左肺肺纤维化病灶评分百分比的变化对比图(图中正常对照组是指模型组未给药的一侧肺)。

表10为肺纤维化Ashcraft评分和评分百分比统计结果

注：One-way ANOVA:^*p<0.05vs模型组；^**p<0.01vs.模型组；^***p<0.001vs.模型组；^###p<0.001vs.正常对照组。

肺纤维化Ashcraft评分结果显示：阳性对照药品BIBF在50mg/kg 剂量下与模型组相比，显著改善大鼠左肺纤维化的程度(p<0.05)；WYQ 钾盐晶型B在10mg/kg剂量下，每天一次口服给药，连续23天，可显著抑制肺纤维化，与模型组比较具有显著性差异(p<0.05)。

以Ashcraft评分3分为界，计算3分以下(包含3分)或4分以上 (包含4分)的肺纤维化程度的百分比，结果显示：模型组接近51％以上的病灶区域评分在4分或4分以上，经过药物治疗后各药物治疗组动物的病灶区评分在4分以上区域在25-50％之间。统计学结果显示，阳性药BIBF治疗后肺纤维化程度的百分比与模型组相比显著减少(p<0.05)； WYQ钾盐晶型B在10mg/kg剂量下，治疗组与模型组比较肺纤维化程度的百分比与模型组相比均显著减少(p<0.05)。

以上实验结果证明，本发明提供了一种PDE5i钾盐晶型B，该钾盐晶型具有水溶性好、吸湿性小、理化性质稳定的优势，且本发明证实 WYQ钾盐晶型B可用于治疗PAH、IPF及勃起功能障碍，能够有效降低RVSP，缓解右心室肥厚，改善肺小动脉增生，减轻肺纤维化病灶内纤维化程度，使肺泡结构损伤和和细小支气管、肺小动脉增生得到缓解。本发明提供的钾盐晶型B还可用于治疗肾脏纤维化、心肌肥大。此外， PDE5i新晶型水溶性显著提高，从而可以减少其治疗用量，减轻肝肾压力，降低治疗疾病的经济费用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种化合物的钾盐晶型B，其特征在于，所述化合物的结构式如式(I)所示，

所述钾盐晶型B的X-射线粉末衍射(XRPD)图在下述2θ角有特征峰：5.71°±0.2°，8.23°±0.2°，11.37°±0.2°，13.22°±0.2°，17.09°±0.2°，21.56°±0.2°，23.99°±0.2°，25.85°±0.2°。

2.根据权利要求1所述的化合物的钾盐晶型B，其特征在于，所述钾盐晶型B的X-射线粉末衍射(XRPD)图在下述2θ角还有特征峰：15.88°±0.2°，16.35°±0.2°，18.47°±0.2°，19.70°±0.2°，22.90°±0.2°，23.64°±0.2°，31.92°±0.2°。

3.根据权利要求2所述的化合物的钾盐晶型B，其特征在于，所述钾盐晶型B的X-射线粉末衍射(XRPD)图在下述2θ角还有特征峰：25.04°±0.2°，26.54°±0.2°，28.36°±0.2°，29.94°±0.2°，35.48°±0.2°，37.83°±0.2°。

4.根据权利要求1-3任一所述的化合物的钾盐晶型B，其特征在于，所述钾盐晶型B具有如图1所示的X-射线粉末衍射(XRPD)图。

5.根据权利要求1-4任一所述的化合物的钾盐晶型B，其特征在于，所述钾盐晶型B的差示扫描量热法图谱(DSC)在峰值191.3℃和217.9℃处具有吸热峰。

6.根据权利要求1-5任一所述的化合物的钾盐晶型B，其特征在于，所述钾盐晶型B具有如图2所示的TG-DSC图谱。

7.根据权利要求1-6任一所述的化合物的钾盐晶型B，其特征在于，所述钾盐晶型B的结构式为：

8.一种权利要求1-7任一所述的化合物的钾盐晶型B的制备方法，其特征在于，包括：

将如式I所示化合物和溶剂混合形成悬浊液1；

9.根据权利要求1-8任一所述的化合物的钾盐晶型B的制备方法，其特征在于，所述溶剂选用丙酮、四氢呋喃、乙酸乙酯或乙醇。

10.根据权利要求1-9任一所述的化合物的钾盐晶型B的制备方法，其特征在于，所述如式I所示的化合物和溶剂的质量体积比为25-30mg/mL，所述氢氧化钾和所述如式I所示的化合物的质量比为1:(7-10)。

11.根据权利要求1-10任一所述的化合物的钾盐晶型B的制备方法，其特征在于，所述搅拌结晶为：将悬浊液2依次在45-50℃下搅拌5-10min，在20-30℃下搅拌20-24h，在45-50℃下搅拌8-10h。

12.根据权利要求1-11任一所述的化合物的钾盐晶型B的制备方法，其特征在于，包括：

13.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-7任一所述的化合物的钾盐晶型B和药学上可接受的载体。

14.权利要求1-7任一所述的化合物的钾盐晶型B在制备治疗肺动脉高压的药物中的应用。

15.权利要求1-7任一所述的化合物的钾盐晶型B在制备治疗特发性肺纤维化的药物中的应用。

16.权利要求1-7任一所述的化合物的钾盐晶型B在制备治疗肾脏纤维化的药物中的应用。

17.权利要求1-7任一所述的化合物的钾盐晶型B在制备治疗心肌肥大的药物中的应用。

18.权利要求1-7任一所述的化合物的钾盐晶型B在制备治疗勃起功能障碍的药物中的应用。