CN1295242C

CN1295242C - 2′－脱氧－β－L－核苷的3′－前体药物

Info

Publication number: CN1295242C
Application number: CNB018138020A
Authority: CN
Inventors: M·L·布赖安特; G·戈塞林; J·－L·伊姆巴赫
Original assignee: Montpellier Ii, University of; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Idenix Cayman Ltd
Current assignee: Montpellier Ii, University of; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Idenix Cayman Ltd
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2001-06-15
Publication date: 2007-01-17
Anticipated expiration: 2021-06-15
Also published as: ES2317912T3; OA12384A; MXPA02012443A; JP2004533403A; AU6692701A; MA27126A1; DE60136181D1; EP1296995A2; ZA200300168B; BR0111732A; AR035711A1; EP1296995B1; PE20020216A1; JP4639032B2; UY26779A1; CA2413163C; KR20030032967A; CN1452627A; AU2001266927B2; KR20070048277A

Abstract

本发明涉及用于治疗乙型肝炎病毒感染的宿主的化合物、组合物和方法。具体地说，本发明公开2′-脱氧-β-L-核苷的3′-酯的化合物和组合物，所述化合物和组合物可以单独给予，或者与其它抗乙型肝炎剂联合给予。本发明还公开2′-脱氧-β-L-核苷的3′，5′-酯的化合物和组合物，所述化合物和组合物可以单独给予，或者与其它抗乙型肝炎剂联合给予。

Description

2′-脱氧-β-L-核苷的3′-前体药物

发明领域

本发明涉及用于治疗乙型肝炎病毒的2′-脱氧-β-L-核苷的3′-前体药物。

本申请要求2000年6月15日提交的美国临时申请序号60/212,100的优先权。

发明背景

乙型肝炎病毒(“HBV”)是仅次于烟草的人类癌症起因。虽然人们假设HBV可能直接触发肿瘤发育，或通过慢性炎症、肝硬化以及与感染有关的细胞再生间接触发肿瘤发育，但HBV引起癌症的机制仍然未知。

乙型肝炎病毒已经在世界范围内流行。HBV感染宿主，在宿主未知的情况下潜伏二到六个月后，引起急性肝炎和肝损害，随之导致腹痛、黄疸以及某些酶的血液水平提高。HBV可能引起暴发性肝炎，即一种快速进行性、常常是致死形式的疾病，在该疾病中大量肝组织受到破坏。患者通常能够从急性病毒性肝炎康复。然而，在某些患者体内，血液中高水平的病毒抗原持续更长或不确定时间，从而引起慢性感染。慢性感染可能引起慢性持续性肝炎。感染慢性持续性HBV的患者在发展中国家最常见。慢性持续性肝炎能够导致疲劳、肝硬化和肝细胞癌(即一种原发性肝癌)。在西方发达国家，HBV的高危群体包括那些接触HBV携带者或其血液样品的群体。HBV的流行病学实际上非常类似于获得性免疫缺陷综合征的流行病学，这项事实解释了为什么HBV感染在患有AIDS或HIV相关感染的患者中普遍存在的原因。然而，HBV比HIV更具传染性。

使用一种遗传工程化蛋白α-干扰素进行的每日治疗很有希望。也已经开发出一种源于人类血清的疫苗，用于免疫接种患者，使其抵抗HBV。人们已经通过遗传工程生产疫苗。虽然已经证实所述疫苗有效，但由于来自慢性携带者的人类血清供应有限，并且纯化程序长而昂贵，使得生产所述疫苗很麻烦。此外，从不同血清制备的每一批疫苗必须在黑猩猩体内测试以保证安全性。另外，所述疫苗无法帮助已经感染病毒的患者。

在嘌呤核苷和嘧啶核苷对病毒性疾病(尤其是HBV和HIV)的作用模式中，主要步骤是它们受到细胞激酶和病毒激酶的代谢激活，产生一磷酸、二磷酸和三磷酸衍生物。许多核苷的生物活性种类是三磷酸形式，该形式抑制DNA聚合酶或反转录酶，或导致链终止。

已经鉴定出显示对抗HBV活性的多种合成核苷。在Liotta等的美国专利5,539,116中要求保护称为3TC的BCH-189(2′，3′-二脱氧-3′-硫代胞苷)的(-)-对映体，该物质目前正在进行治疗乙型肝炎的临床试验。还可见BioChem Pharma，Inc.提交的EPA 0 494 119 A1。

在Liotta等的美国专利序号5,814,639和序号5,914,331中所要求保护的β-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊(己)烷(oxathiolane)(“FTC”)显示对抗HBV活性。见Furman等，“顺式-5-氟-1-{2-(羟甲基)-1，3-氧硫杂环戊(己)烷-5-基}-胞嘧啶的(-)和(+)对映体的抗乙型肝炎病毒活性、细胞毒性和合成代谢剖析” Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1992年12月，第2686-2692页；和Cheng等， Journal of Biological Chemistry第267卷(20)，13938-13942(1992)。

美国专利序号5,565,438、序号5,567,688和序号5,587,362(Chu等)公开应用2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿拉伯糖尿苷(arabinofuranolyluridine)(L-FMAU)治疗乙型肝炎和EB病毒。

喷昔洛韦(Penciclovir)(PCV，2-氨基-1，9-二氢-9-{4-羟基-3-(羟甲基)丁基}-6H-嘌呤-6-酮)具有对抗乙型肝炎的确定活性。见美国专利序号5,075,445和5,684,153。

Adefovir(9-{2-(膦酰基甲氧基)乙基}腺嘌呤也称为PEMA或{{2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙氧基}甲基膦酸}，也具有对抗乙型肝炎的确定活性。见，例如，美国专利序号5,641,763和序号5,142,051。

Yale University和The University of Georgia Research Foundation，Inc.在WO 92/18517中公开应用L-FDDC(5-氟-3′-硫代-2′，3′-二脱氧胞苷)治疗乙型肝炎病毒。

其它研究用于治疗HBV的药物包括腺苷阿拉伯糖苷、胸腺素、无环鸟苷、膦酰基甲酸、齐多夫定、(+)-cyanidanol、奎吖因和2′-氟阿拉伯糖基-5-碘尿嘧啶。

归于Emory University的美国专利序号5,444,063和序号5,684,010公开应用β-D-1，3-二氧戊烷嘌呤核苷的纯对映体治疗乙型肝炎。

Emory University、UAB Research Foundation和the Centre Nationalde la Recherche Scientifique(CNRS)提交的WO 96/40164公开用于治疗乙型肝炎的多种β-L-2′，3′-二脱氧核苷。

Emory University、UAB Research Foundation和the Centre Nationalde la Recherche Scientifique(CNRS)提交的WO 95/07287公开用于治疗HIV感染的2′或3′脱氧和2′，3′-二脱氧-β-L-呋喃戊糖基核苷。

Genencor International，Inc.和Lipitek，Inc.提交的WO 96/13512公开制备用作抗肿瘤剂和杀病毒剂的L-呋喃核糖基核苷。

WO 95/32984公开用作免疫抑制药物的核苷一磷酸的脂类酯。

DE 4224737公开胞嘧啶核苷和它们的药物应用。

Tsai等在Biochem.Pharmacol.1994，48(7)，1477-81中公开抗HIV剂2’-β-D-F-2′，3′-二脱氧核苷类似物对于线粒体DNA的细胞含量和乳酸产生的效应。

Galvez，J.Chem.Inf.Comput.Sci.1994，35(5)，1198-203描述β-D-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-5-氟胞苷的分子计算。

Mahmoudian，Pharm.Research 1991，8(1)，43-6公开HIV剂如β-D-3′-叠氮基-2′，3′-二脱氧-5-氟胞苷的结构-反应性关系的定量分析。

美国专利序号5,703,058公开用于治疗HIV或HBV的(5-甲酰亚氨基(carboximido)或5-氟)-(2′，3′-不饱和或3′-修饰)嘧啶核苷。

Lin等在J.Med.Chem.31(2)，336-340(1988)公开β-D-核苷的各种3′-叠氮基类似物的合成和抗病毒活性。

Novirio Pharmaceuticals，Ltd.提交的WO 00/3998公开制备取代6-苄基-4-氧代嘧啶的方法，以及所述嘧啶用于治疗HIV的应用。

Novirio Pharmaceuticals，Ltd.也是在WO 00/09531中首次公开2′-脱氧-β-L-赤呋喃五并核苷(erythropentofuranonucleoside)以及它们在治疗HBV中的应用。公开了治疗人类和其它宿主动物乙型肝炎感染的一种方法，包括给予有效量的(可任选地在药学可接受的载体中)具有生物活性的下列物质：2′-脱氧-β-L-赤-呋喃五并核苷(也称为β-L-dN或β-L-2′-dN)或其药学上可接受的盐或前体药物，包括β-L-脱氧核糖胸苷(β-L-dT)、β-L-脱氧核糖胞苷(β-L-dC)、β-L-脱氧核糖尿苷(β-L-dU)、β-L-脱氧核糖鸟苷(β-L-dG)、β-L-脱氧核糖腺苷(β-L-dA)和β-L-脱氧核糖肌苷(β-L-dI)，所述物质或者单独给予，或者联合给予。还公开了所述活性化合物的5′和N⁴(胞苷)或N⁶(腺苷)酰化或烷基化衍生物或5′-磷脂或5′-醚脂。

已经尝试抗病毒药物的各种前体药物。最著名的归于Beauchamp的美国专利序号4,957,924公开的无环鸟苷的各种治疗用酯。

考虑到乙型肝炎病毒已经在世界范围内流行，并且其对受感染患者有严重并且常常是悲惨的影响，因此，有极大必要为感染所述病毒的患者提供低毒的新型有效药剂。

因此，本发明的一个目标是提供用于治疗受到HBV感染的人类患者或其它宿主的化合物、组合物和方法。

发明简述

2′-脱氧-β-L-核苷的3′-前体药物、或其药学上可接受的盐、或包含这些化合物的药学上可接受的制剂可用于预防和治疗乙型肝炎感染和其它相关病理状况，例如抗HBV抗体阳性和HBV阳性的病理状况、HBV导致的慢性肝炎、肝硬化、急性肝炎、暴发性肝炎、慢性持续性肝炎和疲劳。这些化合物或制剂也可预防性地用于防止或延迟下面个体体内的临床疾病发展：抗HBV抗体或HBV抗原阳性的个体，或已经暴露于HBV的个体。

还公开治疗宿主(包括人类)体内乙型肝炎病毒感染的方法，包括给予(可任选地在药学上可接受的载体内给予)有效量的生物活性2′-脱氧-β-L-核苷的3′-前体药物或其药学上可接受的盐，所述物质或者单独给予，或者与另一种抗乙型肝炎病毒剂联合给予或交替给予。本说明书中使用的术语2′-脱氧指在2′位没有取代基的核苷。本文所用术语3′-前体药物指在3′位具有生物可裂解部分的2′-脱氧-β-L-核苷，所述生物可裂解部分包括但不限于酰基，在一个实施方案中是L-氨基酸。

在一个实施方案中，所述2′-脱氧-β-L-核苷3′-前体药物在3′位和/或5′位上包括生物活性可裂解的部分。优选部分是包括缬氨酰基的氨基酸酯和包括乙酰基的烷基酯。因此，本发明具体包括：具有所需嘌呤碱基或嘧啶碱基的2′-β-L-脱氧核苷的3′-L-氨基酸酯和3′，5′-L-二氨基酸酯，其中所述母体药物在2.2.15细胞中EC₅₀低于15微摩尔，最好低于10微摩尔；具有所需嘌呤碱基或嘧啶碱基的3′-(烷基酯或芳基酯)-或3′，5′-L-二(烷基酯或芳基酯)-2′-β-L-脱氧核苷，其中所述母体药物在2.2.15细胞中EC₅₀低于10或15微摩尔；2′-脱氧-β-L-核苷的3′，5′-二酯的前体药物，其中(i)所述3′-酯是一种氨基酸酯，所述5′-酯是一种烷基酯或芳基酯；(ii)两种酯都是氨基酸酯；(iii)两种酯都独立地是烷基酯或芳基酯；(iv)所述3′-酯独立地是一种烷基酯或芳基酯，所述5′-酯是一种氨基酸酯，其中所述母体药物在2.2.15细胞中EC₅₀低于10或15微摩尔。

包括在本发明内的前体药物的例子有：2′-脱氧-β-L-胞苷的3′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-胸腺嘧啶的3′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-腺苷的3′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-鸟苷的3′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-5-氟-胞苷的3′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-尿苷的3′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-胞苷的3′-乙酰酯；2′-脱氧-β-L-胸腺嘧啶的3′-乙酰酯；2′-脱氧-β-L-腺苷的3′-乙酰酯；2′-脱氧-β-L-鸟苷的3′-乙酰酯；2′-脱氧-β-L-5-氟-胞苷的3′-乙酰酯；2′-脱氧-β-L-(胞苷、5-氟-胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷或胸腺嘧啶)的3′-酯，其中(i)所述3′-酯是一种氨基酸酯；或(ii)所述3′-酯是一种烷基酯或芳基酯。

包括在本发明内的前体药物的其它例子有：2′-脱氧-β-L-胞苷的3′，5′-L-二缬氨酸酯(dival-L-dC)；2′-脱氧-β-L-胸腺嘧啶的3′，5′-L-二缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-腺苷的3′，5′-L-二缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-鸟苷的3′，5′-L-二缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-5-氟-胞苷的3′，5′-L-二缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-尿苷的3′，5′-L-二缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-胞苷的3′，5′-L-二乙酰酯；2′-脱氧-β-L-胸腺嘧啶的3′，5′-L-二乙酰酯；2′-脱氧-β-L-腺苷的3′，5′-L-二乙酰酯；2′-脱氧-β-L-鸟苷的3′，5′-L-二乙酰酯；2′-脱氧-β-L-5-氟-胞苷的3′，5′-L-二乙酰酯；2′-脱氧-β-L-(胞苷、5-氟-胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷或胸腺嘧啶)的3′，5′-二酯，其中(i)所述3′-酯是一种氨基酸酯，所述5′-酯是一种烷基酯或芳基酯；(ii)两种酯都是氨基酸酯；(iii)两种酯都独立地是烷基酯或芳基酯；(iv)所述3′-酯是一种烷基酯或芳基酯，所述5′-酯是一种氨基酸酯。

在第二个实施方案中，本发明提供由式(I)定义的β-L核苷3′-前体药物或其在药学上可接受的盐：

其中

R¹是氢、直链烷基、支链烷基或环状烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸根、二磷酸根或三磷酸根或磷酸根衍生物；

R²选自：直链烷基、支链烷基或环状烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸根、二磷酸根或三磷酸根或磷酸根衍生物；

X是O、S、SO₂或CH₂；且

BASE为可任选取代的嘌呤碱基或嘧啶碱基。

在优选的实施方案中，X为O。

在一个实施方案中，R¹和/或R²为氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)，其中

R⁸是氨基酸侧链，其中在脯氨酸中，R⁸可任选地与R¹⁰连接形成环状结构；或者，R⁸是烷基、芳基、杂芳基或杂环部分；

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

R¹⁰和R¹¹独立地是氢、酰基(包括连接于R⁸的酰基衍生物)或烷基(包括但不限于甲基、乙基、丙基和环丙基)。

在一个具体的实施方案中，所述β-L核苷3′-前体药物是下式的β-L-2′-脱氧嘌呤或其在药学上可接受的盐：

其中

Y是OR³、NR³R⁴或SR³；和

X¹和X²独立地选自：H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR⁵、NR⁵R⁶或SR⁵；和

R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基(尤其是环丙基)、二烷基氨基亚烷基(尤其是二甲氨基亚甲基)、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸根、二磷酸根或三磷酸根或磷酸根衍生物。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在一个具体的实施方案中，所述β-L核苷3′-前体药物是下式的β-L-2′-脱氧腺苷或其在药学上可接受的盐：

其中

R³和R⁴独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基(尤其是环丙基)、二烷基氨基亚烷基(尤其是二甲氨基亚甲基)、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸根、二磷酸根或三磷酸根或磷酸根衍生物。

在优选实施方案中，R¹是H。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在另一优选实施方案中，R²是一种氨基酸残基，尤其是L-缬氨酰基。

在一个实施方案中，R³是氢，R⁴是二甲氨基亚甲基。

在另一实施方案中，R³是氢，R⁴是乙酰基。

在另一实施方案中，R³是氢，R⁴是L-缬氨酰基。

在另一具体的实施方案中，所述β-L核苷是下式的β-L-2′-脱氧鸟苷或其在药学上可接受的盐：

其中

R⁵和R⁶独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基(尤其是环丙基)、二烷基氨基亚烷基(尤其是二甲氨基亚甲基)、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸根、二磷酸根或三磷酸根或磷酸根衍生物。

在优选实施方案中，R¹是H。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在一个实施方案中，R⁵是氢，R⁶是二甲氨基亚甲基。

在另一实施方案中，R⁵是氢，R⁶是乙酰基。

在另一实施方案中，R⁵是氢，R⁶是L-缬氨酰基。

在另一具体的实施方案中，所述β-L核苷3′-前体药物是下式的β-L-2′-脱氧肌苷或其药学上可接受的盐或前体药物：

或其药学上可接受的盐，其中

在优选实施方案中，R¹是H。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在本发明的另一实施方案中，所述β-L核苷3′-前体药物是下式的β-L-2′-脱氧嘧啶或其在药学上可接受的盐：

其中

Y是OR³、NR³R⁴或SR³；和

X¹选自：H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、卤素、OR⁵、NR⁵R⁶或SR⁵；和

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在一个具体的实施方案中，所述β-L核苷3′-前体药物是下式的β-L-2′-脱氧胞苷或其在药学上可接受的盐：

其中

在一个实施方案中，X¹是氢。

在另一实施方案中，X¹是一种卤素，即氟、氯、溴或碘。

在优选实施方案中，R¹是H。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在一个实施方案中，R³是氢，R⁴是二甲氢基亚甲基。

在另一实施方案中，R³是氢，R⁴是乙酰基。

在另一实施方案中，R³是氢，R⁴是L-缬氨酰基。

在另一实施方案中，所述β-L核苷3′-前体药物是下式的β-L-2′-脱氧尿苷或其药学上可接受的盐：

其中

在优选实施方案中，R¹是H。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在另一具体的实施方案中，所述β-L核苷3′-前体药物是下式的β-L-胸苷或其药学上可接受的盐：

其中

在优选实施方案中，R¹是H。

在一个实施方案中，所述氨基酸残基是式C(O)C(R⁸)(R⁹)NR¹⁰R¹¹)，其中

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

本发明还提供至少两种本文所述前体药物的组合。

本发明还提供至少其中一种所述3′-前体药物与第二种表现抗乙型肝炎活性的核苷相组合或交替，所述第二种核苷包括但不限于本文定义的任何一种前体药物的母体药物，即2′-脱氧-β-L-核苷，包括2′-脱氧-β-L-胞苷、2′-脱氧-β-L-胸腺嘧啶、2′-脱氧-β-L-腺苷、2′-脱氧-β-L-鸟苷、2′-脱氧-β-L-5-氟胞苷。或者，所述3′-前体药物可以与其它抗乙型肝炎病毒剂组合或交替给予，所述抗乙型肝炎病毒剂例如(-)-顺-2′，3′-二脱氧-3′-硫代胞苷、顺-2′，3′-二脱氧-3′-硫代-5-氟胞苷、L-FMAU、adefovir、法昔洛韦(famciclovir)、和entecivir或在2.2.15细胞中表现EC₅₀低于10或15微摩尔的任何其他化合物、或它们的前体药物或药学上可接受的盐。

本发明还包括将所述前体药物与免疫调节剂或其它有药学活性的病毒复制调节物联合或交替给予，所述病毒复制调节物包括生物物质例如蛋白质、肽、寡核苷酸或γ-球蛋白，包括但不限于干扰素、白介素或表达或调节乙型肝炎复制的基因的反义寡核苷酸。

按照本文更详细陈述的方法，可以根据在体外降低病毒复制速率50％所需抗HBV化合物母体的浓度测量所述化合物的功效(即所述化合物的EC₅₀)。在优选实施方案中，所述前体药物化合物的母体在体外在受到肝炎病毒粒子转染的2.2.15细胞中测试时，表现EC₅₀低于15微摩尔，最好低于10微摩尔。

附图简述

图1a和1b是依照本发明非限制性的说明性实施例，分别说明从2′-脱氧-β-L-胞苷合成2′-脱氧-β-L-胞苷(βL-dC)的3′-和5′-缬氨酰酯。

图2是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从2′-脱氧-β-L-胞苷合成N⁴-乙酰基-2′-脱氧-β-L-胞苷。

图3是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从2′-脱氧-β-L-胞苷合成N⁴-[(二甲氨基)亚甲基]-2′-脱氧-β-L-胞苷。

图4是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从2′-脱氧-β-L-胞苷合成3′，5′-二-O-乙酰基-2′-脱氧-β-L-胞苷。

图5是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从2′-脱氧-β-L-胞苷合成2′-脱氧-β-L-胞苷的3′，5′-二-O-缬氨酰酯。

图6是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从2′-脱氧-β-L-胞苷合成2′-脱氧-β-L-胞苷的N⁴-(Boc-缬氨酰基)酯。

图7是依照本发明的非限制性说明性实施例，说明从3′，5′N⁴-三-(Boc-L-缬氨酰基)-2′-脱氧-β-L-胞苷合成3′，5′，N⁴-三-(L-缬氨酰基)-2′-脱氧-β-L-胞苷。

图8是线形图，描述用于确定各种核苷稳定性的标准校准技术。

图8a是根据天然β-D-脱氧核糖胞苷确定的校准曲线。图8b是根据β-L-脱氧核糖胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯确定的校准曲线。

图9a是非限制性实施例，描述用于在pH 7.42时评估β-L-脱氧核糖胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯的稳定性的HPLC图谱。所述HPLC图谱表明β-L-脱氧核糖胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯和三种活性代谢物的存在，所述三种活性代谢物是β-L-脱氧核糖胞苷的3′-缬氨酰酯、β-L-脱氧核糖胞苷的5′-缬氨酰酯和L-dC。图9b是线形图，描述β-L-脱氧核糖胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯和其代谢物以时间为坐标的相对浓度。

相似地，图10a和图11a是非限制性实施例，分别描述用于在pH7.20和pH 4.51时评估β-L-脱氧核糖胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯的稳定性的HPLC图谱。在这些pH下，所述HPLC图谱表明β-L-脱氧核糖胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯和三种活性代谢物的存在，所述三种活性代谢物是β-L-脱氧核糖胞苷的3′-缬氨酰酯、β-L-脱氧核糖胞苷的5′-缬氨酰酯和L-dC。图10b和图11b是线形图，描述β-L-脱氧核糖胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯和其代谢物以时间为坐标的相对浓度。

图12是非限制性实施例，描述用于在pH 1.23时评估β-L-脱氧核糖胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯的稳定性的HPLC图谱。在该pH下，所述HPLC图谱表明仅存在β-L-脱氧核糖胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯，而没有分解成其三种活性代谢物中的任何一种。

图13是线形图，描述β-L-脱氧核糖胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯在人血浆中的体外代谢。

图14是线形图，描述β-L-脱氧核糖胞苷(L-dC)在HepG2细胞中的细胞内代谢。

图15是线形图，描述L-dC在初级人肝细胞中的细胞内代谢。

图16是条形图，描述在慢性乙型肝炎病毒感染的旱獭模型中L-dC对于治疗慢性乙型肝炎病毒感染28天的抗病毒剂量反应。

图17是线形图，描述在慢性乙型肝炎病毒感染的旱獭模型中L-dC的抗病毒活性。

图18是线形图，指示用L-dC(0.01-10mg/kg/天)口服治疗28天的各个旱獭的体重。

图19是线形图，指示用L-dC(1mg/kg/天)口服治疗12周的各个旱獭的体重。

发明详述

如本文所述，本发明是用于在人类和其它宿主动物中治疗乙型肝炎病毒的化合物、方法和组合物。所述方法包括给予HBV治疗有效量的(可任选地在药学上可接受的载体中)如本文所述的β-L-核苷的3′-前体药物或其药学上可接受的盐。本发明的化合物或者具有抗病毒(即抗HBV)活性，或者通过代谢成为显示所述活性的化合物。

总之，本发明包括下面特征：

(a)如本文所述的β-L-2′-脱氧-核苷3′-前体药物及其药学上可接受的盐、酯和组合物；

(b)用于治疗或预防乙型肝炎感染，尤其是在诊断受到乙型肝炎感染或受到乙型肝炎感染威胁的个体中治疗或预防乙型肝炎感染的如本文所述的β-L-2′-脱氧-核苷3′-前体药物及其药学上可接受的盐、酯和组合物；

(c)应用如本文所述的β-L-2′-脱氧-核苷3′-前体药物及其药学上可接受的盐、酯和组合物生产用于治疗乙型肝炎感染的药物；

(d)包括β-L-2′-脱氧-核苷3′-前体药物或其药学上可接受的盐以及一种药学上可接受的载体或稀释剂的药用制剂；

(e)如本文所述的β-L-2′-脱氧-核苷3′-前体药物及其药学上可接受的盐、酯和组合物，上述物质基本不含所述核苷相反的对映体，或基本与其它化学物质分离；

(f)用于制备β-L-2′-脱氧-核苷3′-前体药物的方法，如下文更详细描述；

(g)用于制备β-L-2′-脱氧-核苷3′-前体药物的方法，上述物质基本不含所述核苷的对映体，或基本与其它化学物质分离；

(h)对受到乙型肝炎感染的患者的治疗方法，包括给予有效量的β-L-2′-脱氧-核苷3′-前体药物、其药学上可接受的盐、酯或组合物以及第二种抗乙型肝炎剂；

(i)对受到乙型肝炎感染的患者的治疗方法，包括给予有效量的β-L-2′-脱氧-核苷3′-前体药物、其药学上可接受的盐、酯或组合物以及另一种β-L-2′-脱氧核苷的母体；

(j)对受到乙型肝炎感染的患者的治疗方法，包括给予有效量的β-L-2′-脱氧-核苷3′-前体药物、其药学上可接受的盐或酯以及第二种抗乙型肝炎剂的母体；

(k)对受到乙型肝炎感染的患者的治疗方法，包括给予有效量的β-L-2′-脱氧-胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯或二乙酰酯、其药学上可接受的盐或酯以及第二种抗乙型肝炎剂；和

(l)对受到乙型肝炎感染的患者的治疗方法，包括给予有效量的β-L-2′-脱氧-胞苷的3′，5′-二缬氨酰酯或二乙酰酯、其药学上可接受的盐或酯以及β-L-2′-脱氧-胸苷或其药学上可接受的盐。

尤其优选的组合是β-L-dC(也称为L-dC)的3′，5′-前体药物与母体β-L-dT(也称为L-dT)的组合，特别是β-L-dC的3′，5′-二缬氨酰酯或3′，5′-二乙酰酯与β-L-dT的组合。L-dC中性碱和HCl盐在啮齿动物和非人类灵长类动物中的口服生物利用度低。已经发现L-dC与其它核苷或核苷类似物显著竞争从胃肠道的吸收或转运，并且其它核苷或核苷类似物与L-dC竞争吸收。为改善口服生物利用度和降低药物-药物相互作用的可能性，建立使用猴子的药代动力学筛选。该筛选鉴定比母体分子口服生物利用度更高、对联合应用的其它核苷或核苷类似物的生物利用度影响降低的L-dC的3′-前体药物。与所述L-dC的前体药物联合应用的所述核苷或核苷类似物的例子有L-dT、L-dA、拉米夫定或FTC。

已经发现使用该方法，所述L-dC的3′，5′-二缬氨酸酯与母体L-dC相比，生物利用度更高，与其它核苷或核苷类似物联合应用时的相互作用降低。药代动力学研究也显示：所述L-dC的3′，5′-二缬氨酸酯在胃肠道粘膜、血液或肝中通过去酯化作用转化为母体L-dC。

所述L-dC的3′，5′-二缬氨酸酯在口服传递后，明显是通过胃肠道粘膜中的氨基酸转运蛋白功能，从胃肠腔主动转运到血流中。这解释了L-dC的3′，5′-二缬氨酸酯与母体L-dC相比口服生物利用度增加的事实，所述母体L-dC主要通过核苷转运蛋白功能转运。这也解释了L-dC的3′，5′-二缬氨酸酯与通过核苷转运蛋白功能而不是氨基酸转运蛋白功能转运的其它核苷或核苷类似物的摄取竞争降低。由于L-dC的二缬氨酸酯的去酯化作用部分发生在完全吸收之前，单缬氨酸酯继续通过氨基酸转运蛋白功能吸收。因此，仍然获得所需结果，即吸收更好、生物利用度更高以及与其它核苷或核苷类似物摄取进入血流的竞争减少。

I.本发明定义的化合物

在第一个实施方案中，所述2′-脱氧-β-L-核苷3′-前体药物在3′位和/或5′位上包括生物活性可裂解的部分。优选部分是氨基酸酯(如缬氨酰基)和烷基酯(如乙酰基)。因此，本发明具体包括：具有所需嘌呤碱基或嘧啶碱基的3′，5′-L-氨基酸-β-L-2′-脱氧核苷，其中所述母体药物在2.2.15细胞中EC₅₀低于15微摩尔，最好低于10微摩尔；具有所需嘌呤碱基或嘧啶碱基的3′，5′-L-二(烷基或芳基)-β-L-2′-脱氧核苷，其中所述母体药物在2.2.15细胞中EC₅₀低于15微摩尔，最好低于10微摩尔；2′-脱氧-β-L-核苷的3′，5′-二酯的前体药物，其中(i)所述3′-酯是一种氨基酸酯，所述5′-酯是一种烷基酯或芳基酯；(ii)两种酯都是氨基酸酯；(iii)两种酯都独立地是烷基酯或芳基酯；(iv)所述3′-酯独立地是一种烷基酯或芳基酯，所述5′-酯是一种氨基酸酯，其中所述母体药物在2.2.15细胞中EC₅₀低于15微摩尔。

包括在本发明内的3′-前体药物的例子有：2′-脱氧-β-L-胞苷的3′，5′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-胸腺嘧啶的3′，5′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-腺苷的3′，5′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-鸟苷的3′，5′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-5-氟-胞苷的3′，5′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-尿苷的3′，5′-L-缬氨酸酯；2′-脱氧-β-L-胞苷的3′，5′-乙酰酯；2′-脱氧-β-L-胸腺嘧啶的3′，5′-乙酰酯；2′-脱氧-β-L-腺苷的3′，5′-乙酰酯；2′-脱氧-β-L-鸟苷的3′，5′-乙酰酯；2′-脱氧-β-L-5-氟-胞苷的3′，5′-乙酰酯；和2′-脱氧-β-L-(胞苷、5-氟-胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷或胸腺嘧啶)的3′，5′-二酯，其中(i)所述3′-酯是一种氨基酸酯，所述5′-酯是一种烷基酯或芳基酯；(ii)两种酯都是氨基酸酯；(iii)两种酯都独立地是烷基酯或芳基酯；(iv)所述3′-酯是一种烷基酯或芳基酯，所述5′-酯是一种氨基酸酯。

在一个实施方案中，本发明提供下式定义的β-L核苷3′-前体药物或其药学上可接受的盐：

其中

X是O、S、SO₂或CH₂；和

BASE是可任选地被取代的嘌呤或嘧啶碱基。

在优选实施方案中，X是O。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在第一个亚实施方案(subembodiment)中，R²是C(O)-烷基(包括低级烷基)或芳基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第二个亚实施方案中，R²是C(O)-低级烷基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第三个亚实施方案中，R²是C(O)-甲基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第四个亚实施方案中，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第五个亚实施方案中，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，R⁸是异丙基，R¹⁰和R¹¹中至少一个是氢，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第六个亚实施方案中，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，R⁸是氨基酸侧链，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第七个亚实施方案中，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，R⁸是非极性氨基酸侧链，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

可以通过式(I)定义亚实施方案的非限制性实施例，其中

(1)R²是C(O)-甲基，BASE是腺嘌呤。

(2)R²是C(O)-甲基，BASE是保护的腺嘌呤。

(3)R²是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶。

(4)R²是C(O)-甲基，BASE是保护的胞嘧啶。

(5)R²是C(O)-甲基，BASE是胸腺嘧啶。

(6)R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是腺嘌呤。

(7)R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是保护的腺嘌呤。

(8)R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是胞嘧啶。

(9)R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是保护的胞嘧啶。

(10)R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是胸腺嘧啶。

在第八个亚实施方案中，X是O，R²是C(O)-烷基(包括低级烷基)或芳基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第九个亚实施方案中，X是O，R²是C(O)-低级烷基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第十个亚实施方案中，X是O，R²是C(O)-甲基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第十一个亚实施方案中，X是O，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第十二个亚实施方案中，X是O，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，R⁸是异丙基，R¹⁰和R¹¹中至少一个是氢，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第十三个亚实施方案中，X是O，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，R⁸是氨基酸侧链，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第十四个亚实施方案中，X是O，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)；R⁸是非极性氨基酸侧链；R⁵和R⁶中至少一个是氢，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

可以通过式(I)定义亚实施方案的非限制性实施例，其中

(1)X是O，R²是C(O)-甲基，BASE是腺嘌呤。

(2)X是O，R²是C(O)-甲基，BASE是保护的腺嘌呤。

(3)X是O，R²是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶。

(4)X是O，R²是C(O)-甲基，BASE是保护的胞嘧啶。

(5)X是O，R²是C(O)-甲基，BASE是胸腺嘧啶。

(6)X是O，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是腺嘌呤。

(7)X是O，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是保护的腺嘌呤。

(8)X是O，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是胞嘧啶。

(9)X是O，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是保护的胞嘧啶。

(10)X是O，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是胸腺嘧啶。

在第十五个亚实施方案中，X是O，R¹是氢，R²是C(O)-烷基(包括低级烷基)或芳基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第十六个亚实施方案中，X是O，R¹是氢，R²是C(O)-低级烷基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第十七个亚实施方案中，X是O，R¹是氢，R²是C(O)-甲基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第十八个亚实施方案中，X是O，R¹是氢，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第十九个亚实施方案中，X是O，R¹是氢，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，R⁸是异丙基，R¹⁰和R¹¹中至少一个是氢，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第二十个亚实施方案中，X是O，R¹是氢，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，R⁸是氨基酸侧链，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第二十一个亚实施方案中，X是O，R¹是氢，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)；R⁸是非极性氨基酸侧链；R⁵和R⁶中至少一个是氢，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

可以通过式(I)定义亚实施方案的非限制性实施例，其中

(1)X是O，R¹是氢，R²是C(O)-甲基，BASE是腺嘌呤。

(2)X是O，R¹是氢，R²是C(O)-甲基，BASE是保护的腺嘌呤。

(3)X是O，R¹是氢，R²是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶。

(4)X是O，R¹是氢，R²是C(O)-甲基，BASE是保护的胞嘧啶。

(5)X是O，R¹是氢，R²是C(O)-甲基，BASE是胸腺嘧啶。

(6)X是O，R¹是氢，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是腺嘌呤。

(7)X是O，R¹是氢，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是保护的腺嘌呤。

(8)X是O，R¹是氢，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是胞嘧啶。

(9)X是O，R¹是氢，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是保护的胞嘧啶。

(10)X是O，R¹是氢，R²是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是胸腺嘧啶。

在第二十二个亚实施方案中，X是O，R¹和R²独立地是C(O)-烷基(包括低级烷基)或芳基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第二十三个亚实施方案中，X是O，R¹和R²独立地是C(O)-低级烷基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第二十四个亚实施方案中，X是O，R¹和R²独立地是C(O)-甲基，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第二十五个亚实施方案中，X是O，R¹和R²独立地是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第二十六个亚实施方案中，X是O，R¹和R²独立地是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，R⁸是异丙基，R¹⁰和R¹¹中至少一个是氢，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第二十七个亚实施方案中，X是O，R¹和R²独立地是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)，R⁸是氨基酸侧链，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

在第二十八个亚实施方案中，X是O，R¹和R²独立地是C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)；R⁸是非极性氨基酸侧链；R⁵和R⁶中至少一个是氢，BASE是腺嘌呤、保护的腺嘌呤、胞嘧啶、保护的胞嘧啶或胸腺嘧啶。

可以通过式(I)定义亚实施方案的非限制性实施例，其中

(1)X是O，R¹和R²独立地是C(O)-甲基，BASE是腺嘌呤。

(2)X是O，R¹和R²独立地是C(O)-甲基，BASE是保护的腺嘌呤。

(3)X是O，R¹和R²独立地是C(O)-甲基，BASE是胞嘧啶。

(4)X是O，R¹和R²独立地是C(O)-甲基，BASE是保护的胞嘧啶。

(5)X是O，R¹和R²独立地是C(O)-甲基，BASE是胸腺嘧啶。

(6)X是O，R¹和R²独立地是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是腺嘌呤。

(7)X是O，R¹和R²独立地是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是保护的腺嘌呤。

(8)X是O，R¹和R²独立地是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是胞嘧啶。

(9)X是O，R¹和R²独立地是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是保护的胞嘧啶。

(10)X是O，R¹和R²独立地是C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)；R⁸是异丙基，BASE是胸腺嘧啶。

在另一实施方案中，所述β-L核苷3′-前体药物是下式的β-L-2′-脱氧嘌呤或其在药学上可接受的盐：

其中

Y是OR³、NR³R⁴或SR³；和

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

其中

在优选实施方案中，R¹是H。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在一个实施方案中，R³是氢，R⁴是二甲氨基亚甲基。

在另一实施方案中，R³是氢，R⁴是乙酰基。

在另一实施方案中，R³是氢，R⁴是L-缬氨酰基。

在另一具体的实施方案中，所述β-L核苷3′-前体药物是下式的β-L-2′-脱氧鸟苷或其在药学上可接受的盐：

其中

在优选实施方案中，R¹是H。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在一个实施方案中，R⁵是氢，R⁶是二甲氨基亚甲基。

在另一实施方案中，R⁵是氢，R⁶是乙酰基。

在另一实施方案中，R⁵是氢，R⁶是L-缬氨酰基。

或其药学上可接受的盐，其中

在优选实施方案中，R¹是H。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

其中

Y是OR³、NR³R⁴或SR³；和

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

其中

在优选实施方案中，R¹是H。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在一个实施方案中，R³是氢，R⁴是二甲氨基亚甲基。

在另一实施方案中，R³是氢，R⁴是乙酰基。

在另一实施方案中，R³是氢，R⁴是L-缬氨酰基。

其中

在优选实施方案中，R¹是H。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

在另一实施方案中，所述β-L核苷3′-前体药物是下式的β-L-胸苷或其药学上可接受的盐：

其中

在优选实施方案中，R¹是H。

R⁹是氢、烷基(包括低级烷基)或芳基；和

II.术语的定义和使用

本文所用术语烷基除特别指出外，指C₁到C₁₀的饱和链状、分支或环状伯、仲、叔烃，并且具体包括甲基、三氟甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、环己基甲基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。该术语包括被取代或未被取代的烷基。可以取代上述烷基基团的部分选自：羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸根、膦酸、磷酸根或膦酸根，所述部分根据需要或者不保护，或者受到保护，这是本领域内技术人员已知的，例如在Greene等， Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，第二版，1991中教导，该文献特此通过引用结合到本文中。

本文所用术语低级烷基除特别指出外，指C₁到C₄饱和直链烷基基团、支链烷基基团，或者如果合适的话，指环状烷基基团(例如环丙基)，其中包括被取代和未被取代的形式。在本说明书中，除特别指出外，当烷基是合适部分时，优选低级烷基。相似地，当烷基或低级烷基是合适部分时，优选未取代的烷基或低级烷基。

本文所用术语“受到保护的”除特别定义外，指加到氧原子、氮原子或磷原子上，防止其进一步发生反应或用于其它用途的基团。许多氧和氮的保护基团是有机合成领域内技术人员已知的。保护基团非限制性的实施例在Greene等， Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，第二版，1991中教导。

本文所用术语芳基除特别指出外，指苯基、联苯基或萘基，优选指苯基。该术语包括被取代和未被取代的部分。芳基基团可以被选自以下的一种或多种部分取代：羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸根、膦酸、磷酸根或膦酸根，所述部分根据需要或者不保护，或者受到保护，这是本领域内技术人员已知的，例如在Greene等， Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，第二版，1991中教导，该文献特此通过引用结合到本文中。

术语嘌呤碱基或嘧啶碱基包括但不限于：腺嘌呤、N⁶-烷基嘌呤、N⁶-酰基嘌呤(其中酰基是C(O)(烷基、芳基、烷芳基或芳烷基))、N⁶-苄基嘌呤、N⁶-卤嘌呤、N⁶-乙烯基嘌呤、N⁶-炔属嘌呤、N⁶-酰基嘌呤、N⁶-羟基烷基嘌呤、N⁶-硫代烷基嘌呤、N²-烷基嘌呤、N²-烷基-6-硫代嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、6-氮杂嘧啶(包括6-氮杂胞嘧啶)、2-和/或4-巯基嘧啶、尿嘧啶、5-卤尿嘧啶(包括5-氟尿嘧啶)、C⁵-烷基嘧啶、C⁵-苄基嘧啶、C⁵-卤嘧啶、C⁵-乙烯基嘧啶、C⁵-炔属嘧啶、C⁵-酰基嘧啶、C⁵-羟基烷基嘌呤、C⁵-酰氨基嘧啶、C⁵-氰基嘧啶、C⁵-硝基嘧啶、C⁵-氨基嘧啶、N²-烷基嘌呤、N²-烷基-6-硫代嘌呤、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿苷基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基和吡唑并嘧啶基。嘌呤碱基包括但不限于鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和6-氯嘌呤。可以根据需要保护所述碱基中的氧官能团和氮官能团。合适的保护基团是本领域内技术人员众所周知的，包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基、烷基基团和酰基基团例如乙酰基和丙酰基、甲基磺酰基和对甲苯磺酰基。

术语酰基指羧酸酯，其中所述酯基团的非羧基部分选自：直链、支链环状烷基或低级烷基、烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)、芳烷基(包括苄基)、芳氧基烷基(例如苯氧基甲基)、芳基(包括可任选地被卤素、C₁到C₄烷基或C₁到C₄烷氧基取代的苯基)、磺酸酯(例如烷基磺酰基或芳烷基磺酰基，包括甲磺酰基)、一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯、三苯甲基或单甲氧基三苯甲基、取代苄基、三烷基甲硅烷基(如二甲基叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。所述酯中的芳基基团最好包括一个苯基基团。术语“低级酰基”指其中非羧基部分是低级烷基的酰基基团。

术语氨基酸包括天然存在的和合成的α、β、γ或δ氨基酸，包括但不限于在蛋白质中出现的氨基酸，即甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。在优选实施方案中，所述氨基酸是L-构型。或者，所述氨基酸可以是下列基团的衍生物：丙氨酰基、缬氨酰基、亮氨酰基、异亮氨酰基、脯氨酰基、苯丙氨酰基、色氨酰基、甲硫氨酰基、甘氨酰基、丝氨酰基、苏氨酰基、半胱氨酰基、酪氨酰基、天冬酰胺酰基(asparaginyl)、谷氨酰胺酰基、天冬氨酰基、谷氨酰基、赖氨酰基、精氨酰基、组氨酰基、β-丙氨酰基、β-缬氨酰基、β-亮氨酰基、β-异亮氨酰基、β-脯氨酰基、β-苯丙氨酰基、β-色氨酰基、β-甲硫氨酰基、β-甘氨酰基、β-丝氨酰基、β-苏氨酰基、β-半胱氨酰基、β-酪氨酰基、β-天冬酰胺酰基、β-谷氨酰胺酰基、β-天冬氨酰基、β-谷氨酰基、β-赖氨酰基、β-精氨酰基或β-组氨酰基。

本文所用术语杂芳基或杂芳香基指在芳香环中包括至少一个硫、氧、氮或磷的芳族基团。术语杂环指在环中有至少一个杂原子的非芳香族环状基团，所述杂原子例如氧、硫、氮或磷。杂芳基和杂环状基的非限制性例子包括：呋喃基(furyl，furanyl)、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、异噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基(benzothiophenyl)、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、唑基、噻唑基、异噻唑基、1，2，4-噻二唑基、异唑基、吡咯基、喹唑啉基、噌啉基、2，3-二氮杂萘基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、噻吩、呋喃、吡咯、异吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、唑、异唑、噻唑、异噻唑、嘧啶或哒嗪和蝶啶基、氮丙啶、噻唑、异噻唑、1，2，3-氧杂二唑、噻嗪、嘧啶、吡嗪、哌嗪、吡咯烷、oxazirane、吩嗪、吩噻嗪、吗啉基、吡唑基、哒嗪基、吡嗪基、喹喔啉基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、蝶啶基、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿苷基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、腺嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-苄基嘌呤、N6-卤嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-炔属嘌呤、N6-酰基嘌呤、N6-羟基烷基嘌呤、N6-硫代烷基嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、6-氮杂嘧啶、2-巯基嘧啶、尿嘧啶、N5-烷基嘧啶、N5-苄基嘧啶、N5-卤嘧啶、N5-乙烯基嘧啶、N5-炔属嘧啶、N5-酰基嘧啶、N5-羟基烷基嘌呤和N6-硫代烷基嘌呤和异唑基。所述杂芳族部分和杂环状部分可任选地如上述关于芳基中被取代，包括被选自以下的一种或多种取代基取代：卤素、卤烷基、烷基、烷氧基、羟基、羧基衍生物、酰氨基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基。可以根据需要部分或全部氢化所述杂芳族部分。作为非限制性的实施例，可以使用二氢吡啶取代吡啶。可以根据需要保护所述杂芳基基团上的氧官能团和氮官能团。合适的保护基团是本领域内技术人员众所周知的，包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基或取代三苯甲基、烷基基团、酰基基团例如乙酰基和丙酰基、甲磺酰基和对甲苯磺酰基。

本文中术语“基本不含对映体”或“基本上不存在对映体”指这样的核苷组合物：所述核苷组合物包括至少95％到98％(重量比)，更优选99％到100％(重量比)该核苷的指定对映体。在优选实施方案中，在本发明的方法和化合物中，所述化合物基本不含对映体。

相似地，术语“分离的”指这样的核苷组合物：所述核苷组合物包含至少85％或90％(重量比)、优选95％到98％(重量比)、甚至更优选99％到100％(重量比)所述核苷，其余部分包含其它化学物质或对映体。

本文使用术语“独立地”指独立应用的可变基团随不同应用而独立变化。因此，在化合物如R″XYR″中，其中R″“独立地是碳或氮”，则两个R″可以都是碳，两个R″可以都是氮，或者一个R″是碳，另一个R″是氮。

本文所用术语宿主指其中病毒可以复制的单细胞或多细胞生物，包括细胞系和动物，最好是人类。或者，所述宿主可以携带部分乙型肝炎病毒基因组，本发明的化合物可以改变所述乙型肝炎基因组的复制或功能。术语宿主具体地指受感染的细胞、受到全部或部分HBV基因组转染的细胞以及动物(尤其是灵长类动物(包括黑猩猩)和人类)。在本发明的大多数动物应用中，所述宿主是人类患者。然而，本发明清楚地预期在某些适应证下的兽医应用(如黑猩猩)。

术语“药学上可接受的盐”和“药学上可接受的复合物”在本说明书中通篇使用，用于描述核苷化合物任何药学上可接受的形式，当将所述形式的核苷化合物给予患者时，提供所述核苷化合物并呈现最小不希望的毒性效应(如果有的话)。药学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机或有机碱和酸衍生的盐。所述盐的非限制性实施例是(a)与无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等)形成的酸加成盐和与有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、丹宁酸、棕榈酸、褐藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸和聚半乳糖醛酸)形成的盐；(b)与阳离子形成的碱加成盐，例如与碱金属形成的盐和与碱土金属(钠、钾、锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等)形成的盐，或者与有机阳离子(由N，N-二苄基亚乙基-二胺、铵或乙二胺形成)形成的碱加成盐；或者(c)(a)和(b)的组合；例如丹宁酸锌盐等。

药学上可接受的前体药物指在宿主内代谢(例如水解或氧化)形成本发明化合物的化合物。前体药物的典型例子包括在活性化合物的官能部分具有生物易分解的保护基团的化合物。前体药物包括可以氧化、还原、氨化、脱氨、羟化、脱羟基、水解、脱水、烷基化、脱烷基、酰化、脱酰、磷酸化、脱磷酸化而产生活性化合物的化合物。本发明的化合物具有对抗HBV的抗病毒活性，或者代谢成为表现所述活性的化合物。

III.核苷酸盐或前体药物制剂

在化合物具有足够碱性或足够酸性以形成稳定无毒的酸盐或碱盐的情况下，将所述化合物作为药学上可接受的盐给予是合适的。药学上可接受的盐的例子有与酸形成的有机酸加成盐，形成生理可接受的阴离子，例如甲苯磺酸根、甲磺酸根、乙酸根、柠檬酸根、丙二酸根、酒石酸根、琥珀酸根、苯甲酸根、抗坏血酸根、α-酮戊二酸根和α-甘油磷酸根。也可以形成合适的无机盐，包括硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。

可以使用本领域内众所周知的标准方法获得药学上可接受的盐，例如使足够碱性的化合物例如胺与提供生理可接受的阴离子的合适酸反应。也可以制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)盐或碱土金属(例如钙)盐。

本文所述的任何核苷可以作为核苷酸前体药物给予，以增强活性、生物利用度、稳定性或以其它方式改变所述核苷的特性。已知多种核苷酸前体药物配体。一般地说，对所述核苷一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯的烷基化、酰化或其它亲脂性修饰将增加所述核苷酸的稳定性。可以取代磷酸酯部分上一个或多个氢的取代基团的例子有烷基、芳基、类固醇、碳水化合物(包括糖)、1，2-二酰基甘油和醇类。R.Jones和N.Bischofberger，Antiviral Research，27(1995)1-17中描述许多这样的取代基团。所述取代基团的任一种可以与所公开的核苷联合使用，获得所需效应。

也可以以5′-磷酸醚脂(5′-phosphoether lipid)或5′-醚脂的形式提供所述活性β-L-3′-前体药物，如在下面参考文献中公开，所述参考文献通过引用结合到本文中：Kucera，L.S.，N.Iyer，E.Leake，A.Raben，Modest E.K.，D.L.W.和C.Piantadosi.1990的“抑制传染性HIV-1产生并诱导缺陷型病毒形成的新型膜相互作用活性醚脂类似物”AIDSRes.Hum.Retro Viruses.6：491-501；Piantadosi，C.，J.Marasco C.J.，S.L.Morris-Natschke，K.L.Meyer，F.Gumus，J.R.Surles，K.S.Ishaq，L.S.Kucera，N.Iyer，C.A.Wallen，S.Piantadosi和E.J.Modest.1991的“合成新型醚脂核苷偶联物并评估其抗HIV活性”J.Med.Chem.34：1408.1414；Hosteller，K.Y.，D.D.Richman，D.A.Carson，L.M.Stuhmiller，G.M.T.van Wijk和H.van den Bosch.1992的“通过3′-脱氧胸苷的一种脂类前体药物3′-脱氧胸苷二磷酸二肉豆蔻酰甘油极大增强在CEM和HT4-6C细胞中对1型人类免疫缺陷病毒复制的抑制”Antimicrob.Agents Chemother.36：2025.2029；Hosetler，K.Y.，L.M.Stuhmiller，H.B.Lenting，H.van den Bosch和D.D.Richman，1990的“叠氮胸苷和其它抗病毒核苷的磷脂类似物的合成和抗逆转录病毒活性”J.Biol.Chem.265：61127。

公开可以共价加入所述核苷(最好在所述核苷或亲脂性制剂的5′-OH位加入)的合适亲脂性取代基的美国专利的非限制性例子包括：美国专利序号5,149,794(1992年9月22日，Yatvin等)、5,194,654(1993年3月16日，Hostetler等)、5,223,263(1993年6月29日，Hostetler等)、5,256,641(1993年10月26日，Yatvin等)、5,411,947(1995年5月2日，Hostetler等)、5,463,092(1995年10月31日，Hostetler等)、5,543,389(1996年8月6日，Yatvin等)、5,543,390(1996年8月6日，Yatvin等)、5,543,391(1996年8月6日，Yatvin等)和5,554,728(1996年9月10日；Basava等)，所有这些专利特此通过引用结合到本文中。公开能够连接到本发明的核苷上的亲脂性取代基或亲脂性制剂的外国发明专利申请包括：WO 89/02733、WO 90/00555、WO 91/16920、WO 91/18914、WO 93/00910、WO 94/26273、WO 96/15132、EP 0350287、EP 93917054.4和WO 91/19721。

可以给予所述3′-前体药物的任何衍生物，所述衍生物在给予受体时，能够直接或间接地提供所述母体化合物的3′-前体药物，或者所述衍生物本身表现所述活性。非限制性的例子有所述活性化合物的药学上可接受的盐(或者称为“生理上可接受的盐”)和N⁴嘧啶或N²和/或N⁶-嘌呤烷基化衍生物(尤其是与二甲氨基亚甲基形成的衍生物)或酰化衍生物(尤其是与乙酰基或氨基乙酰基形成的衍生物)。在一个非限制性的实施方案中，所述酰基基团是羧酸酯，其中所述酯基团的非羰基部分选自：直链、支链环状烷基或低级烷基、烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)、芳烷基(包括苄基)、芳氧基烷基(例如苯氧基甲基)、芳基(包括可任选地被卤素、C₁到C₄烷基或C₁到C₄烷氧基取代的苯基)、磺酸酯(例如烷基磺酰基或芳烷基磺酰基，包括甲基磺酰基)、磷酸酯(包括但不限于一磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯)、三苯甲基或单甲氧基三苯甲基、取代苄基、三烷基甲硅烷基(如二甲基-5-丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。所述酯中的芳基基团可任选地包括一个苯基基团。

对所述3′前体药物或母体化合物的修饰，特别是在N⁴嘧啶基或N²和/或N⁶嘌呤位上的修饰能够影响所述活性化合物的生物利用度和代谢速率，由此提供对所述活性化合物传递的控制。此外，所述修饰能够影响所述化合物的抗病毒活性，在某些情况下增加所述活性，使之超过母体化合物。这可以容易地如下评价：根据本文所述方法或本领域内技术人员已知的其它方法制备所述衍生物并测试其抗病毒活性。

IV.立体化学

由于核苷中糖(本文中一般指糖部分)的1′和4′碳原子是手性的，因此对于糖环系统而言，它们的非氢取代基(分别是CH₂OR和嘧啶碱基或嘌呤碱基)或可以是顺式(在同一侧)或者反式(在另一侧)。因此下面构型代表所述四种旋光异构体(当糖部分的取向在水平平面上而使得C1′和C4′-原子之间的“第一”氧原子在后面)时：“β”即“顺式”表示(两个基团在“上面”，该构型对应于天然存在核苷的构型，即D构型)，或者，“β”即顺式表示(两个基团在“下面”，该构型对应于非天然存在核苷的构型，即L构型)，而“α”即“反式”表示(C2取代基在“上面”，C5取代基在“下面”)，或者“α”即反式表示(C2取代基在“下面”，C5取代基在“上面”)。

本发明的核苷属于β-L-构型。在优选实施方案中，基本以单一异构体的形式(即至少约95％是所指定的立体构型)给予所述2′-脱氧-β-L-核苷。

V.联合治疗和交替治疗

在联合治疗中，同时给予两种或多种药物的有效剂量，而在交替治疗中，每种药物的有效剂量连续给予。剂量将取决于药物的吸收、失活和排泄速率以及本领域内技术人员已知的其它因素。需要注意的是剂量值也将随需要缓解的疾病的严重程度而变化。另外需要理解：对于任一具体受治疗者，特定剂量方案和时间表应当根据个体需要和给予或监督所述组合物给予的人员的专业判断而随时间进行调整。

例如，在本文所述任一实施方案中，假如本发明β-L-2′-脱氧核苷的3′-前体药物与第二种核苷或磷酸化后成为活性形式的非核苷反转录酶抑制剂联合或交替给予，那么在一个实施方案中，第二种化合物是一种能够由酶磷酸化的化合物，所述酶不同于在体内磷酸化本发明选定β-L-2′-核苷的酶。激酶的例子有胸苷激酶、胞嘧啶激酶、鸟苷激酶、腺苷激酶、脱氧胞苷激酶、5′-核苷酸酶和脱氧鸟苷激酶。

因此，在一个实施方案中，本发明提供本发明两种或多种核苷前体药物的组合，所述核苷最好由不同酶磷酸化、或通过不同生物途径起作用。在另一实施方案中，本发明提供至少一种前体药物与表现抗乙型肝炎活性的核苷联合应用或交替应用，所述核苷包括但不限于本文所定义任一种前体药物的母体药物，即2′-脱氧-β-L-核苷，包括2′-脱氧-β-L-胞苷、2′-脱氧-β-L-胸腺嘧啶、2′-脱氧-β-L-腺苷、2′-脱氧-β-L-鸟嘌呤、2′-脱氧-β-L-5-氟胞苷、2′，3′-二脱氧-3′-硫代胞苷、2′，3′-二脱氧-3′-硫代-5-氟胞苷。或者，本发明的化合物也可以与任何其它已知抗乙型肝炎病毒剂联合给予或交替给予，所述抗乙型肝炎病毒剂如：entecivir、顺-2-羟甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊(己)烷(oxathiolane)，最好基本采用(-)-旋光异构体形式(“FTC”，见WO 92/14743)；顺-2-羟甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫杂环戊(己)烷(3TC)的(-)-对映体；美国专利序号5,444,063和5,684,010所述的β-D-1，3-二氧戊环嘌呤核苷；β-D-二氧戊环核苷例如β-D-二氧戊环基-鸟嘌呤(DXG)、β-D二氧戊环基-2，6-二氨基嘌呤(DAPD)和β-D-二氧戊环基-6-氯嘌呤(ACP)、L-FDDC(5-氟-3′-硫代-2′，3′-二脱氧胞苷)、3′-氟-修饰β-2′-脱氧核苷5′-三磷酸的L-对映体、carbovir、干扰素、喷昔洛韦和法昔洛韦、L-FMAU、法昔洛韦、喷昔洛韦、BMS-200475、bis pom PMEA(adefovir，dipivoxil)；lobucavir、ganciclovir或利巴韦林；或在2.2.15细胞中EC₅₀低于15微摩尔的任何其它化合物；或者它们的前体药物或药学上可接受的盐。

也可以采用联合疗法和交替疗法以对付抗药性。人们已经认识到使用一种抗病毒剂长期治疗后可能出现耐药病毒株。耐药性的出现在大多数情况下是由于编码病毒复制所用酶的基因突变引起。抗乙型肝炎感染药物的功效可以通过将所述化合物与第二种、可能还有第三种抗病毒化合物联合或交替给予而延长、增强或恢复，所述第二种和第三种化合物诱导的突变不同于主药(principle drug)所导致的突变。或者，可以通过所述联合疗法或交替疗法改变所述药物的药代动力学、生物分布或其它参数。一般地说，联合疗法优于交替疗法，因为联合疗法诱导对病毒的多重同时胁迫。

在另一实施方案中，所述前体药物与免疫调节剂或其它药学可接受的活性病毒复制调节剂联合或交替给予，所述免疫调节剂或病毒复制调节剂包括生物物质例如蛋白质、肽、寡核苷酸或γ球蛋白，包括但不限于干扰素、白介素或针对表达或调节乙型肝炎复制的基因的反义寡核苷酸。

可以使用为患者提供治疗的任何交替方法。交替模式的非限制性实施例包括给予有效量的一种药物1-6周，然后给予有效量的第二种抗HBV剂1-6周。交替时间表可以包括没有治疗的时期。联合治疗一般包括同时给予两种或多种抗HBV剂的有效比例剂量。

考虑到HBV通常出现在抗HIV抗体或HIV抗原阳性或已经暴露于HIV的患者体内这样一个事实，本文公开的活性抗HBV化合物或它们的衍生物或前体药物可以在合适情况下与抗HIV药物联合或交替给予。

在一个实施方案中，用于治疗HIV的第二种抗病毒剂可以是反转录酶抑制剂(“RTI”)，所述抑制剂可以或者是合成核苷(“NRTI”)，或者是非核苷化合物(“NNRTI”)。在可替代的实施方案中，在HIV的情况下，所述第二种(或第三种)抗病毒剂可以是蛋白酶抑制剂。在另一实施方案中，所述第二种(或第三种)化合物可以是焦磷酸盐(酯)类似物或融合结合抑制剂。在Schinazi等，与抗药性有关的反转录病毒基因中的突变，International Antiviral News，第1卷(4)，InternationalMedical Press 1996中有针对多种抗病毒化合物在体外和体内收集的抗性数据汇编表。

所述活性抗HBV剂也可以与用于治疗继发性感染的抗生素、其它抗病毒化合物、抗真菌化合物或其它药剂联合给予。

VI.药用组合物

患有任何本文所述疾病(包括乙型肝炎)的人可以如下治疗：在药学可接受的载体或稀释剂存在下，给予所述患者有效量的本发明β-L-2′-脱氧-核苷的3′-前体药物、或其药学上可接受的盐。可以通过任何合适途径给予液体或固体形式的所述活性物质，例如口服给药、胃肠外给药、静脉内给药、皮内给药、皮下给药或局部给药。

将所述活性化合物包括在药学可接受的载体或稀释剂中，其量足以传递给患者治疗有效量的化合物以在体内抑制病毒复制，同时在受治疗患者体内不引起严重毒性效应。“抑制量”指根据例如测定例如本文所述测定测量，足以显示抑制作用的活性成分的量。

所述化合物针对所有上述疾病的优选剂量将在下面范围内：约1到50mg/kg体重/日，优选1到20mg/kg体重/日，更一般是0.1到约100mg/kg接受者体重/日。药学上可接受的前体药物的有效剂量范围可以根据要传递的母体核苷的重量计算。假如所述前体药物本身表现活性，则可以如上使用所述前体药物的重量或通过本领域内技术人员已知的其它方法估计有效剂量。

所述化合物最好以单位任何合适的剂型给予，包括但不限于每单位剂型内含7到3000mg，优选70到1400mg活性成分。通常口服剂量50-1000mg是方便的。

理想状态下，应该给予所述活性成分，使得所述活性成分的峰血浆浓度达到从约0.2到70μM，优选约1.0到10μM。这可以如下完成：例如，静脉内注射所述活性成分的0.1到5％溶液(可任选地在盐水中)，或将所述活性成分以大剂量(bolus)给予。

所述药物组合物中活性化合物的浓度将取决于药物的吸收、失活和排泄速率以及本领域内技术人员已知的其它因素。需要注意的是剂量值也将随需要缓解的疾病的严重程度而变化。另外需要理解：对于任一具体受治疗者，特定剂量方案应当根据个体需要和给予或监督所述组合物给予的人员的专业判断而随时间调整，并且本文所述浓度范围仅是举例，而并不是要限制所要求保护的组合物的范围或实施。所述活性成分可以一次性给予，或者可以分成更小剂量以不同时间间隔给予。

所述活性化合物的优选给药模式是口服。口服组合物一般将包括惰性稀释剂或可食用载体。可以将它们包囊在明胶胶囊中，或者压制成片剂。在口服给予治疗时，所述活性化合物中可以加入赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式应用。可以包括药学上可配伍的结合剂和/或辅助剂物质作为所述组合物的组成部分。

片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含任何下面成分或性质相似的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖、崩解剂，如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或矫味剂，如薄荷油、水杨酸甲酯或橙矫味剂(orange flavoring)。当所述剂型是胶囊剂时，除上述类型的物质外，它还可以包含液体载体如脂肪油。此外，剂量单位型可以包含改变所述剂量单位物理形式的各种其它物质，例如糖、虫胶或其它肠包衣物质。

所述化合物可以作为酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂、咀嚼胶等的成分给予。除所述活性化合物外，糖浆剂可以包含蔗糖作为甜味剂，并包含某些防腐剂、染料和颜料和矫味剂。

所述化合物或其药学上可接受的衍生物或盐也可以与其它不削弱所需作用的活性物质混合，或与补充所需作用的物质混合，所述物质例如抗生素、抗真菌剂、消炎药、蛋白酶抑制剂或其它核苷或非核苷抗病毒剂。用于胃肠外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液可以包括下面成分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。所述胃肠外制剂可以封装在玻璃或塑料安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

假如静脉内给药，则优选载体是生理盐水或磷酸盐缓冲溶液(PBS)。

在优选实施方案中，所述活性化合物与保护所述化合物免受体内快速清除的载体共同制备，例如控释制剂，包括植入物和微囊传递系统。可以使用生物可降解并且生物可配伍的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乙酸。制备所述制剂的方法是本领域内技术人员众所周知的。也可以从AlzaCorporation商业化获得所述物质。

脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也优选作为药学上可接受的载体。可以根据本领域内技术人员众所周知的方法制备这些悬浮液，所述方法例如在美国专利序号4,522,811中描述。例如，可以如下制备脂质体制剂：溶解合适的一种或多种脂质(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、arachadoyl磷脂酰胆碱和胆固醇)于无机溶剂中，然后蒸发，在容器表面留下一薄层干脂质。然后在所述容器中加入所述活性化合物或其一磷酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液。用手旋动所述容器，从容器侧面释放脂物质并分散脂聚集体，由此形成脂质体悬浮液。

VII.制备活性化合物的方法

A.制备β-L-核苷的β-L-3′-衍生物的方法

可以通过本领域内已知的任何方法制备2′-脱氧-核苷的β-L-3′-衍生物，尤其是通过已知方法用酰基部分保护仲醇，即通过酐或借助偶联剂的帮助保护仲醇。作为非限制性的实施例，可以按照下面反应顺序制备所述3′-衍生物。

或者，所述3′-衍生物源自氨酰基部分。该方法的关键原料也是一种合适取代的β-L核苷。所述β-L核苷可以买到，或者可以根据任何已知方法制备，包括使用L-糖部分的标准偶联反应。

这些氨酰基衍生物可以如下制备：首先用合适的氧保护基团如酰基或甲硅烷基保护基团选择性保护5′-羟基，并且可任选地保护杂环状基或杂芳香族基的游离胺。然后，可以将游离3′-羟基偶联到N-保护的α或β氨基酸上。

然后，使用促进偶联的标准偶联试剂将所述β-L-核苷偶联到氨酰基上。偶联试剂非限制性的例子有混合三苯膦或各种类型碳二亚胺的Mitsunobu型试剂(如偶氮二羧酸二烷基酯如偶氮二羧酸二异丙基酯和偶氮二羧酸二乙基酯)。

可以在获得所需结果的任何温度下进行所述偶联反应，所述温度即是适于以可接受的速率进行所述反应而不促进分解或过多副产物的温度。

可以选择能够达到必要温度并能够溶解反应成分的任何反应溶剂。非限制性的例子为任何非质子溶剂，包括但不限于烷基或卤烷基溶剂，如己烷、环己烷、二氯甲烷或二氯乙烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF、二氧杂环己烷、乙腈、乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它们的任何组合。

流程1是从L-脱氧核糖核苷制备β-L-3′-氨酰基-核苷的非限制性实施例。

流程1

B.制备β-L-核苷的β-L-5′-衍生物的方法

可以通过本领域内已知的任何方法制备β-L-核苷的β-L-5′-衍生物，尤其是通过已知方法用酰基部分保护伯醇，即通过酐或借助偶联剂的帮助保护伯醇。作为非限制性的实施例，可以按照下面反应顺序制备所述β-L-5′-衍生物。

在优选的实施方案中，所述5′-衍生物源自氨酰基部分。该方法的关键原料也是一种合适取代的β-L核苷。所述β-L核苷可以买到，或者可以根据任何已知方法制备，包括使用L-糖部分(如脱氧核糖)的标准偶联反应。这些氨酰基衍生物可以如下制备：将氨基酸选择性偶联到β-L-核苷上，最好对所述核苷不施加其它保护。可以使用促进偶联的合适偶联试剂完成所述偶联反应。偶联试剂非限制性的例子有混合三苯膦或各种类型碳二亚胺的Mitsunobu型试剂(如偶氮二羧酸二烷基酯如偶氮二羧酸二异丙基酯和偶氮二羧酸二乙基酯)。

可以选择能够达到必要温度并能够溶解反应成分的任何反应溶剂。非限制性的例子有任何非质子溶剂，包括但不限于烷基或卤烷基溶剂如己烷、环己烷、二氯甲烷或二氯乙烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF、二氧杂环己烷、乙腈、乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它们的任何组合。

流程2是从L-脱氧核糖核苷制备β-L-5′-氨酰基-核苷的非限制性实施例。

流程2

C.制备β-L-核苷的β-L-3′，5′-双-O-衍生物的方法

可以通过本领域内已知的任何方法制备β-L-核苷的β-L-3′，5′-双-O-衍生物，尤其是通过已知方法用酰基部分保护伯醇和仲醇，即通过酐或借助偶联剂的帮助保护伯醇和仲醇。作为非限制性的实施例，可以按照下面反应顺序制备所述3′，5′-双-O-衍生物：

在优选实施方案中，所述3′，5′-双-O-衍生物源自氨酰基部分。该方法的关键原料也是一种合适取代的β-L核苷。所述β-L核苷的β-L-3′，5′-双-O-衍生物可以买到，或者可以根据任何已知方法制备，包括使用L-糖部分(如脱氧核糖)的标准偶联反应。然后，可以将游离3′-和5′-羟基偶联到N-保护的α或β氨基酸上。可以使用促进偶联的合适偶联剂完成所述偶联反应。偶联试剂非限制性的例子有混合三苯膦或各种类型碳二亚胺的Mitsunobu型试剂(如偶氮二羧酸二烷基酯如偶氮二羧酸二异丙基酯和偶氮二羧酸二乙基酯)。

流程3是从L-脱氧核糖核苷制备β-L-3′，5′-二-氨酰基-核苷的非限制性实施例。

流程3

D.延长氨酰基部分的可选方法

可以通过使3′和5′-羟基与合适的衍生物(例如酰基，尤其是氨酰基)反应，制备标题化合物。假如用氨酰基部分衍生所述核苷，那么需要进一步将游离胺偶联到N-保护的α或β氨基酸上。采用促进偶联反应的适合的偶联试剂可以完成偶联反应。偶联试剂非限制性的例子有混合三苯膦或各种类型碳二亚胺的Mitsunobu型试剂(如偶氮二羧酸二烷基酯如偶氮二羧酸二异丙基酯和偶氮二羧酸二乙基酯)。

E.衍生杂芳香族碱或杂环状碱的可选方法

可以通过可任选地保护杂环状或杂芳香族碱(例如N⁴-胞嘧啶、N⁶-腺嘌呤或N²-鸟嘌呤)中的任何游离氨基，制备标题化合物。例如，可以通过如下一般方法用酰基部分或二烷基氨基亚甲基部分保护胺。

可以在获得所需结果的任何温度下进行所述保护反应，所述温度即是适于以可接受的速率进行所述反应而不促进分解或过多副产物的温度。

然后，可以将游离3′-羟基偶联到N-保护的α或β氨基酸上。可以使用促进偶联的合适偶联剂完成所述偶联反应。偶联试剂非限制性的例子有混合三苯膦或各种类型碳二亚胺的Mitsunobu型试剂(如偶氮二羧酸二烷基酯如偶氮二羧酸二异丙基酯和偶氮二羧酸二乙基酯)。

在可替代的实施方案中，可以从氨酰基部分衍生所述N⁴-或N⁶-酰基衍生物，可以按照下面反应顺序制备所述N⁴-或N⁶-酰基衍生物：可任选地保护游离羟基，然后与合适保护的氨基酯进行缩合反应，随后除去所述羟基保护基团(如果需要)。

实施例

实施例1：⁴N-mMTr-2′-脱氧-β-L-胞苷( 1，图1)

在无水吡啶(44ml)中溶解β-L-dC(1g；4.40mmol)。用三甲基甲硅烷基基团(TMSCl，3.34ml，26.4mmol)短暂保护后，加入mMTrCl(3.38mg，11mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，540mg，4.40mmol)，所述反应混合物在室温搅拌3天{A.Nyilas；C.Glemarec；J.Chattopadhyaya；Tetrahedron Lett.1990， 46，2149-2164}。用碳酸氢钠萃取后，有机层用水洗涤，随后蒸发并用二氧杂环己烷(40mL)溶解。逐滴加入氨水(8.5ml)，所述反应混合物搅拌过夜。蒸发所有挥发性物质后，固体残余物在硅胶柱上纯化{洗脱剂：CH₂Cl₂中MeOH(0-10％)的阶式梯度}，产生泡沫状的所需化合物 1(1.02g，46.5％)。¹H NMR(DMSO-d₆)δppm 8.39(br s，1H，NH，D₂O可交换)，7.70(d，1H，H-6，J＝7.3Hz)，7.4-6.8(m，14H，(C₆H₅)₂C(C₆H₄)OCH₃)，6.23(d，1H，H-5，J＝7.3Hz)，6.02(t，1H，H-1′，J＝6.5Hz)，5.16(d，1H，OH-3′，J＝3.8Hz，D₂O可交换)，4.9(br s，1H，OH-5′，D₂O可交换)，4.1(m，1H，H-3′)，3.7(m，4H，H-4′，OCH₃)，3.5(m，2H，H-5′，H-5″)，2.1-1.8(2m，2H，H-2′，H-2″)；FAB＜0，(GT)m/e 498(M-H)^-，382(B)^-；226(M-mMTr)^-；FAB＞0(GT)500(M+H)⁺，273(mMTr)⁺；UV(EtOH 95)λ_max＝279nm；λ_min＝250nm。

实施例2：⁴N-mMTr-2′-脱氧-β-L胞苷的5′-L-N-(叔丁氧基羰基)缬氨酸酯( 2，图1)

将化合物 1(1g，2.0mmol)在无水DMF(34ml)中的溶液中顺序加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，37mg，0.3mmol)、N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(Boc-Val-OH，587mg，2.7mmol)和N，N-二环己基碳二亚胺(DCC，660mg，3.2mmol){L.M.Beauchamp；G.F.Orr；P.De Miranda；T.Burnette；T.A.Krenitsky；Antiviral Chem.Chemother.1992， 3，157-164}。所述溶液在室温搅拌。40小时后，在所述反应混合中再加入DMAP(37mg，0.3mmol)、Boc-Val-OH(587mg，2.7mmol)和DDC(660mg，3.2mmol)，然后在室温搅拌40小时。过滤所述混合物，减压从滤液中除去DMF，残余物在硅胶柱上色谱分离{洗脱剂：CH₂Cl₂中MeOH(0-10％)的阶式梯度}，产生泡沫状的所需化合物 2(515mg，37％)。¹H NMR(DMSO-d₆)δppm 8.44(br s，1H，NH，D₂O可交换)，7.7-6.8(m，15H，H-6和(C₆H₅)₂C(C₆H₄)OCH₃)，6.26(d，1H，H-5，J＝7.3Hz)，6.06(t，1H，H-1′，J＝6.6Hz)，5.7(bs，1H，OH-3′，D₂O可交换)，4.2-4.0(m，3H，H-3′，H-4′和CH)，3.8-3.9(m，2H，H-5′，H-5″)，3.7(s，3H，OCH₃)，2.0-1.9(m，3H，H-2′，H-2″，CH)，1.36(s，9H，(CH₃)₃C)，0.86(m，6H，(CH₃)₂CH)；FAB＜0，(GT)m/e 1395(2M-H)^-，697(M-H)^-，425(M-mMTr)^-，382(B)^-，216(BocVal-H)^-；FAB＞0(GT)384(B+2H)⁺，273(mMTr)⁺；57(CH₃)₃C)⁺；UV(EtOH 95)λ_max＝279nm；λ_min＝249nm。

实施例3：2′-脱氧-β-L-胞苷盐酸盐的5′-L缬氨酸酯( 3，图1)

将化合物 2(500mg，0.715mmol)溶解于三氟乙酸在CH₂Cl₂中的20％溶液(25ml)中，加入三异丙基硅烷(1.47ml，71.5mmol)。所述反应混合物在室温搅拌1小时，然后缬氨酸酯在Et₂O中作为三氟乙酸盐沉淀。所述沉淀与水几次共蒸发后，用水(2ml)溶解，用HCl在二氧杂环己烷中的饱和溶液(20ml)处理，然后减压蒸发。所述处理重复3次，所需化合物 3最终为盐酸盐在醚(207mg，73％)中沉淀。¹HNMR(DMSO-d₆)δppm 9.7(br s，1H，1/2NH₂，D₂O可交换)，8.6(br s，4H，1/2NH₂，NH₃，D₂O可交换)，7.98(d，1H，H-6，J＝7.8Hz)，6.17(d，1H，H-5，J＝7.8Hz)，6.11(pt，1H，H-1′)，5.5(bs，＜1H，OH-3′，D₂O可交换)，4.4(m，2H，H-5′，H-5″)，4.3(m，1H，H-3′)，4.2-4.0(m，2H，H-4′，CH)，3.8-3.9，3.7(s，3H，OCH₃)，2.3-2.1(m，3H，H-2′，H-2″，CH)，0.94(dd，6H，(CH₃)₂CH，J＝3.7和6.6Hz)；FAB＜0，(GT)m/e 361(M+Cl)^-，325(M-H)^-，116(Val-H)^-，110(B)^-，216(BocVal-H)^-；FAB＞0(GT)653(2M+H)⁺，327(M+H)⁺；112(B+2H)⁺；)⁺；{α}_D ²⁰-28.57(c＝0.49，在DMSO中)；UV(EtOH 95)λ_max＝272nm(ε8700)；λ_min＝255nm(ε7600)；HPLC rt＝8.37分钟(在20mM三乙基乙酸铵缓冲液中CH₃N从0到50％的梯度，运行30分钟，流速1ml/分钟)。

实施例4：N⁴-乙酰基-2′-脱氧-β-L-胞苷( 4，图2)

在核苷β-L-dC(415mg，1.83mmol)在N，N-二乙基甲酰胺(9.2ml)的悬浮液中加入乙酸酐(207μl，2.20mmol)，所述混合物在室温搅拌24小时[V.Bhat；B.G.Ugarkar；V.A.Sayeed，K.Grimm；N.Kosora；P.A.Domenico；E.Stocker，Nucleosides & Nucleotides，1989， 8(2)，179-183]。减压除去DMF后，所得残余物通过硅胶柱色谱纯化[洗脱剂：CH₂Cl₂中的15％MeOH]，得所需化合物(310mg，63％)，然后用乙醇结晶；rap 128-170℃；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm 10.86(s，1H，NH，D₂O可交换)，8.31(d，1H，H-6，J＝7.5Hz)，7.18(d，1H，H-5，J＝7.5Hz)，6.09(t，1H，H-1′，J＝6.3Hz)，5.25(d，1H，OH-3′，D₂O可交换，J＝4.2Hz)，5.03(t，1H，OH-5′，D₂O可交换，J＝5.0Hz)，4.1-4.2(m，1H，H-3′)，3.8(m，1H，H-4′)，3.4-3.6(m，2H，2H，H-5′，H-5″)，2.2-2.3(m，1H，H-2′)，2.08(s，3H，CH₃)，2.0-1.9(m，1H，H-2″)；FAB＜0，(GT)m/e 806(3M-H)^-，527(2M-H)^-，360(M+G-H)^-，268(M-H)^-，152(B)^-；FAB＞0(GT)808(3M+H)⁺，539(2M+H)⁺，362(M+G+H)⁺，270(M+H)⁺，154(B+2H)⁺，117(S)⁺；UV(H₂O)λ_max＝297nm(ε8300)；λ_min＝270nm(ε3500)；λ_max＝245nm(ε14400)；λ_min＝226nm(ε5800)；{α}_D ²⁰-81.31(c＝1.07，在DMSO中)。

实施例5：N⁴-[(二甲氨基)亚甲基]-2′-脱氧-β-L-胞苷( 5，图3)

标题化合物按照公开的开发用于制备对应D-对映体的方法制备[S.G.Kerr和T.I.Kalman，J.Pharm.Sci.1994， 83，582-586]。用二乙基甲酰胺缩二甲醇(dimethylformamide dimethylacetal)(2.8ml，21.08mmol)处理L-dC(500mg，2.20mmol)在DMF(4.8ml)中的溶液，然后在室温搅拌过夜。所述溶液减压蒸发，然后与乙醇共蒸发。从乙醇/乙醚中结晶，得到为淡黄色结晶的标题化合物(501.2mg，81％)。mp174-176℃(D-对映体的lit.：188-190℃)；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm8.60(s，1H，N＝CH)，8.00(d，1H，H-6)，6.15(t，J＝6.6Hz，1H，H-1′)，5.96(d，J＝7.2Hz，1H，H-5)，5.22(d，J＝4.2Hz，1H，OH-3′)，5.01(t，J＝5.2Hz，1H，OH-5′)，4.20(m，1H，H-4′)，3.80(m，1H，H-3′)，3.56(m，2H，2H，H-5′和H-5″)，3.15和3.02(2s，3H和3H，N(CH₃)₂)，2.22-1.90(2m，1H和1H，H-2′和H-2″)；FAB＞0，(GT)847(3M+H)⁺，565(2M+H)⁺，283(M+H)；FAB＜0(GT)m/z 599(2M+Cl)^-，317(M+Cl)^-，165(B)^-。

实施例6：3′，5′-二-O-乙酰基-2′-脱氧-β-L-胞苷( 6，图4)

标题化合物可以从L-dC一个步骤合成，然后进行Breiner等开发的用于制备D-对映体的方法[R.G.Breiner；W.Rose；J.A.Dunn；J.E.Mae Diarmid和J.Bardos；J.Med.Chem.1990， 33，2596-2603]。L-dC(765mg，3.37mmol)和乙酰氯(960μl，13.48mmol)在冰乙酸(4.8ml)中的溶液在室温下搅拌10分钟，然后加入无水氯仿(3.5ml)，继续搅拌24小时。所述溶液减压蒸发，然后用乙醇共蒸发。从乙醇中结晶产生78％所需化合物，mp 192-193℃(D-对映体的lit.：187-189℃[Breiner等，J.Med.Chem.1990， 33，2596-2603])；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm 9.8和8.7(2br s，＜3H，NH₃ ⁺，D₂O可交换)，8.0(d，1H，H-6J＝7.8Hz)，6.18(d，1H，H-5，J＝7.8Hz)，6.08(t，1H，H-1′，J＝6.7Hz)，5.2(m，1H，H-3′)，4.3-4.1(m，3H，H-4′，H-5′，H-5″)，2.4-2.5(m，2H，H-2′，H-2″)，2.06和2.03(2s，6H，2CH₃)；FAB＜0，(GT)m/e 968(3M+Cl)^-，657(2M+Cl)^-，438(M+G+Cl)^-，346(M+Cl)^-，310(M-H)^-，110(B)^-；59(CH₃COO)^-；FAB＞0(GT)623(2M+H)⁺，312(M+H)⁺，201(S)⁺，112(B+2H)⁺，43(CH₃CO)⁺；{α}_D ²⁰ 36.27(c＝1.02，在DMSO中)；UV(MeOH)λ_max＝277nm(ε9900)；λ_min＝246nm(ε5000)。

实施例7：2′-脱氧-β-L-胞苷的3′，5′-L-N-(叔丁氧基羰基)缬氨酸二酯( 9，图5)

用Boc-Val-OH(1.31g，6.03mmol)、DMAP(86.5mg，0.71mmol)、盐酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)(1.36g，7.09mmol)处理N⁴[(二甲氨基)亚甲基]-2′-脱氧-β-L-胞苷( 7，500mg，1.77mmol)在DMF(35ml)中的溶液，然后在室温搅拌40小时。额外加入Boc-Val-OH(655mg，3.01mmol)、DMAP(43.2mg，0.35mmol)、EDC(680mg，3.55mmol)，所述溶液继续搅拌20小时。减压蒸发后，用CH₂Cl₂溶解残余物，然后用水萃取几次。有机层用盐水(100ml)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，减压蒸发获得粗产物 8，该粗产物不用纯化，直接用于下一步。所述残余物用二氧杂环己烷(18ml)溶解，用26％NH₄OH水溶液处理，然后在室温搅拌1小时。所述溶液减压蒸发，残余物使用CH₂Cl₂中的MeOH(0-5％)阶式梯度洗脱在硅胶上进行色谱纯化，得到标题化合物(698.7mg，由 9的产率为58％)。¹H NMR(DMSO-d₆)δppm 7.58(d，1H，H-6)，7.29-7.18(m，4H，NH-Boc和NH₂)，6.20(t，J＝6.6Hz，1H，H-1′)，5.75(d，J＝7.3Hz，1H，H-5)，5.20(br.s，1H，H-3′)，4.29(m，2H，H-5′和H-5″)，4.14(br.s，1H，H-4′)，3.86(m，2H，CH-NH-Boc)，2.31-2.21(m，2H，H-2′和H-2″)，2.13-1.98(m，2H，CH(iPr))，1.38和1.36(2s，18H，tBu)，0.88和0.85(2d，J＝6.8Hz，12H，CH(CH₃)₂)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δppm 172.67和172.46，166.41，156.64和155.70，141.39，95.43，85.78，82.03，79.14，75.57，64.90，60.37和60.11，37.40，30.33，29.00，19.83-19.12；FAB＞0(GT)626(M+H)+，112(B+2H)⁺，255(M-Boc)⁺；FAB＜0，(GT)m/z 1249(2M-H)^-，624(M-H)^-。

实施例8：2′-脱氧-β-L-胞苷盐酸盐的3，5′-L-缬氨酸酯( 10，图5)

用二氧杂环己烷的26％HCl溶液(30ml)处理 9(675mg，1.08mmol)在二氧杂环己烷中的溶液(30ml)，在室温下搅拌1小时55分钟。所得白色悬浮液减压蒸发。白色固体残余物用最小量MeOH溶解，在乙醚中沉淀，得到为白色固体的标题化合物 10。mp 187℃(分解)；¹H NMR(DMSO-d₆)δppm 9.79(br s，1H，1/2NH₂)，8.72(br s，7H，1/2NH₂和NH₃ ⁺)，8.04(d，1H，H-6)，6.21(d，J＝7.8Hz，1H，H-5)，6.16(t，J＝6.9Hz，1H，H-1′)，5.39(m，1H，H-3′)，4.50-4.40(m，3H，H-4′，H-5′和H-5″)，3.90(2br.d，2H，CH-NH₃ ⁺)，2.63-2.50(2m，2H，H-2′和H-2″)，2.21(m，2H，CH(iPr))，1.02-0.94(m，12H，CH(CH₃)₂)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δppm 169.50和168.94，161.02，148.50，145.26，95.18，87.19，82.15，76.14，65.77和65.59，58.12和58.07，37.00，30.16，19.26-18.51；FAB＞0(GT)426(M+H)⁺，112(B+2H)⁺；FAB＜0，(GT)m/z 885(2M+Cl)^-，460(M+Cl)；UV(H₂O)λ_max＝270nm(ε7600)。

实施例9：2′-脱氧-β-L-胞苷的N⁴-Boc-缬氨酸酯

用氯代三甲基硅烷(6ml，47.28mmol)处理L-dC(1.80g，7.92mmol)和三乙胺(8.8mg，63.14mmol)在无水THF(80ml)中的混合物，并搅拌过夜。加入NH₄Cl的饱和水溶液(26ml)和水(10ml)，淬灭反应。水层用EtOAc萃取三次。合并有机层，用盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，减压蒸发，产生包含 11的粗淡黄色泡沫油，不用纯化，直接用于下一步。该残余物用CH₂Cl₂(104ml)溶解，用N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(Boc-Val-OH，1.72g，7.90mmol)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲氨基)六氟磷酸盐(BOP，4.20g，9.50mmol)、三乙胺(2.2ml，15.78mmol)处理，然后在室温下搅拌2天。所述溶液用EtOAc稀释，然后用饱和NaHCO₃萃取二次。有机层干燥(Na₂SO₄)，减压蒸发，产生粗品物质 12，不用纯化，直接用于下一步。该残余物用二氧杂环己烷(80ml)溶解，用26％NH₄OH水溶液处理，然后在室温下搅拌6小时45分钟。所述溶液减压蒸发，用无水EtOH共蒸发，残余物用CH₂Cl₂中的MeOH(5-10％)阶式梯度洗脱在硅胶上进行色谱纯化，得到为泡沫的标题化合物 13(1.64g，总产率48.5％)。¹H MR(DMSO-d₆)δppm10.88(s，1H，NH-4)，8.40(d，1H，H-6)，7.26(d，J＝7.4Hz，1H，H-5)，7.06(d，J＝8.2Hz，1H，CH-NH-Boc)，6.15(t，J＝6.3Hz，1H，H-1′)，5.32(d，J＝4.2Hz，1H，OH-3′)，5.09(t，J＝5.2Hz，1H，OH-5′)，4.27(m，1H，H-3′)，4.06(pt，J＝7.5Hz，1H，CH-NH-Boc)，3.91(m，1H，H-4′)，3.63(m，2H，H-5′和H-5″)，235(m，1H，H-2″)，2.06(m，2H，H-2′和CH(CH₃)₂)，1.43(s，9H，tBu)，0.92(pt，J＝6.6Hz，6H，CH(CH₃)₂)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δppm 174.41，162.94，156.47，155.24，146.10，96.06，88.79，87.10，79.09，70.75，61.78，61.55，41.74，30.63，29.02，19.91和19.10；FAB＞0(GT)853(2M+H)⁺，427(M+H)⁺311(B+2H)⁺，255(M-Boc)⁺；FAB＜0，(GT)m/z851(2M-H)^-，425(M-H)^-，309(B)^-。

实施例10：3′，5′-N⁴-三缬氨酰基-2′-脱氧胞苷( 14，图7)

原料3′，5′-N⁴-三(Boc-缬氨酰基)-2′-脱氧胞苷溶解于CH₂Cl₂中，由于有一些不溶性物质，因此通过Perlita过滤所述样品。这导致所用CH₂Cl₂的体积增加。然后边搅拌边加入HCl/二氧杂环己烷试剂。几秒钟内，在所述溶液中可以观察到鼓泡现象，然后溶液变浊。所述混合物在室温下搅拌约1小时。在此期间，沉淀成为更多的结晶。快速过滤所述混合物，用CH₂Cl₂洗滤饼，然后在泵上干燥，得到0.16g乳白色晶体(69％)。试剂和条件在下面表1更明确描述。

表1

试剂	摩尔单位	计算使用的重量/体积	摩尔/部分	实际使用的重量/体积	摩尔/部分	当量
试剂	摩尔单位	计算使用的重量/体积	摩尔/部分	实际使用的重量/体积	摩尔/部分	当量	3′，5′，N⁴-三Boc-Val-2′-dC(CyVal2a-2a)	825.0FW	0.30g	0.00036	0.3g	0.00036	1.00
CH₂Cl₂	5.0份	1.5mL	5	3.0mL	10	10.0	3′，5′，N⁴-三Boc-Val-2′-dC(CyVal2a-2a)	825.0FW	0.30g	0.00036	0.3g	0.00036	1.00
CH₂Cl₂	5.0份	1.5mL	5	3.0mL	10	10.0	二氧杂环己烷中的HCl，3.9M	256.0mL/mol	0.47g	0.00182	0.5g	0.00195	5.37
3′，5′，N⁴-三Val-2′-dC，粗品	634.0FW	0.23g	计算-观测	0.16g	69.4％		二氧杂环己烷中的HCl，3.9M	256.0mL/mol	0.47g	0.00182	0.5g	0.00195	5.37

实施例11：对DiBoc缬氨酰基-2′-dC和DiBoc缬氨酰基-2′-dU的HPLC测定方法

将所需化合物溶解在无水乙醇中，制备1.0mg/mL样品。然后所述溶液用含50％MeOH和50％KH₂PO₄(0.015M，pH＝3.30-3.50)的溶液稀释直到获得0.16mg/mL的浓度。(注意：所有使用的溶剂都在使用前脱气。)随后将20μl所述溶液立即注射进WATERS的HPLC柱(NOVAPAK C18-4pm-3.9×150mm)。流速设为1mL/分钟，柱温设为35℃。为检测所述化合物，检测Di-Boc 2′-dC时检测波长设为275nm，检测Di-Boc2′dU时检测波长设为260nm，15分钟后在204nm检测杂质。所述柱子使用泵A输送的KH₂PO₄(0.015M，pH＝3.30-3.50，用10％(体积比)H₃PO₄调整)和泵B输送的HPLC级乙腈。梯度模式见表2。

表2

#	时间	模块	事件	体积
#	时间	模块	事件	体积	12345678	0.010.0112.0020.0028.0028.0032.0032.01	泵泵泵泵泵泵泵SCL-10Avp	T.FlowB.Conc.B.Conc.B.Conc.B.Conc.B.Conc.B.Conc.Stop	14545707045450

VII.所述活性化合物的抗HBV活性

人DNA聚合酶和线粒体功能在体外不受L-dC影响。L-dC对于人外周血单核细胞(PBMC)、骨髓祖先细胞和许多人类和其它非人类哺乳动物来源的细胞系是无细胞毒性的。

在两个使用慢性乙型肝炎感染的旱獭模型中研究L-dC的抗病毒活性和安全性。在最初的研究中，用L-dC的液体制剂通过口服途径处理慢性感染WHV(＞10¹¹基因组当量/ML血清)的旱獭，每日一次，共28日。对照动物接受拉米夫定或不含药物的液体制剂。在L-dC处理组中，病毒载量以依赖于剂量的方式降低。在测试的最高剂量(10mg/kg/天)，根据定量聚合酶链反应(PCR)测定，病毒载量从基线降低差不多6个log。在第2周检测到处理后病毒反跳(rebound)。所有动物都增加体重，并且在四周处理阶段或八周处理后随访期期间没有观察到与药物有关的毒性。

L-dC对抗HBV时降低细胞外病毒脱氧核糖核酸(DNA)的体外50％有效浓度(EC₅₀)是0.24μM，对抗DHBV时是0.87μM。此外，L-dC降低细胞内HBV DNA复制中间体(RI)的EC₅₀是0.51μM。L-dC对抗HBV复制的90％有效浓度(EC₉₀)是1.07μM。结构活性关系(SAR)显示：取代3′位(3′-OH)上羟基基团将抗病毒活性从嗜肝DNA病毒扩展到其它病毒(包括人类免疫缺陷病毒(HIV)和某些疱疹病毒。碱基上的取代降低抗病毒效力和选择性。

第二个使用慢性乙型肝炎病毒感染的旱獭模型的研究测试L-dC与第二种受研究的核苷[β-L-2′-脱氧胸苷(L-dT)]联合应用的抗病毒效应和安全性。在该研究中包括处理组，其中使用L-dC作为单一试剂(1mg/kg/天)。单独的L-dC或L-dC与L-dT联合应用在12周处理阶段或12周处理后随访期内都没有观察到与药物有关的毒性。与对照动物相比，体重、血清化学参数和血液学参数都没有变化。处理结束时，肝活组织检查显示没有脂肪变化(微囊状脂肪变性)的组织形态学证据。L-dC(1mg/kg/天)加L-dT(1mg/kg/天)的组合有协同作用，并且从基线降低病毒载量达8个log。

抗病毒核苷和核苷类似物在病毒复制期间显示它们的抗病毒效应，如细胞内三磷酸酯衍生物在病毒聚合酶水平上显示作用。如同天然核苷(D-脱氧胞苷和D-胸苷)和抗病毒核苷类似物(如拉米夫定和齐多夫定(zidovudine))一样，L-dC通过磷酸化在细胞内被激活。在人肝细胞中，脱氧胞苷激酶(dCK)负责将L-dC以依赖于剂量的方式初步转化为5′-一磷酸酯(MP)衍生物。L-dC-MP随后转化为5′-二磷酸酯(DP)形式，所述形式接着转化为细胞内主要的5′-三磷酸酯(TP)代谢物。HepG2细胞暴露于10μM L-dC(在初级人肝细胞中是90.1μM)24小时后，L-dC-TP水平达到72.4μM，其细胞内半衰期是15.5小时。在内源聚合酶测定中，L-dC-TP抑制WHV的病毒体相关DNA聚合酶，其50％抑制浓度(IC₅₀)是1.82μM。L-dC抑制HBV DNA聚合酶的详细机制在研究中。HepG2细胞或人肝细胞在初级培养物中暴露于L-dC也产生第二种TP衍生物，β-L-2′-脱氧尿苷5′-三磷酸酯(L-dU-TP)。HepG2细胞暴露于10μM L-dC(在初级人肝细胞中是43.5μM)24小时后，L-dC-TP水平达到18.2μM。在内源聚合酶测定中，L-dU-TP抑制WHV的病毒体相关DNA聚合酶，其IC₅₀是5.26μM。

在初级人肝细胞培养物和在人肝细胞瘤细胞系(HepG2)中，L-dC的主要代谢物是L-dC-TP。这些细胞暴露于L-dC也导致L-dU-TP的形成。体外药理学测定显示：L-dC-TP通过作用于病毒体相关DNA聚合酶而抑制嗜肝病毒的DNA合成，其IC₅₀是1.82mM。L-dC-TP和L-dU-TP直到100μM(测试的最高浓度)仍不抑制人DNA聚合酶α、β和γ。

所述活性化合物在2.2.15细胞(用肝炎病毒体转化的HepG2细胞)中抑制病毒生长的能力可以如下面详述进行评估。

已经有关于该培养系统中抗病毒效应测定以及HBV DNA分析的综述和描述(Korba和Milman，1991， Antiviral Res.，15：217)。在两个单独的传代细胞中进行所述抗病毒评估。所有板上的所有孔在同一时间以同一密度接种。

由于细胞内和细胞外HBV DNA水平的遗传差异，只有从这些HBV DNA形式在未处理细胞中平均水平抑制多于3.5倍(对于HBV病毒体DNA)或3.0倍(对于HBV DNA复制中间体)才被视为在统计学上有显著意义(P＜0.05)。使用每一细胞DNA制备物中整合HBVDNA的水平(在这些实验中，在每个细胞的基础上保持恒定)计算细胞内HBV DNA形式的水平，由此保证不同样品比较相等量的细胞DNA。

未处理细胞中细胞外HBV病毒体DNA的典型值从50到150pg/ml培养基(平均约76pg/ml)。未处理细胞中细胞内HBV DNA复制中间体是从50到100μg/pg细胞DNA(平均约74pg/μg细胞DNA)。一般地说，抗病毒化合物处理所引起的细胞内HBV DNA水平的抑制比HBV病毒体DNA水平的抑制更不明显，并且发生更慢(Korba和Milman，1991， Antiviral Res.，15：217)。

进行杂交分析的方式使得有下面等价：每细胞约1.0pg细胞内HBV DNA等价于2-3基因组拷贝，1.0pg/ml细胞外HBV DNA等价于3×10⁵病毒颗粒/mL。

实施例

实施例12：溶解性研究

比较天然脱氧核糖胞嘧啶(D-dC)、L-dC的3′-缬氨酰酯和L-dC的3′，5′-二缬氨酰酯在水中的溶解度。如下评估L-dC的溶解性：首先顺序注射如表3所示已知浓度的β-L-dC，分析HPLC数据(即曲线下的面积)。HPLC运行条件如下：Nova-Pack C18柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH₃CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。溶液浓度对曲线下面积具有下面线性关系：y＝4150049477x-4334.46845(图8a)。

表3

浓度(mol/l)	10^-3	5×10^-4	10^-4	10^-5
浓度(mol/l)	10^-3	5×10^-4	10^-4	10^-5	面积	4175916	2031950	440122	55264

随后，用天然脱氧核糖胞嘧啶(D-dC)制备饱和溶液；取3个样品，注射入HPLC。该饱和溶液的浓度测定为1.07、1.08和0.96mol/L；因此，该饱和溶液的平均饱和浓度为1.03mol/L或272g/L。所述结果在表4中列表。

表4

结果	面积	浓度(mol/L)
结果	面积	浓度(mol/L)	第一个样品	4420674000	1.07
第二个样品	4475191000	1.08	第一个样品	4420674000	1.07
第二个样品	4475191000	1.08	第三个样品	3983845000	0.96

相似地，评估β-L-dC的3′-缬氨酰酯盐酸盐在水中的溶解度。如下制作校准曲线：顺序注射各种浓度β-L-dC的3′-缬氨酰酯盐酸盐进HPLC，测量曲线下面积，如表5所示。同样，HPLC运行条件如下：Nova-Pack C18柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH₃CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。溶液浓度对曲线下面积具有下面线性关系：y＝3176423963x-33051.63。

表5

浓度(mol/l)	10^-3	5×10^-4	10^-4	5×10^-5	10^-5
浓度(mol/l)	10^-3	5×10^-4	10^-4	5×10^-5	10^-5	面积	3,166,842	1,514,479	254,296	119,668	19,269

随后，尝试制备β-L-dC的3′-缬氨酰酯盐酸盐的饱和溶液；然而，没有获得一份溶液。因此，将实验室中容易获得的最大量β-L-dC的3′-缬氨酰酯盐酸盐溶解于水中。收集3份样品，根据HPLC的曲线下面积确定平均浓度为1.013、0.996和1.059mol/L。所述结果在表6中列表。

表6

结果	面积	浓度(mol/L)
结果	面积	浓度(mol/L)	第一个样品	3218013000	1.013
第二个样品	3162471000	0.996	第一个样品	3218013000	1.013
第二个样品	3162471000	0.996	第三个样品	3362725000	1.059

所有三个结果都在从校准曲线上预测的范围内，这表明所述化合物在这些高浓度下完全溶解，表明该样品的饱和溶液大于这三个样品的平均值，即大于1.023mol/L或408g/L。

评估β-L-dC的3′，5′-二缬氨酰酯盐酸盐在水中的溶解度。如下制作校准曲线：顺序注射各种浓度β-L-dC的3′，5′-二缬氨酰酯盐酸盐进HPLC，测量曲线下面积，如表7所示。同样，HPLC运行条件如下：Nova-Pack C18柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH₃CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。溶液浓度对曲线下面积具有下面线性关系：y＝3176423963x-33051.63(图8b)。

表7

浓度(mol/l)	10^-3	5×10^-4	10^-4	5×10^-5	10^-5
浓度(mol/l)	10^-3	5×10^-4	10^-4	5×10^-5	10^-5	面积	2863372	1466574	211046	115678	14435

随后，尝试制备β-L-dC的3′，5′-二缬氨酰酯盐酸盐的饱和溶液；然而，没有获得一份溶液。因此，将实验室中溶液获得的最大量β-L-dC的3′，5′-二缬氨酰酯盐酸盐溶解于水中。收集3份样品，根据HPLC的曲线下面积确定平均浓度为2.8、2.4和2.4mol/L。所述结果在表8中列表。

表8

结果	面积	浓度(mol/L)
结果	面积	浓度(mol/L)	第一个样品	8336188000	2.8
第二个样品	7054012000	2.4	第一个样品	8336188000	2.8
第二个样品	7054012000	2.4	第三个样品	6970838000	2.4

所有三个结果都在从校准曲线预测的范围内，这表明所述化合物在这些高浓度完全溶解，表明该样品的饱和溶液大于这三个样品的平均值，即大于2.5mol/L或1337g/L。

对β-L-dC的5′-缬氨酰酯盐酸盐(大于5.1mol/L或1664g/L)和β-L-dC的3′，5′-二乙酰酯盐酸盐(3.3mol/L或1148g/L)进行相似的溶解度研究。累积结果列表于表9。

表9

化合物	溶解度(mol/L)	溶解度(g/L)
化合物	溶解度(mol/L)	溶解度(g/L)	D-dC	1.03	272
5′-val-L-dC	＞5.1	＞1664	D-dC	1.03	272
5′-val-L-dC	＞5.1	＞1664	3′-val-L-dC	＞1.023	＞408
3′5′-二乙酰基-L-dC	3.3	1148	3′-val-L-dC	＞1.023	＞408
3′5′-二乙酰基-L-dC	3.3	1148	3′5′-dival-L-dC	＞2.5	＞1337

实施例13：Log P研究-磷酸盐缓冲液

将约1.5mg D-dC溶解于2.2mL 0.02M磷酸盐缓冲液(A，100mL，pH 7.2)，所述磷酸盐缓冲液由磷酸氢钾溶液(28.5mL)和磷酸二氢钾溶液(71.5mL)的混合物制成，然后用辛醇-1(B)饱和。在1mL该溶液中，加入1mL用0.02M磷酸盐缓冲液(A)饱和的辛醇-1(B)。振荡所得的混合物并离心；从每个阶段取三个样品并用HPLC分析，如表10所示。HPLC运行条件如下：Nova-Pack C18柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH₃CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。发现D-dC的log P是-1.41；因此，D-dC亲水强于亲辛醇。

表10

	研究1						研究2
	研究1						研究2						A¹	A²	A³	B¹	B²	B³	A¹	A²	A³	B¹	B²	B³
	面积	1948481	2130720	2197377	79838	82172	80159	2380141	2326654	2339059	93123	90275	A¹	A²	A³	B¹	B²	B³	A¹	A²	A³	B¹	B²	B³	89651
平均值	面积	1948481	2130720	2197377	79838	82172	80159	2380141	2326654	2339059	93123	90275	2092193			80723			2348618			91016			89651
平均值	P(B/A)	0.039						0.039								80723			2348618			91016
logP	P(B/A)	0.039						0.039						-1.41						-1.41

相似地，将约1.5mg L-dC-3′-缬氨酰酯盐酸盐溶解于2.5mL 0.02M磷酸盐缓冲液(A，100mL，pH 7.2)，所述磷酸盐缓冲液由磷酸氢钾溶液(28.5mL)和磷酸二氢钾溶液(71.5mL)的混合物制成。所述溶液随后用辛醇-1(B)饱和。在1mL该溶液中，加入1mL用0.02M磷酸盐缓冲液(A)饱和的辛醇-1(B)。振荡所得的混合物并离心；从每个阶段取三个样品并用HPLC分析，如表11所示。HPLC运行条件如下：Nova-Pack C18柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH₃CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。

表11

	研究1						研究2
	研究1						研究2						A¹	A²	A³	B¹	B²	B³	A¹	A²	A³	B¹	B²	B³
	面积	3352735	/	3417723	100544	96843	103466	3458180	3448062	3412971	100179	/	A¹	A²	A³	B¹	B²	B³	A¹	A²	A³	B¹	B²	B³	101731
平均值	面积	3352735	/	3417723	100544	96843	103466	3458180	3448062	3412971	100179	/	3385227			100284			3439738			100955			101731
平均值	P(B/A)	0.0296						0.0293								100284			3439738			100955
logp	P(B/A)	0.0296						0.0293						-1.53						-1.53

发现L-dC-3′-缬氨酸酯盐酸盐的log P是-1.53；因此，L-dC-3′-缬氨酸酯盐酸盐亲水强于亲辛醇的程度大于D-dC。

计算L-dC-5′-缬氨酸酯盐酸盐和L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐的log P值。所述结果列表于表12。然而，应当注意的是L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐的log P值可能低于测量值(-0.86)。在实验期间观察到所述二缬氨酸酯明显转化为3′-或5′-单缬氨酰酯甚至L-dC。检测到水相中50％的L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐发生转化，有机相中14％的L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐发生转化。该转化是由于所述酯在pH 7的磷酸盐缓冲液中的不稳定性所致(见实施例15和16)。

表12

化合物	log P(辛醇/水)
化合物	log P(辛醇/水)	D-dC	-1.41
L-dC-3′-缬氨酸酯盐酸盐	-1.53	D-dC	-1.41
L-dC-3′-缬氨酸酯盐酸盐	-1.53	L-dC-5′-缬氨酸酯盐酸盐	-1.42
L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐	-0.86	L-dC-5′-缬氨酸酯盐酸盐	-1.42
L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐	-0.86	L-dC-3′，5′-二乙酰酯盐酸盐	-0.74

实施例14：Log P′研究-MilliQ水

为避免二缬氨酸酯转化为一酯和L-dC，使用MilliQ水(A′)而不是磷酸盐缓冲液(pH 6.5而不是7.2)进行log P研究。重要的是要注意仅有二缬氨酰酯的盐酸盐形式能够用水进行所述研究。将约1.5mgL-dC-3′，5′-二缬氨酰酯盐酸盐溶解于2.2mL用辛醇-1(B)饱和的MilliQ水(A′，pH 6.5)中。在1mL该溶液中，加入1mL用MilliQ水(A′)饱和的辛醇-1(B)。振荡所得的混合物并离心；从每个阶段取三个样品并用HPLC分析，如表13所示。HPLC运行条件如下：Nova-Pack C18柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH₃CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。发现在这些条件下3′，5′-二缬氨酸酯的log P′是-2.72，这表明在磷酸盐缓冲液中有抗衡离子的强烈作用。在水相或有机相中没有观察到所述二缬氨酸酯转化为单酯或L-dC。

表13

	研究1						研究2
	研究1						研究2						A^1′	A^2′	A^3′	B¹	B²	B³	A^1′	A^2′	A^3′	B¹	B²	B³
	面积	3278293	3292150	3282281	5484	5776	6496	3282927	3327122	3297985	5829	5615	A^1′	A^2′	A^3′	B¹	B²	B³	A^1′	A^2′	A^3′	B¹	B²	B³	6139
平均值	面积	3278293	3292150	3282281	5484	5776	6496	3282927	3327122	3297985	5829	5615	3284241			5919			3302678			5861			6139
平均值	P′(B/A′)	1.80×10^-3						1.77×10^-3								5919			3302678			5861
logP′	P′(B/A′)	1.80×10^-3						1.77×10^-3						-2.7						-2.75

相似地，将约1.5mg L-dC-5′-缬氨酰酯盐酸盐溶解于2.2mL用辛醇-1(B)饱和的MilliQ水(A′，pH 6.5)中。在1mL该溶液中，加入1mL用MilliQ水(A′)饱和的辛醇-1(B)。振荡所得的混合物并离心；从每个阶段取三个样品并用HPLC分析，如表14所示。HPLC运行条件如下：Nova-Pack C18柱(3.9×150mm)，20mM乙酸三乙铵缓冲液(TEAAc)中CH₃CN 0-25％的梯度，时间十五分钟，流速每分钟1mL。发现在这些条件下5′-缬氨酸酯的log P′是-2.75，比使用磷酸盐缓冲液进行的log P研究中获得的值低。

表14

	研究1						研究2
	研究1						研究2						A^1′	A^2′	A^3′	B¹	B²	B³	A^1′	A^2′	A^3′	B¹	B²	B³
	面积	3722494	3771963	3788317	6545	5082	/	3619900	3975353	4062284	8484	9454	A^1′	A^2′	A^3′	B¹	B²	B³	A^1′	A^2′	A^3′	B¹	B²	B³	5877
平均值	面积	3722494	3771963	3788317	6545	5082	/	3619900	3975353	4062284	8484	9454	3760924			5813			3885845			7938			5877
平均值	P′(B/A′)	1.54×10^-3						2.04×10^-3								5813			3885845			7938
logP′	P′(B/A′)	1.54×10^-3						2.04×10^-3						-2.81						-2.69

在这些条件下，L-dC-5′-缬氨酰酯盐酸盐和L-dC-3′，5′-二缬氨酰酯盐酸盐的log P′值非常相似(表15)。

表15

化合物	log P(辛醇/水)	log P′(辛醇/水)
化合物	log P(辛醇/水)	log P′(辛醇/水)	L-dC-5′-缬氨酸酯盐酸盐	-1.42	-2.75
L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐	-0.86	-2.72	L-dC-5′-缬氨酸酯盐酸盐	-1.42	-2.75

实施例15：在pH 7.4的稳定性

计算L-dC-3′-缬氨酸酯盐酸盐每种代谢物的分解速率。在0.2MTris-HCl溶液中，37℃下，测得L-dC-3′-缬氨酸酯盐酸盐在pH 7.40时的半衰期是7小时。在这些条件下，L-dC-3′-缬氨酸酯盐酸盐仅转化为L-dC。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂。

相似地，计算L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐每种代谢物的分解速率。在0.2M Tris-HCl溶液中，37℃下，测得L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐在pH 7.42时的半衰期是2.4小时。在这些条件下，L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐部分水解为3′-和5′-缬氨酰基-L-dC，所述物质随后转化为L-dC。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂(流程4，图9a和图9b)。

流程4

实施例16：在pH 7.20时的稳定性研究

在20mM磷酸盐缓冲液中，测得L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐在pH 7.20时的半衰期是2.2小时。在这些条件下，L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐部分水解为3′-和5′-缬氨酰基-L-dC，这两种物质随后转化为L-dC。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂(流程5，图10a和图10b)。

流程5

实施例17：在pH 4.5时的稳定性研究

在20mM乙酸盐缓冲液中，测得L-dC-3′-缬氨酸酯盐酸盐在pH4.5时的半衰期是8.6天。同样，L-dC-3′-缬氨酸酯盐酸盐仅仅转化为L-dC。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂。

相似地，在20mM乙酸盐缓冲液中，测得L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐在pH 4.51时的半衰期是44小时。在这些条件下，L-dC-3′，5′-二缬氨酸酯盐酸盐部分水解为3′-和5′-缬氨酰基-L-dC，这两种物质随后转化为L-dC。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂(图11a和图11b)。

实施例18：在pH 1.2时的稳定性研究

在135mM KCl-HCl缓冲液中，测得L-dC-3′-缬氨酸酯盐酸盐在pH 1.2时的半衰期是48小时。没有检测到胞嘧啶，因此，没有可检测的糖苷键破裂。

相似地，对L-dC-5′-缬氨酸酯盐酸盐进行稳定性研究。该化合物在pH 1.2时非常稳定，直到23小时都没有检测到其它代谢物或分解产物。在溶液中直到第2天仍没有检测到糖苷键破裂。

发现L-dC的3′，5′-二乙酰酯在pH 1.2时的半衰期是11.2小时。在这些条件下，所述化合物部分水解为3′-或5′-衍生物，这两种物质随后转化为L-dC。在溶液中直到第2天仍没有检测到糖苷键破裂。

发现L-dC的3′，5′-二缬氨酰酯在pH 1.23时非常稳定，因为在这些条件下直到48小时仍没有检测到其它化合物。在溶液中直到第2天仍没有检测到糖苷键破裂(图12)。

或者，当用二甲氨基亚甲基或乙酰基掩蔽L-dC的N⁴位时，所述化合物在pH 1.2时的半衰期分别仅是26分钟或50分钟。

实施例19：L-dC在猕猴体内的单剂生物利用度

测定将L-dC静脉内或口服给予猕猴后L-dC的药代动力学。在该研究中，将单剂静脉内剂量10mg/kg氚([3H])放射标记的L-dC给予三只猕猴。在六周清除期后，同样的三只猕猴接受相同的L-dC口服剂量。在给药前和给药后0.25、0.5、1、2、3、6、8和24小时收集用于药代动力学分析的血液样品。使用盘收集器(pan catch)在下面时间收集用于药代动力学分析的尿样品：给药前和给药后的下面间隔：0-2小时、2-4小时、4-8小时和8-12小时，此后以12小时间隔直到给药后336小时。使用反相高效液相色谱技术检测所述药物并测定浓度。通过非建模(non-modeling)的数学方法分析血液和尿药物水平数据，根据线性梯形法则推导AUC。

静脉内给予L-dC。在所有动物中，静脉给药后L-dC的平均C_max是95.7μM，出现在最早取样时间(给药后15分钟)。静脉内团(bolus)推注后L-dC血浆浓度随时间降低，平均t_1/2是1.59小时。静脉内给药后L-dC的总清除(CL)和肾清除(CLR)分别平均是0.53L/小时/kg和0.46L/小时/kg。平均表观分布体积(V_d)是1.22L/kg，这表明L-dC具有显著的血管外组织分布。

尿排泄是快速的，在2小时内回收71％给药剂量。L-dC占尿中回收剂量的大部分(94％)。肾清除(0.46L/小时/kg)占总L-dC清除的87％，这提示肾清除是主要排除途径。

在血浆和尿中检测到L-dU，这表明在静脉内给药后也发生L-dC的代谢排除。在血浆中检测到在检测限附近的低水平L-dU(检测下限(LLOD)＝0.1μM)。L-dU的肾排除占尿中回收的总剂量的4.0％。除L-dU外，在血浆或尿中没有检测到其它代谢物。

口服给予L-dC。C_max是3.38μM，出现在T_max 2.33小时。L-dC的血浆浓度以两阶段(biphasic manner)方式降低，平均末端t_1/2是2.95小时，24小时后所有猕猴体内的L-dC血浆浓度低于检测限。L-dC从胃肠道吸收，平均口服生物利用度(F)是16.4％。

在血浆和尿中检测到L-dU，这提示在口服给药之后发生L-dU的代谢排除。在血浆中检测到在LLOD时低水平L-dU。除L-dU外，在血浆和尿中没有检测到其它代谢物。

12小时内在尿中回收约8.5％的口服给药剂量。72小时后回收15.5％±8％。L-dC占尿中排泄药物的大部分(约69％)。L-dU的肾排泄占总回收剂量的29％。不收集粪便。

表16展示L-dC在猕猴中静脉内给予和口服给予的药代动力学结果的综述。

表16 在猕猴中静脉内给予和口服给予L-dC(10mg/kg)的药代动力学分析

途径(h)	AUC_last(mM-小时)	t_1/2(小时)	C_max(mM)	T_max(小时)	CL(L/小时/kg)	CL_R(L/kg)	V_d(L/kg)	F(％)
途径(h)	AUC_last(mM-小时)	t_1/2(小时)	C_max(mM)	T_max(小时)	CL(L/小时/kg)	CL_R(L/kg)	V_d(L/kg)	F(％)	静脉内给予SD口服给予SD	81.1(±5.7)13.7(±4.3)	1.59(±0.09)2.95(±1.3)	95.7(±13)3.38(±1.3)	02.33(±1.5)	0.53(±0.04)-	0.46-	1.22(±0.11)-	-16.4(±5.0)
平均值(±SD)									静脉内给予SD口服给予SD	81.1(±5.7)13.7(±4.3)	1.59(±0.09)2.95(±1.3)	95.7(±13)3.38(±1.3)	02.33(±1.5)	0.53(±0.04)-	0.46-	1.22(±0.11)-	-16.4(±5.0)

实施例20：L-dC在恒河猴中的单剂生物利用度

测定将L-dC口服给予恒河猴后L-dC的药代动力学。在该研究中，将单剂口服剂量10mg/kg氚([3H])放射标记的L-dC给予三只恒河猴。在给药前和给药后0.25、0.5、1、2、3、6、8和24小时收集用于药代动力学分析的血液样品。使用盘收集器(pan catch)在下面时间收集用于药代动力学分析的尿样品：给药前和给药后的下面间隔：0-2小时、2-4小时、4-8小时和8-12小时，此后以12小时间隔直到给药后336小时。使用反相HPLC技术检测所述药物并测定浓度。通过非建模(non-modeling)的数学方法分析血液和尿药物水平数据，根据线性梯形法则推导AUC。

平均AUC_0.25→8和C_max值分别是12.2mgM.h和3.23mgM。C_max出现在T_max 0.83小时。平均t_1/2是3.34小时，24小时后所有恒河猴体内L-dC血浆浓度低于检测水平。L-dC的平均肾清除是0.273L/小时/kg。在接受L-dC的恒河猴的血浆中没有观察到代谢物。

8小时后在尿中回收约8.5％给予的口服剂量(L-dC的口服生物利用度是约16％)。48小时后回收15％。L-dC占尿中排泄药物的大部分(约77％)。L-dC的肾排泄占总回收剂量的23％。除L-dU外，没有检测到其它代谢物。

L-dC口服给予恒河猴后AUC和C_max类似于在猕猴中观察到的所述值。

实施例21：L-dC在大鼠中的单剂生物利用度

测定L-dC在大鼠内的药代动力学和生物利用度。在该研究中，将单剂静脉内剂量10mg/kg氚([3H])放射标记的L-dC给予三只雌性Sprague-Dawley大鼠。第二组三只动物接受相同的L-dC口服剂量。在给药后0.17、0.33、0.5、1、2、3、4、6、8和24小时收集用于药代动力学分析的血液样品。在给药后8小时和24小时收集尿。使用反相HPLC技术在血浆和尿中检测所述药物并测定浓度。通过非建模(non-modeling)的数学方法分析血液和尿药物水平数据，根据线性梯形法则推导AUC。

静脉内给予L-dC。平均AUC_0.25→8值是30.1mM.小时。在所有动物中，L-dC的平均C_max是91.1mgM，出现在最早取样时间(给药后10分钟)。静脉内团(bolus)推注后L-dC血浆浓度以两阶段方式降低，平均t_1/2是1.21小时。L-dC的CL平均是1.44L/小时/kg。平均V_d是2.53L/kg，这表明L-dC具有显著的血管外组织分布。在接受L-dC的大鼠的血浆中没有观察到代谢物。

L-dC占尿中回收放射性的大部分。在尿中检测到L-dU，这提示在静脉内给药后发生L-dC的代谢排除。

口服给予L-dC。平均AUC_0.25→8值是4.77mM.小时。平均C_max是1.50mgM，出现在T_max 1.0小时。L-dC的血浆浓度降低，t_1/2为2.52小时降低。L-dC从胃肠道有限摄取，平均口服生物利用度(F)是15.4％。口服给予L-dC后在大鼠血浆中没有观察到代谢物。

L-dC占尿中回收放射性的大部分。在血浆和尿中检测到L-dU，这提示在静脉内给药后发生L-dC的代谢排除。

表17展示静脉内给予和口服给予L-dC的药代动力学结果的综述。

表17 在大鼠中静脉内给予和口服给予L-dC(10mg/kg)的药代动力学分析

途径(h)	AUC_0-25-28(mM-小时)	t_1/2(小时)	C_max(mM)	T_max(小时)	CL(L/小时/kg)	V_d(L/kg)	F(％)
途径(h)	AUC_0-25-28(mM-小时)	t_1/2(小时)	C_max(mM)	T_max(小时)	CL(L/小时/kg)	V_d(L/kg)	F(％)	静脉内给予SD口服给予SD	30.1(±4.7)4.77(±2.1)	1.21(±0.06)2.52(±1.3)	91.1(±6.6)1.50(±0.68)	01.0	1.44(±0.29)-	2.53(±0.60)-	-15.4(±4.6)
平均值(±SD)								静脉内给予SD口服给予SD	30.1(±4.7)4.77(±2.1)	1.21(±0.06)2.52(±1.3)	91.1(±6.6)1.50(±0.68)	01.0	1.44(±0.29)-	2.53(±0.60)-	-15.4(±4.6)

实施例22：L-dC在旱獭体内的单剂生物利用度

测定L-dC在旱獭体内的药代动力学和生物利用度。在该研究中，将单剂静脉内剂量10mg/kg氚([3H])放射标记的L-dC给予三只旱獭。在给药后2、5、15和30分钟以及1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和24小时收集用于药代动力学分析的血液样品。在七周清除期后，同样动物接受单剂口服剂量10mg/kg L-dC。在给药后15和30分钟以及1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和24小时收集用于药代动力学分析的血液样品。在给药后24小时时间内收集尿。测定血浆药物水平、CL、t_1/2和F。使用HPLC方法和在线(in-line)放射性检测以及闪烁计数测定药物水平。

静脉内给予L-dC。在所有动物中，L-dC的平均C_max是112μM，出现在最早取样时间(给药后2分钟)。静脉内团(bolus)推注后L-dC血浆浓度以两阶段方式降低，平均t_1/2是2.85小时。L-dC的CL平均是0.39L/小时/kg。平均V_d是1.17L/kg。L-dC占尿中回收放射性的大部分。在血浆和尿中检测到L-dU，这表明在静脉内给药后发生L-dC的代谢排除。在血浆中间断检测到的L-dU水平在测定方法定量限上或以下，平均C_max是0.75μM。

口服给予L-dC。C_max是1.37μM，出现在T_max 3小时。L-dC的血浆浓度降低，平均t_1/2是5.22小时。L-dC从胃肠道吸收，平均生物利用度从5.60到16.9％，平均9.57％。L-dC占尿中回收放射性的大部分。在血浆和尿中检测到L-dU，这表明在口服给药后发生L-dC的代谢排除。血浆中的L-dU接近定量限，平均C_max是0.19μM。

表18展示静脉内给予和口服给予L-dC的药代动力学结果的综述。

表18 在旱獭中静脉内给予和口服给予L-dC(10mg/kg)的药代动力学分析

途径(n)	AUC_t→24 ^a(μM-小时)	t_1/2(小时)	C_max(μM)	T_max(小时)	CL(L/小时/kg)	V_d(L/kg)	F(％)
途径(n)	AUC_t→24 ^a(μM-小时)	t_1/2(小时)	C_max(μM)	T_max(小时)	CL(L/小时/kg)	V_d(L/kg)	F(％)	静脉内给予SD口服给予SD	174(±120)^b11.3(±4.7)	2.85(±130)5.22(±2.7)	112(±33)1.37(±0.22)	03.0(±1)	0.39(±0.3)-	1.17(±0.36)-	-9.57(±6.4)
a 对于静脉内给予，t＝0.033小时，对于口服给予，t＝0.25小时								静脉内给予SD口服给予SD	174(±120)^b11.3(±4.7)	2.85(±130)5.22(±2.7)	112(±33)1.37(±0.22)	03.0(±1)	0.39(±0.3)-	1.17(±0.36)-	-9.57(±6.4)
a 对于静脉内给予，t＝0.033小时，对于口服给予，t＝0.25小时								b 平均值(±SD)

实施例23：L-dC的前体药物的生物利用度

用或不用L-dT，评估L-dC、L-dC的5′-单酯、L-dC的二缬氨酸酯和L-dC的二乙酰酯在猕猴中的生物利用度。当将L-dC的二缬氨酸酯口服给予猕猴时，约73％剂量得到吸收。在吸收的L-dC的二缬氨酸酯中，超过99％快速转化为L-dC，在血浆中产生高L-dC浓度并且再也检测不到L-dC的二缬氨酸酯。口服给予L-dC的二缬氨酸酯后，在早期检测到低血浆浓度的L-dC的单缬氨酸酯。间断检测到低血浆浓度的β-L-2′-脱氧尿苷(L-dU)。没有检测到其它代谢物。结果显示于表19。如下表所表明的，L-dC的3′，5′-二缬氨酰酯与L-dT的组合提供最高的L-dC生物利用度。

表19

	L-dC母体(mw＝227.22)	L-dC³5′-缬氨酸酯(mw＝399.27)	L-dC3′-缬氨酸酯(mw＝399.27)	L-dC二缬氨酸酯(mw＝534.87)	L-dC二乙酰酯(mw＝347.75)
	L-dC母体(mw＝227.22)	L-dC³5′-缬氨酸酯(mw＝399.27)	L-dC3′-缬氨酸酯(mw＝399.27)	L-dC二缬氨酸酯(mw＝534.87)	L-dC二乙酰酯(mw＝347.75)	％BA¹％BAw/L-dT²	16.4±5.011.9±1.7	39.0±11.4ND	85.1±24.5ND	72.7±22.074.6±9.9	23.0±6.524.9±4.0

¹根据L-dC(口服剂量)的AUC估计

²与10mg/kg L-dT共同给予

³根据总放射性剂量的比活(specific activity)5′-单缬氨酸酯研究

ND，未测定

纯度＝87％L-dC-单缬氨酸酯，12％L-dC

实施例24：dival-L-dC在猕猴中的单剂生物利用度

三只雄性非天然猕(three make) 猴(macaca fascicularis)静脉内接受溶于无菌9.0％盐水中的10mg/kg的dival-L-dC以及痕量氚([H])标记的drub(250μCi)。在六周清除期后，同样的三只动物接受相同口服剂量的dival-L-dC。在给药前(约18小时)和给药后0.25、0.50、1、2、3、4、6、8和24小时收集血液样品于肝素化的管中。在下面时间收集尿：给药后0-2小时、2-4小时、4-8小时和8-12小时，此后以12小时间隔直到给药后336小时。使用液相色谱-质谱(LC-MS)技术定量血浆和尿中的药物。给予dival-L-dC后，使用非建模数学方法以及根据线性梯形法则推导的时间-浓度曲线下的面积(AUC)分析L-dC血浆浓度随时间的变化。在静脉内给予和口服给予dival-L-dC后，从所述L-dC AUC计算L-dC的生物利用度(F)，其中F＝AUC口服给予/AUC静脉内给予x静脉内给予剂量/口服给予剂量。

静脉内给予的dival-L-dC在静脉内给予后快速转化为L-dC。在15分钟(1.39μM)和30分钟(0.36μM，3只动物中的1只)在血浆中检测到dival-L-dC[定量下限(LLOQ)＝23μM或100ng/mL]。给药后30分钟在血浆中检测不到dival-L-dC。在15分钟在血浆中检测到dival-L-dC的部分去酯化形式β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯(3.23μM)，其浓度在2小时内降到0.08μM(LLOQ＝0.031μM或10ng/mL)。静脉内给药后，L-dC代表血浆中存在药物的大部分。L-dC的平均AUC_0.25→8是19.8μM·h。L-dC的平均峰血浆浓度(C_max)是24.6μM(LLOQ＝0.088μM或20ng/mL)，在所有动物中在最早取样时间(给药后15分钟)出现。L-dC的血浆浓度以两阶段方式降低，平均t_1/2是1.73小时。L-dC的总体内清除(CL)和表观分布体积(V_d)分别平均是1.01L/小时/kg和2.46L/kg，这表明L-dC有显著的血管外组织分布。dival-L-dC和L-dC与离体的人血浆蛋白的结合分别是13.3±2.6％和19.7±5.9％。人血浆蛋白结合对dival-L-dC和L-dC游离药物水平的影响是最低限度的，这提示预计没有涉及结合位点取代的药物相互作用。

尿排泄是迅速的，静脉内给药后2小时内排泄出58±3％的dival-L-dC给予剂量。L-dC占尿中排泄药物的大部分(约93％)。在血浆和尿中也检测到L-dU。这提示在给予dival-L-dC之后也发生L-dC的代谢排除。在间断的时间点，三只动物的两只的血浆中检测到低水平L-dU，浓度范围从0.22μM到0.88μM(LLOQ＝0.22μM或50ng/mL)。第三只动物体内在任何时间点都没有可检测水平的L-dU。L-dU和dival-L-dC的部分去酯化形式β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的肾排泄是较少的，分别占总回收剂量的约2.5％和3.7％。静脉内给药后2小时，在三只动物的一只的尿中检测到dival-L-dC，占回收剂量的约0.15％。

因为单缬氨酸酯和L-dU在血浆和尿中的浓度间断并且低，所以无法对这些代谢物进行药代动力学分析。dival-L-dC单缬氨酸酯的表现是无法预料的，因为它代表dival-L-dC到L-dC的转化，是所述转化的中间体。此外，在猴、大鼠和人初级肝细胞和HepG2细胞提取物中的体外细胞代谢研究证明：L-dC并不是直接脱氨形成L-dU，而是L-dC一磷酸酯(-MP)转化为L-dU-MP，L-dU-MP或者受激活成为L-dU二磷酸酯(-DP)和三磷酸酯(-TP)，或者代谢形成L-dU，L-dU随后在细胞外区室(血浆)中检测到。L-dU是无细胞毒性的(CC₅₀＞200μM)，L-dU-TP在体外对抗乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶的IC₅₀是5.26μM(见Microbiology and Virology，第10部分)。

口服给予的dival-L-dC在口服给药后也快速转化为L-dC，并且在任何时间点在血浆样品中检测不到(dival-L-dC在溶液中的LLOQ＝0.23μM或100ng/mL)。在30分钟和1小时在血浆中可以检测到dival-L-dC部分去酯化代谢物β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯，其浓度范围从0.034β到0.107β(单酯在溶液中的LLOQ＝0.031μM或10ng/mL)。dival-L-dC在血浆中检测不到。

口服给予dival-L-dC后，L-dC代表血浆药物水平的大部分(在C_max时多于99％)。L-dC的平均AUC_0.25→8值是14.0μM·小时。L-dC的C_max是8.26μM(L-dC在溶液中的LLOQ＝0.088μM或20ng/mL)，出现在给予dival-L-dC后0.67小时。L-dC的血浆浓度以两阶段方式降低，平均t_1/2是2.28小时。给予dival-L-dC后L-dC的平均口服生物利用度是72.7％±22％。

在血浆中还检测到L-dU，这表明口服给予dival-L-dC后发生L-dC的代谢排除。在三只动物的两只中，在从30分钟到4小时的血浆中检测到低水平的L-dU，其浓度范围从0.24μM到0.66μM(L-dU在溶液中的LLOQ＝0.22μM或50ng/mL)，在一只动物中仅在8小时检测到，其浓度为0.39μM。

口服给药后，dival-L-dC从胃肠道快速吸收，并由首过(first-pass)肠代谢和/或肝代谢转化为L-dC。dival-L-dC和L-dC代谢都与肝微粒体酶无关。给予高剂量水平dival-L-dC后，L-dC单缬氨酸酯在转化为L-dC前能够短暂检测到。口服给药后检测不到dival-L-dC。检测到间断的低血浆水平L-dU，其水平在测定方法定量下限上或以下。细胞摄取L-dC后，将L-dC脱氨化，形成L-dU。

在尿中4小时内回收约31±8％的口服给予剂量。72小时后回收39±8％。L-dC占尿中排泄药物的大部分(约95％)。L-dU和dival-L-dC部分去酯化形式β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的肾排泄是较少的，分别占总回收剂量的约2.5％和0.2％。在尿中没有检测到dival-L-dC。

表20代表静脉内给予和口服给予dival-L-dC后L-dC的药代动力学结果的综述。

表20 在猕猴中静脉内给予和口服给予dival-L-dC(10mg/kg)的药代动力学分析

药代动力学参数²
药代动力学参数²								途径(n)	AUC_0.25→8(μM-小时)	t_1/2(小时)	C_max(μM)	T_max(小时)	CL(L/小时/kg)	V_d(L/kg)	F(％)
静脉内给予(3)口服给予(3)	19.8(±5.2)14.0(±2.4)	1.73(±0.33)2.28(±1.4)	24.6(±2.6)8.26(±0.71)	00.67(±0.3)	1.01(±0.32)	2.46(±0.47)	72.7(±22)	途径(n)	AUC_0.25→8(μM-小时)	t_1/2(小时)	C_max(μM)	T_max(小时)	CL(L/小时/kg)	V_d(L/kg)	F(％)
静脉内给予(3)口服给予(3)	19.8(±5.2)14.0(±2.4)	1.73(±0.33)2.28(±1.4)	24.6(±2.6)8.26(±0.71)	00.67(±0.3)	1.01(±0.32)	2.46(±0.47)	72.7(±22)	(3)平均值[±标准差(SD)]

表21代表静脉内给予和口服给予dival-L-dC后dival-L-dC代谢物形式(L-dC单缬氨酸酯、L-dC和L-dU)的示意图。

表21 静脉内给予和口服给予dival-L-dC的代谢物形式

静脉内(10mg/kg dival-L-dC)
静脉内(10mg/kg dival-L-dC)	C_max	dival-L-dC→1.39μM	单-val-L-dC→3.23μM	L-dC→→24.6μM	L-dU0.88μM
口服(10mg/kg dival-L-dC)	C_max	dival-L-dC→1.39μM	单-val-L-dC→3.23μM	L-dC→→24.6μM	L-dU0.88μM
口服(10mg/kg dival-L-dC)	C_max	val-L-dC→检测不到	单-val-L-dC→0.11μM	L-dC→→8.26μM	L-dU0.66μM

实施例25：L-dC通过dival-L-dC在猕猴中的口服生物利用度

三只雄性非天然(non-naive)猕猴(macaca fascicularis)口服接受溶于无菌0.9％盐水中的10mg/kgdival-L-dC以及痕量氚([H])标记的药物(250μCi)。在给药前(约18小时)和给药后0.25、0.50、1、2、3、4、6、8和24小时收集血液样品于肝素化的管中。在下面时间收集尿：给药后0-2小时、2-4小时，4-8小时和8-12小时，此后以12小时间隔直到给药后336小时。使用HPLC分析定量血浆和尿中的药物。给予dival-L-dC后，使用非建模数学方法以及根据线性梯形法则推导的时间-浓度曲线下的面积(AUC)分析L-dC血浆浓度随时间的变化。dival-L-dC口服给予后快速吸收并转化为L-dC。血浆样品的放射色谱高压液相色谱(HPLC)证实：大部分回收的放射性是L-dC。仅在一只动物体内在给药后15分钟检测到dival-L-dC，其浓度为0.35μM。在血浆或尿中没有检测到dival-L-dC部分去酯化形式β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯。在尿中8小时内回收约26％的口服给予剂量。72小时后回收31％。L-dC占尿中排泄药物的大部分(约89％)。L-dU的肾排泄是较少的，占回收剂量的约10％。在尿中没有检测到dival-L-dC或其部分去酯化形式以及其它代谢物。

总药代动力学模式类似于药代动力学研究的结果，正如类似于C_max与AUC比例所证明的。在三只动物的两只动物体内的血浆中检测到低水平L-dU，平均C_max是0.33μM。在第三只动物的血浆中没有检测到L-dU。L-dU的水平在定量限或以下，使得无法进行药代动力学分析。

实施例26：dival-L-dC的体外代谢

进行研究以确定dival-L-dC及其去酯化代谢物在人血浆中的稳定性和蛋白结合。dival-L-dC在37℃下与人血浆温育，并在不同时间点分析样品直到24小时(图13)。24小时后检测不到dival-L-dC，其完全转化为L-dC。还观察到两种其它的代谢物(β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯和β-L-2′-脱氧胞苷-缬氨酸酯)。这些代谢物的短暂存在表明它们是从dival-L-dC转化为L-dC的中间体。经测定，37℃下dival-L-dC在人血浆中的体外半衰期约是39分钟。

还使用超滤方法研究人血浆蛋白结合对dival-L-dC和L-dC游离水平的影响。dival-L-dC的血浆蛋白结合是13.3％±2.6％。L-dC与血浆蛋白的结合是19.7％±5.9％。该研究显示：人血浆蛋白结合对dival-L-dC和L-dC的影响是较小的，这提示预期没有涉及结合位点取代的药物相互作用。

实施例27：L-dC的代谢激活和细胞内模式

使用HepG2细胞和人初级肝细胞研究L-dC的细胞代谢。高压液相色谱(HPLC)分析证明：L-dC在肝细胞中被大范围的磷酸化。HepG2细胞暴露于10μM L-dC 24小时后细胞内主要代谢物是L-dC-TP，其浓度达到72.4±1.8μM(见表23)。在初级人肝细胞中，在24小时L-dC-TP的浓度是90.1±37μM，类似于HepG2细胞中的磷酸化水平。肝细胞暴露于L-dC导致第二种5′-三磷酸酯衍生物L-dU-TP的激活。在暴露于10μM L-dC的HepG2细胞中，L-dU-TP水平在24小时达到18.2μM(在初级人肝细胞中是43.5pM)。在初级大鼠和猴肝细胞中，L-dC磷酸化的程度稍低。

表23 L-dC(10μM)在肝细胞中的激活代谢物(10μM)

细胞^a	n	L-dC-MP	L-dU-MP	L-dC-DP	L-dC-DP-胆碱	L-dU-DP	L-dC-TP	L-dU-TP
细胞^a	n	L-dC-MP	L-dU-MP	L-dC-DP	L-dC-DP-胆碱	L-dU-DP	L-dC-TP	L-dU-TP	HepG2人初级肝细胞猴初级肝细胞大鼠初级肝细胞	3313	23.3±0.8627.6±1511.25.09±2.1	6.73±0.415.74±2.42.543.53±0.97	10.2±1.97.19±2.37.661.52±0.38	25.6±0.0815.8±1.810.48.82±3.1	2.69±0.453.93±1.63.117.90±1.4	72.4±1.890.1±3739.314.2±3.1	18.2±1.043.5±2721.946.9±5.2

(a)细胞与[³H]-L-dC温育24小时，比活：HepG2测定＝0.5Ci/mmol；人、猴和大鼠肝细胞测定＝1.0Ci/mmol。

除L-dC和L-dU的磷酸化衍生物外，还观察到形成[β-L-2′-脱氧脂核苷酸(deoxyliponucleotide)代谢物。在暴露于10μM L-dC达24小时的HepG2细胞和初级肝细胞培养物中，检测到[3-L-2′-脱氧胞苷-5′--二磷酸胆碱(L-dC-DP-胆碱)的浓度分别为25.6μM(范围25.6-25.7μM)和12.3μM(范围8.82-15.8μM)。

HepG2细胞暴露于10μM[3H]-L-dC达24小时后获得的代谢模式图见图14。L-dC-TP的表观细胞内半衰期是15.5±0.34小时，这与病毒反跳实验中停药后延长的抗病毒活性相关。在初级人肝细胞中检测到的磷酸化模式是定性的，在定量上类似于使用HepG2细胞获得的模式(图15)。

实施例28：与代谢激活有关的细胞激酶

D-脱氧胞苷(dCyd)是胞质dCyd激酶(dCK)和线粒体胸苷激酶(TK2)转化生成dCyd-5′-一磷酸(dCMP)的天然底物。胞质胸苷激酶(TK1)和TK2利用D-胸苷(Thd)作为天然底物转化生成Thd-5′-一磷酸(TMP)。在使用L-dC和天然内源Thd和dCyd的竞争性研究中鉴定涉及初步磷酸化L-dC的细胞激酶。L-dC的细胞内磷酸化由dCyd而不是Thd以依赖于剂量的方式降低。因此，dCyd作为L-dC磷酸化的抑制剂起作用。当HepG2细胞暴露于Thd和dCyd或者暴露于单独的dCyd时，L-dC细胞内磷酸化的改变相似。L-dC磷酸化仅受到天然脱氧嘧啶dCyd抑制，这提示dCK与L-dC磷酸化有关。

在激酶缺陷型细胞系中进一步研究这些嘧啶核苷激酶活性在L-dC磷酸化中的作用。L-dC磷酸化代谢物的数量在dCK缺陷型细胞中显著降低。然而，没有观察到在TK1缺陷型细胞内的L-dC磷酸化的显著变化。这些数据与上述竞争性研究一致，表明dCK在L-dC磷酸化生成L-dC-MP的过程中起关键作用。

使用HepG2细胞的胞质提取物作为酶来源，L-dC、Thd和dCyd磷酸化的稳态动力学相似，正如表观Michaelis-Menten常数(K_m)和最大初速度(V_max)值所表明的那样(L-dC：K_m是5.75mM，V_max是1.12mmol/分钟/mg蛋白；Thd：K_m是4.06mM，V_max是1.26mmol/分钟/mg蛋白；dCyd：K_m是4.85mM，V_max是2.15mmol/分钟/mg蛋白)。此外，L-dC、Thd和dCyd磷酸化的效能相似，所述效能根据它们对应的V_max/K_m值定义(分别是0.19、0.31和0.44)。

此外，在旱獭肝提取物中比较L-dC的细胞内磷酸化水平以及天然内源底物(Thd和dCyd)的细胞内磷酸化水平。进行所述比较以支持在慢性乙型肝炎病毒感染的旱獭模型中进行的抗病毒测试。L-dC磷酸化类似于所述内源底物的磷酸化。此外，所述L-dC的磷酸化水平与人肝提取物中L-dC和所述内源底物的磷酸化类似。

实施例29：L-dC抗嗜肝DNA病毒的抗病毒活性

如下测量L-dC抗人乙型肝炎病毒的抗病毒活性：与表达HBV的肝细胞瘤细胞系2.2.15的未处理对照细胞相比，测量细胞外HBVDNA和复制中间体的减少(见表24)。L-dC抗病毒活性的证实试验使用一组核糖核酸(RNA)和DNA病毒，所述证实试验根据NIH AntiviralResearch and Antimicrobial Chemistry Program进行。

L-dC并不抑制除嗜肝DNA病毒(HBV、DHBV)外的任何病毒的复制。L-dC在体外对HBV复制具有有效抗病毒活性，降低细胞外HBVDNA产生，其EC₅₀是0.24μM(EC₉₀ 1.06μM)。L-dC也降低细胞内HBV DNA复制中间体(RI)，其EC₅₀是0.5μM。此外，L-dC在初级鸭肝细胞(PDH)培养物中以依赖于剂量的方式抑制鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA合成，其EC₅₀是0.87μM。

表24 L-dC的体外抗病毒活性、选择性和细胞毒性

病毒(细胞系)	EC₅₀ ^b(μM)	CC₅₀ ^c(μM)
病毒(细胞系)	EC₅₀ ^b(μM)	CC₅₀ ^c(μM)	HBV(2.2.15)DHBV(PDH)HIV-1(PBMC)HSV-1(HFF)^eHSV-2(HFF)^eVZV(HFF)^eEBV(Daudi)^eHCMV(HFF)^eA型流感/H1N1(MDCK)A型流感/H3N2(MDCK)B型流感(MDCK)麻疹(CV-1)3型副流感(MA-104)5型鼻病毒A型RSV(MA-104)	0.24±0.080.87＞200＞100＞10018.6＞50＞100＞100＞100＞100＞100＞100＞100＞100	＞2000Ndd＞200＞100＞100＞100＞50＞100＞100＞100＞100＞100＞100＞100＞100

a.PDH，初级鸭肝细胞；PBMC，外周血单核细胞；HFF，人包皮成纤维细胞；Daudi，Burkitt氏B细胞淋巴瘤；MDCK，犬肾上皮细胞；CV-I，非洲绿猴肾成纤维细胞；KB，人鼻咽癌；MA-i04，恒河猴肾上皮细胞。

b.EC₅₀＝50％有效浓度。

c.CC₅₀＝50％细胞毒性浓度。

d.nd＝未检测到。

e.结果以μg/mL而不是μM表示。

在用于支持各种DNA和RNA病毒复制的任何所述细胞系或初级细胞类型中测试的L-dC最高浓度下，没有检测到细胞毒性。在人PBMC、HFF或其它哺乳动物来源的其它细胞类型中没有观察到毒性。

实施例30：L-dC在旱獭中的抗病毒活性-28天

慢性感染WHV的旱獭被广泛接受为HBV感染的模型，并已经证明可用于评估抗HBV剂。已经证明该模型是针对慢性HBV感染的疗法的抗病毒活性的有效预测方法，并且该模型已经用作评估核苷及它们的类似物的安全性的灵敏系统。

每日一次以0.01到10mg/kg/天口服给予旱獭L-dC，共28天。在药物处理的28天和处理后随访的56天期间，通过DNA斑点杂交(检测限为约107基因组当量(geq)/mL血清)和定量PCR(检测限为300geq/mL血清)(1)测定WHV DNA的血清水平。WHV DNA复制在头几天受到显著抑制，并在整个治疗阶段维持。每日一次口服给予L-dC产生强烈的抗病毒作用，根据DNA斑点杂交测定的检测，所述抗病毒效应依赖于剂量(图16)。

图17展示在慢性乙型肝炎感染的旱獭模型中，L-dC对以10mg/kg/天处理28天的个体动物的抗病毒活性。值得注意的是，根据定量PCR测定，在L-dC 10mg/kg/天处理组中，从第14天到第28天，病毒载量从基线降低2-6个log。停药后，病毒反跳在第1周到第2周之间达到接近治疗前的水平。

在拉米夫定处理组(10mg/kg/天，口服)中，HBV病毒载量降低约0.5个log到1.0个log(geq/mL；数据未显示)，该结果与以前使用相似浓度拉米夫定(一种胞苷核苷类似物)的研究一致(30)。

实施例31：L-dC处理细胞中的病毒反跳

停药后，在L-dC处理的2.2.15细胞中出现病毒反跳。HBV复制在处理后18天回到处理前水平的50％。L-dC处理后病毒反跳的动力学提示：停药后显著的抗病毒作用持续，这与L-dC-TP的细胞内半衰期(在HepG2细胞中是15.5小时)一致。

实施例32：L-dC对抗药性HBV的抗病毒活性

在拉米夫定(每日一次100mg)的受控临床研究中，将拉米夫定给予感染HBV的患者，YMDD突变HBV的患病率(prevalence)在第一年治疗后占14到32％，在治疗两到三年后达到58％(18-20)。证据表明治疗效果与用拉米夫定治疗没有YMDD突变的患者相比下降，突变病毒与此有关。

从接受拉米夫定但显示重建HBV复制迹象的患者获得的病毒分离物的基因型分析提示：HBV对拉米夫定敏感性下降与导致下面结果的突变有关：HBV聚合酶催化结构域YMDD基序中从甲硫氨酸到缬氨酸或异亮氨酸的取代(552位)以及在位528从亮氨酸到甲硫氨酸的取代。

包含所述YMDD突变的HBV重组子抗拉米夫定，并且在体外复制能力比野生型HBV稍有下降(21)。测试L-dC的三磷酸酯衍生物对抗野生型和突变HBV DNA聚合酶，比较它们的IC50值。此外，进行L-dC对抗拉米夫定HBV分离物和在位552和528有突变的重组蛋白的抗病毒测试。

此外，还正在考虑在慢性处理感染WHV的旱獭期间体内筛选抗L-dC药物的HBV突变体。在旱獭体内模型中筛选抗药性突变体的相关性是不确定的，因为在旱獭中抗拉米夫定突变体的谱不匹配在感染HBV的患者体内鉴定出的突变体谱(20-22)。该长期研究(12到24个月)的一个部分能够提供治疗相关的从感染肝细胞中排除HBV共价闭合环状(ccc)DNA的信息。目前不可能使用DHBV体外模型来筛选抗药突变，因为在该模型中使用的初级鸭肝细胞不能在细胞培养物中维持到选择抗药性病毒所需的持续期。

实施例33：L-dT+L-dC的组合抗病毒活性和细胞毒性

在2.2.15细胞中测试大致等摩尔比例L-dT和L-dC组合的抗HBV活性和细胞毒性，发现在比例1∶1、1∶3和3∶1时存在协同效应(见表25)。

表25 L-dT+L-dC在感染HBV的2.2.15细胞中的组合抗病毒活性

处理	CC₅₀ ^a(μM)	EC₉₀ ^b90(μM)	S.I.^c(CC₅₀/EC₉₀)	CalcuSyn分析^d(在EC₉₀)
处理	CC₅₀ ^a(μM)	EC₉₀ ^b90(μM)	S.I.^c(CC₅₀/EC₉₀)	CalcuSyn分析^d(在EC₉₀)	3TCL-dTL-dCL-dT+L-dC(1∶1)L-dT+L-dC(1∶3)L-dT+L-dC(3∶1)L-dT+3TC(1∶1)L-dT+3TC(3∶1)L-dT+3TC(10∶1)L-dC+3TC(1∶1)L-dC+3TC(3∶1)L-dC+3TC(10∶1)	＞100030223000±96＞15001331±672957±88＞1000＞1000＞1000＞1000＞1000＞1000	0.180±0.0071.2±0.11.1±0.10.297±0.0160.333±0.0230.409±0.0790.089±0.0040.068±0.0040.191±0.0170.200±0.0130.216±0.0130.084±0.006	＞5,0002,5182,727＞5,0513,9977,230＞11,00014,706＞5,000＞5,000＞5,000＞11,000	--协同协同协同协同协同协同协同(在高浓度为相加性)协同协同

a CC₅₀＝观察到抑制50％中性红染料摄取(与未处理培养物相比)的药物浓度。

b EC₉₀＝观察到HBV病毒体DNA水平降低10倍(与未处理培养物相比)的药物浓度。

c由于在该测定系统中低于三倍的HBV DNA水平降低一般在统计学上不显著，因此使用EC₉₀值计算选择系数(S.I.)。

d通过CalcuSyn组合评估程序(Biosoft，Inc.)分析药物联合治疗的有效性。

实施例34：L-dC的人骨髓祖先细胞毒性测定

某些核苷类似物的骨髓抑制效应已经突出了在克隆原(clonogenic)测定中测试对人骨髓祖先细胞生长的潜在效应的需要。具体而言，贫血和中性白细胞减少症是与抗HIV药物齐多夫定(ZDV)有关的最常见药物相关临床毒性。该毒性已经在从健康志愿者获得的骨髓细胞的体外测试中模型化(Sommadossi J-P，Carlisle R.“3′-叠氮-3′-脱氧胸苷和9-(1，3-二羟基-2-丙氧基甲基)鸟嘌呤对正常人造血祖先细胞的体外毒性”Antimicrob Agents Chemother 1987，31(3)，452-454)。已经显示ZDV在临床相关浓度为1-2μM时直接抑制人粒细胞-巨噬细胞克隆形成(CFU-GM)和红细胞(erythroid)爆破形成(BFU-E)活性。使用人骨髓克隆基因测定，用ZDV作为阳性对照，拉米夫定作为阴性对照，L-dC在CFU-GM和BFU-E中的IC₅₀＞10μM(见表26)。

表26 L-dC在粒细胞巨噬细胞祖先细胞和红细胞前身细胞中的骨髓毒性

化合物	CFU.GM^aIC₅₀(μM)	BFU-E^aIC₅₀(μM)
化合物	CFU.GM^aIC₅₀(μM)	BFU-E^aIC₅₀(μM)	L-dC拉米夫定ZDV	＞10＞101.8	＞10＞100.7

a.该值代表一式三份进行的三个独立实验的结果。

实施例35：L-dC的线粒体毒性

已经将批准用于HIV治疗的抗病毒核苷类似物如ZDV、司他夫定(d4T)、去羟肌苷(ddI)和扎西他宾(ddC)与临床有限的延迟中毒如周围神经病、肌病和胰腺炎联系起来(8-11)。人们已经将这些临床不利事件归因于线粒体DNA(mtDNA)含量减少和核苷类似物掺入mtDNA所引起的线粒体功能抑制。此外，一种特定的核苷类似物非阿尿苷(FIAU)由于直接产生线粒体毒性而导致肝衰竭、胰腺炎、神经病、肌病和乳酸性酸中毒。药物相关的乳酸产生增加可以被认为是线粒体功能或氧化磷酸化受损的标志。

为评估L-dC产生线粒体毒性的潜力，使用人肝细胞瘤细胞系HepG2进行几个体外研究。这些研究包括分析乳酸产生、mtDNA含量和测定线粒体超微结构形态学变化(如嵴损失、基质分解和肿胀以及形成脂滴)。L-dC对线粒体的效应展示于表27。

在用L-dC慢性处理的细胞和未处理的细胞中产生的乳酸水平上没有观察到差异。与媒介物对照相比，在用ZDV和FIAU处理的细胞中的乳酸产生增加100％。HepG2细胞暴露于高达10μM浓度L-dC14天对于线粒体DNA含量没有作用，而在ddC处理的细胞中该含量降低87％。HepG2细胞暴露于10μM L-dC 14天后，通过透射电子显微术检查HepG2细胞的超微结构，尤其是线粒体。没有检测到细胞结构或线粒体形态学上的可辨别变化。线粒体嵴的尺寸和组构是正常的。ZDV处理的细胞显示损失嵴的典型肿胀线粒体。在ddC和FIAU处理的细胞中线粒体形态学也是不正常的。

表27 L-dC对HepG2细胞中肝细胞增殖、线粒体功能和形态学的作用

化合物	CC₅₀ ^a(μM)	浓度(μM)	对照的％		脂滴形成	线粒体形态学
			对照的％				L-乳酸	mtDNA
			对照L-dCFIAUZDVddC	-＞200041420			L-乳酸	mtDNA	-1010501	100101±2203239±3495±4.4	100107±88611913	无无有无无	正常正常不正常不正常不正常

a.处理14天之后的CC₅₀。

实施例36：L-dC的α、β和γ人DNA聚合酶毒性测定

核苷和核苷类似物在细胞内通常代谢为它们的TP衍生物。细胞DNA聚合酶一般负责正常核和线粒体DNA合成和修复。因为TP代谢物是DNA聚合酶的潜在底物，所以进行研究以确定L-dC-TP是否抑制人DNA聚合酶。

核苷类似物3′-氨基-3′-脱氧胸苷(AMT)TP在浓度10μM时抑制人DNA聚合酶达30％。ddC-TP分别抑制β和γ人DNA聚合酶达50％(5μM)和35％(2.5μM)。L-dC-TP和L-dU-TP直到浓度100μM都不抑制α、β和γ人DNA聚合酶(表28)。这些结果提示：L-dC和L-dU的TP对这些核和线粒体人DNA聚合酶有低亲和力，这与体外和体内观察到的L-dC的良好安全性模式一致。

表28 L-dC-TP对肝炎病毒DNA聚合酶以及α、β和γ人DNA聚合酶的作用

底物^a	IC50(μM)
	IC50(μM)				病毒DNA聚合酶^b	人DNA聚合酶α^c	人DNA聚合酶β^c	人DNA聚合酶γ^c
	L-dC-TPL-dU-TP拉米夫定-TP^dL-FMAU-TP^dL-ddA-TP	1.82±0.235.26±2.40.50±0.10.15±0.052.0±0.3	＞100＞100＞5＞50＞100	＞100＞1001.2＞50＞100	病毒DNA聚合酶^b	人DNA聚合酶α^c	人DNA聚合酶β^c	人DNA聚合酶γ^c	＞100＞1000.01＞50＞100

a.每组数据代表算术平均值和三个独立实验的标准差(如果有的话)。

b.WHV DNA聚合酶。

c.3′-氨基-3′-脱氧胸苷TP在10μM时抑制聚合酶α达30％；ddC-TP在5mM时抑制聚合酶β达50％，在3.5μM时抑制聚合酶γ达35％。

d.对拉米夫定-TP和L-FMAU-TP的人DNA聚合酶数据分别来自Chang等(13)和Yao等(14)。

实施例37：dival-L-dC在大鼠中的毒性测定

在大鼠中测定与单剂口服剂量dival-L-dC有关的毒性。研究总共40只动物(Sprague-Dawley大鼠，六到八周龄)；随机组成每组10只动物(五只雄性，五只雌性)，每组接受选自本研究剂量范围(dose-range finding portion)的三种剂量之一(500，1000或2000mg/kg)的单剂口服剂量dival-L-dC或对照物。观察动物15天。一天两次记录从笼侧观察的动物濒死状态和死亡率。在第1、8、14和15天一天两次记录临床观察和体重。同时在第15天，收集用于血液学和血清化学研究的血液样品。完成15天的评估后，无痛致死所有动物，进行完全的总尸体剖检，包括肉眼检查身体外表面、所有孔以及颅腔、胸腔和腹腔及它们的内容物。并记录体重、选定器官重量、器官重/体重比例和器官重/脑重比例。

在研究期间没有观察到明显的毒性，没有观察到对体重、器官重量或临床病理学参数的处理相关影响。在血清学或血液化学模式中没有观察到与处理相关的异常。此外，在尸体剖检中没有观察到与处理有关的肉眼可见损害。根据本研究的结果，dival-L-dC在大鼠中单剂口服剂量给予后的NOAEL是2000mg/kg。

实施例38：dival-L-dC在猴中的毒性测定

测定五个逐步提高的dival-L-dC剂量在猕猴中的潜在毒性。四只动物(两只雄性，两只雌性)每只分别在第1、4、7、10和14天接受总共五剂dival-L-dC口服剂量，每个剂量水平(20，100，500，1000和2000mg/kg)一只动物。

一天两次记录从笼侧观察的动物濒死状态和死亡率。每天记录临床观察。第1、4、7、10和14天处理前以及第17天尸体剖检前收集用于血清学和血清化学研究的血液样品并测量体重。完成17天的评估后，无痛致死所有动物，进行完全的总尸体剖检，包括肉眼检查和全面(comprehensive)收集组织。

没有观察到与处理有关的临床异常。在第1天接受初始剂量后，每只动物损失体重约0.6kg。从第4天到研究的剩余时间内，所有动物保持体重。

在个体血清学模式中，注意到下面观察。在第17天，所有四只动物体内的红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)和血细胞比容(HCT)与第1天获得的值相比下降(累积从约15％到27％)。除第1001号动物(雄性)外，这些参数在每个时间点从前一记录值的变化＜10％。对于第1001号动物，第4天RBC、HGB和HCT值从第1天的值下降约18％；随后，该动物的总体变化＜±9％。导致所述初始改变的原因仍然未知，其毒理学意义不确定。在第1天，第1001号动物(雌性)体内白细胞计数(WBC)显著提高(雌性，36.3×10³细胞/μl)，但在第4天降低约55％。第4天多形核白细胞绝对值(APLY)和多形核白细胞百分率(PLY)也比第1天升高的水平降低(分别降低73％和40％)。在研究的剩余时间内这些变化是可变的。毒理学相关性不确定。

在个体血清化学模式中注意到下面观察。所有四只猴体内第17天血尿素氮(BUN)值与第1天的值相比降低(累积降低约43％)。这些累积变化来自从-39％到+46％的间(interim)变化。这些变化在研究的所有猴中一致；然而，毒理学相关性不确定。

根据本研究的结果，对猴通过管饲法单剂口服剂量给予dival-L-dC的NOAEL是2000mg/kg。

实施例39：L-dC在旱獭中的28天毒性测定

慢性乙型肝炎感染的旱獭模型对于核苷类似物的临床前毒理学评估是有价值的。该模型鉴定了FIAU在人体内引起的延迟严重肝细胞毒性，而该毒性在啮齿动物或灵长类动物的临床前评估中未发现。在旱獭中观察的FIAU诱导的毒性(包括体重显著下降、消瘦以及在肝活组织检查时观察到的肝细胞损害)经鉴定，从处理开始后六到八周开始，并且类似于在FIAU处理的感染HBV的患者中观察到的毒性。

测定感染旱獭肝炎病毒(WHV)的旱獭体内L-dC的抗病毒活性和安全性以及处理后病毒反跳。雄性和雌性旱獭在新生儿时期皮下接种WHV载体的稀释血清，这些动物都是WHV的慢性携带者。根据体重、g-谷氨酰转移酶(GGT)水平、性别和采用定量斑点分析测量的血清WHV DNA浓度(＞1011基因组当量/mL血清)，将动物(16到18月龄)随机化分成可比较的组。

三只动物每只口服接受L-dC剂量0.01、0.1、1.0或10.0mg/kg/天28天。此外，三只动物口服接受拉米夫定剂量10mg/kg/天共28天。四只动物按照同样方案接受媒介物对照。处理后继续检测所有动物体内WHV反跳56天。在第-7、0、1、3、7、14、21和28天获取检测WHV DNA水平的血液样品，在第1、3、7、14、28和56天处理后测定WHV DNA水平。使用聚合酶链反应(PCR)技术检测WHV DNA水平。同时获取体重并据此调整药物剂量。假如观察到毒性的临床证据，将进行临床生物化学和血清学测试。对研究期间死亡的一只动物要进行死后检查，包括对组织的组织学评估。

在四周处理期或八周处理后随访期没有观察到毒性。此外，任何L-dC处理组与对照动物相比没有体重损失(图18)。在84天治疗方案期所有动物以类似于对照动物的方式增重。处理结束后0.1mg/kg/天组的一只动物(#98051)在第八天死亡。死后检查揭示在肝左侧叶内有一个大肝瘤(8×5×2cm)，其死亡被归因于肝恶性肿瘤。在该模型中早至九月龄就观察到肝细胞瘤，并且肝细胞瘤是早至15月龄的死因。该动物的死亡被归因于肝细胞瘤，这是WHV感染自然病史的预期部分，由于没有迹象表明药物毒性是该动物死亡的因素，因此其死亡被认为与L-dC处理无关。

实施例40：旱獭中L-dC的十二周毒性测定

测定L-dC在旱獭中的抗病毒活性和安全性。在该研究中，四只动物每只口服接受L-dC 1.0mg/kg/天或媒介物对照12周。其它四只接受L-dC以及另一种核苷类似物L-dT。所述动物根据性别、重量以及治疗前血清WHV DNA和GGT水平随机化分为可比较的组。

在第0、1、3、7、14、21、28、42、56和84天以及第7、14、21、28、42、56、70和84天处理后测量WHV DNA和体重。通过定量PCR测定WHV DNA水平。在处理前和第84天收集用于血液学、血清化学、WHV血清学和肝活组织检查的合适样品。从第0、14和84天给药后2.5小时收集的样品测定血浆药物水平。

动物对L-dC(1mg/kg/天，口服)耐受良好，并且L-dC(1mg/kg/天，口服)在12周处理期内和12周随访期内没有药物相关毒性。用L-dC(1mg/kg/天，口服)处理12周的慢性感染旱獭体内的WHV病毒血症在12周处理结束后降低0.5到1个log，类似于28天研究该剂量的反应。该研究包括其它用L-dT 1mg/kg/天以及L-dC(1mg/kg/天)加L-dT(1mg/kg/天)联合给药处理的组。所述L-dC和L-dT的组合降低病毒载量到检测限，这类似于在28天研究中用L-dC或L-dT以10mg/kg/天处理期间观察到的结果。在L-dC处理组动物和对照组动物的重量之间没有差异(见图19)。一只对照组的动物在第8周死亡；尸体剖检揭示死因是主动脉变性和破裂。虽然这是不寻常的，但对未感染旱獭和感染WHV的旱獭的组织学检查观察到升主动脉的自发性破裂。所有动物的体重在24周研究期间轻度减少。以前经验认为所述体重的轻度减少是由于冬眠循环(hibernation cycle)的方法(B.Tennant，DVM；Marmotech，Inc.)。在12周处理前和处理后，所有动物的血清化学和血液学在正常范围内。根据显微镜检查评估，所有组的肝组织的组织形态学正常。没有脂肪变化的迹象(微血管脂肪变性)。

实施例41：dival-L-dC在猕猴体内的重复剂量毒理动力学

测定dival-L-dC口服给予猕猴25天的潜在毒性和药代动力学。八只动物(四只雄性，四只雌性)通过管饲法每日一次接受dival-L-dC三种剂量(500、1000或2000mg/kg)中的一种或媒介物对照，共25天(总N＝32)。每日两次记录由笼侧观察动物濒死状态和死亡率的结果，每日一次记录临床观察。在第1、8、15和25天处理前以及第26天尸体剖检前记录体重。每日记录食物消耗，每周报告该周的日平均值。在处理前和尸体剖检时进行身体检查和眼科检查以及尿分析。完成26天评估后，无痛致死所有动物，进行完全的全面尸体剖检，包括肉眼检查身体外表面、所有孔以及颅腔、胸腔和腹腔及它们的内容物。并记录体重、选定器官重量、器官重/体重比例和器官重/脑重比例。由委员会认证(board-certified)的兽医病理学家对全面尸体剖检获得的组织进行组织形态学评估。

A.体重

除第2002号动物(500mg/kg组)以及4001号和4003号动物(2000mg/kg组)外，所有动物在研究期间或者保持体重，或者增加体重，所述三只动物在第25天体重减少0.1kg(与第1天相比)。由于对照组动物研究前平均体重大于处理组平均体重0.13-0.25kg，因此并不认为对照雄性和dival-L-dC处理组雄性之间的统计学显著差异是毒理学相关的。

B.食物消耗

研究期间，所有动物保持足够食物消耗，食物消耗的变化在预期之内。下面组在下面时间的平均饼干消耗少于对照雄性：500mg/kg组雄性在第8/9、15/16和16/17天；1000mg/kg组在第24/25天；2000mg/kg组在第8/9、15/16、16/17、20/21和23/24天。雌性中观察到的唯一差异是2000mg/kg组雌性在第7/8天食物消耗降低。并不认为这些差异是毒理学相关的。

C.临床病理学

血液学。第1天开始处理前，对照组和处理组的任何血液学参数都没有差异。在第26天，观察到红细胞指数的多种统计学显著差异，包括红细胞计数(RBC)降低(所有处理雌性)、血红蛋白(HGB)降低(所有处理雄性)和红细胞比容(HCT)降低(所有处理组，雄性和雌性)。雄性还显示RBC降低，但差异在统计学上并不显著。处理雌性体内血红蛋白浓度降低，但在统计学上并不显著。对照和dival-L-dC处理雄性和雌性在第26天的RBC、HGB和HCT与第1天相比降低。然而，在对照动物中观察到的相对降低少于在dival-L-dC处理动物中观察到的相对降低。这些结果指示出临床相关的非溶血性贫血；然而，任何剂量反应现象都是较小的，并且组织病理学评估提示骨髓保持反应性。因此，认为任何进行性效应或永久性效应是不可能的。

在白细胞计数中，多形核白细胞绝对值(APLY)减少(500MG/KG组和1000mg/kg组雌性和2000mg/kg组雄性和雌性)，多形核白细胞百分率(PLY)减少(1000mg/kg组和2000mg/kg组雌性)，淋巴细胞百分率(LYM)增加(2000mg/kg组雄性以及1000mg/kg组和2000mg/kg组雌性)。

血清化学。在第26天，所有处理雄性的平均碱性磷酸酶(ALK)水平比雄性对照组平均ALK显著更低。在第26天2000mg/kg组雄性的平均球蛋白(GLOB)和钙(CAL)水平升高。并不认为这些变化是临床相关的。1000mg/kg组和2000mg/kg组雄性的平均钾(K)值比对照组更高，并且可能与那些处理组中观察到的非溶血性贫血相关。第26天雌性体内的任何血清化学参数没有变化。

尿分析。2000mg/kg组雄性以及1000mg/kg组和2000mg/kg组雌性的平均尿pH轻度降低，但所述差异在统计学上并不是显著的。值得注意的是，与尿的酸化一致，高剂量雄性和雌性的尿中缺少结晶。

D.器官重量

注意到1000mg/kg组和2000mg/kg组雄性的肺(绝对值)以及2000mg/kg组雄性的相对胸腺(胸腺：脑)的器官重量在统计学上显著降低。然而，并不认为这些差异是毒理学相关的。

E.病理学

肉眼检查。没有被解释为与给予dival-L-dC有关的肉眼发现。所有肉眼发现是典型的非人类灵长类中普遍存在的偶然发现。

显微镜检查。胸腺萎缩是唯一解释为处理相关发现的镜检发现。胸腺萎缩的发生率和严重性在1000mg/kg组和2000mg/kg组雄性和雌性中增加，但在500mg/kg组动物中不受影响。然而，胸腺萎缩的临床显著性被解释为意义不明确的。所述剂量-反应关系不强，并非所有1000mg/kg组和2000mg/kg组雄性都受影响，而胸腺萎缩一般出现在灵长类动物衰老时。该研究中的其它镜检发现是常见的不严重的炎症或在这个年龄的灵长类动物中观察到的一般类型和发生率的退行性变化。

毒理动力学。第1天处理前和第26天尸体剖检前收集用于血液学和血清化学的血液样品。在第25天给药后下面每个时间点从每只动物收集用于药代动力学分析的血液样品：0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时。从血液制备血浆，分析dival-L-dC和三种代谢物的浓度：L-dC、L-dU和dival-L-dC的部分去酯化形式β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯。仅定量L-dC和β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯。1000mg/kg组和2000mg/kg组的平均血浆浓度-时间数据使用WinNonlin 1.5(200型)进行非区室药代动力学分析。对500mg/kg组的分析正在进行中。

第25天口服给予dival-L-dC后1小时(平均T_max)，β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的血浆浓度达到最大值(C_max)，而L-dC的平均T_max是2-4小时。然而，β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的C_max值比L-dC的C_max值低约2个数量级。每组的L-dC浓度达到C_max后，以表观二阶指数的方式降低。两个剂量组中雄性和雌性的预计末期平均半衰期是约4-5小时。然而，这些半衰期估计值应当被视为最小值，因为大多数个体估计值基于给药后6小时到12小时的数据，而在该时间可能还未完全表现末期特征。平均β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯浓度达到C_max后也降低，但没有充分定义末期以估计半衰期。每个剂量组内雄性和雌性的L-dC和β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的平均C_max值相似，只是1000mg/kg组雄性除外，1000mg/kg组雄性体内所述浓度比2000mg/kg组雄性的所述浓度低一半。因此，C_max看起来仅在1000mg/kg组雄性中随剂量增加。

雄性和雌性L-dD AUC_last之间的比较显示类似于针对C_max所观察到的趋势，其中1000mg/kg组内雄性的值比2000mg/kg组雄性的AUC_last值约低一半。雄性和雌性β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯AUC_last之间的比较显示性别之间没有差异，AUC_last看起来以与剂量直接成比例的方式提高。

数据提示：dival-L-dC在口服给予后快速转化成dival-L-dC的去酯化形式β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯，然后转化成L-dC，但L-dC的总暴露是β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的100倍。代谢物β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的总暴露看起来以与剂量增加近似成线性的方式增加。

表29展示毒理动力学结果的综述。

表29 对猴口服给予重复剂量dival-L-dC 1000mg/kg和2000mg/kg的药代动力学分析

剂量(mg/kg/天)	性别	(n)	药代动力学参数¹
			药代动力学参数¹				C_max(mg/mL)	T_max(小时)	T_last(小时)	AUC_last(mg-小时/mL)	AUC(mg-小时/mL)	t_1/2(小时)
			1000100020002000	MFMF	(4)(4)(4)(4)	L-dC				AUC_last(mg-小时/mL)	AUC(mg-小时/mL)	t_1/2(小时)
66.7(±29.1)106(±39)116(±13)103(±12)	2242	12121224				L-dC				273(±107)429(±19)668(±127)567(±208)	295(±110)468(NA)726(±114)598(±220)	4.1(±1.8)3.7(NA)3.8(±1.3)5.1(±1.7)

剂量(mg/kg/天)	性别	(n)	药代动力学参数¹
			药代动力学参数¹				C_max(mg/mL)	T_max(小时)	T_last(小时)	AUC_last(mg-小时/mL)	AUC(mg-小时/mL)	t_1/2(小时)
			1000100020002000	MFMF	(4)(4)(4)(4)	β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯				AUC_last(mg-小时/mL)	AUC(mg-小时/mL)	t_1/2(小时)
0.624(±0.273)1.23(±0.25)1.64(±0.42)1.29(±0.28)	1111	54108				β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯				1.46(±0.45)1.90(±0.41)3.66(±0.88)3.67(±0.42)	IDIDIDID	IDIDIDID

1 第25天的平均值(+SD)。

2 对于L-dC和β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的所有参数，n＝4，以下例外情况除外：对于2000mg/kg组雌性，n＝3；对于L-dC AUC和t_1/2、1000mg/kg组雌性，由于末期特征没有充分表现，n＝2。

3 T_max和T_last的中值(不是平均值)。

NA 不可应用。

ID 没有充分数据定义所有动物的末期。

实施例42：dival-L-dC在大鼠中的重复剂量毒理动力学

测定dival-L-dC口服给予大鼠28天的潜在毒性和药代动力学。二十只动物(十只雄性，十只雌性)通过管饲法每日一次接受dival-L-dC三种剂量(500、1000或2000mg/kg)中的一种或媒介物对照，共28天。每日两次记录由笼侧观察动物濒死状态和死亡率，每日一次记录临床观察。在第1、8、15、22和28天给药前以及第29天尸体剖检前记录体重。每周记录食物消耗。第29天尸体剖检前收集用于血液学和血清化学的血液样品。完成29天评估后，无痛致死所有动物，进行全面的总尸体剖检，包括肉眼检查身体外表面、所有孔以及颅腔、胸腔和腹腔及它们的内容物。并记录体重、选定器官重量、器官重/体重比例和器官重/脑重比例。由委员会认证的兽医病理学家对全面总尸体剖检获得的组织进行组织形态学评估。

A.体重

2000mg/kg组雄性第22天和第28天的平均体重值显著低于雄性对照组的平均值。2000mg/kg组雌性第28天的平均体重值也显著低于对照组雌性的平均值。

B.食物消耗

2000mg/kg组雄性在研究期间食物消耗降低。另外，1000mg/kg组雄性在研究第三周期间食物消耗显著低于对照组雄性。1000mg/kg和2000mg/kg雌性在研究第二周、第三周和第四周期间食物消耗显著降低。

C.临床病理学

血液学。第29天，观察到红细胞指数的许多统计学显著差异。所有三个剂量水平(500、1000和2000mg/kg)的雄性和雌性的红细胞计数(RBC)显著降低。2000mg/kg组雄性、1000mg/kg组雌性和2000mg/kg组雌性的血红蛋白浓度(HGB)显著降低。在1000mg/kg组和2000mg/kg组雄性和雌性中观察到红细胞比容(HCT)降低。在500、1000和2000mg/kg组雄性以及500和1000mg/kg组雌性中平均细胞体积(MCV)显著增加。在500、1000和2000mg/kg组雄性和雌性中平均细胞血红蛋白(MCH)显著增加。在1000mg/kg雌性中平均细胞血红细胞蛋白浓度(MCHC)增加。带核的红细胞计数(NRC；绝对值和相对值)在1000mg/kg和2000mg/kg雄性中降低，在2000mg/kg雌性中增加。这些变化表明治疗相关的轻度反应性贫血(mildresponsive anemia)。

在2000mg/kg雄性中白细胞计数(WBC)降低。在2000mg/kg组雄性中单核细胞(MNO；绝对值和百分率)降低。2000mg/kg雄性中血小板(PLT)增加。然而，这些变化数量小，毒理学相关性不确定。

血清化学。在第29天，2000mg/kg组雄性和1000mg/kg组雌性中平均球蛋白(GLOB)水平降低。在1000和2000mg/kg组雄性和1000mg/kg组雌性中白蛋白/球蛋白比例上升。在500mg/kg组雌性中碱性磷酸酶(ALK)水平提高。在1000mg/kg雌性中胆固醇(CHOL)水平增加。这些较小变化并不形成剂量-反应相关模式或趋势以提示这些值是毒理学相关的。

D.器官重量

观察到肺(2000mg/kg组雄性和雌性)以及胸腺(2000mg/kg组雄性、1000mg/kg组雌性和2000mg/kg组雌性)的绝对器官重量显著降低。2000mg/kg组雄性中前列腺和精囊的平均绝对器官重量也显著降低。1000mg/kg和2000mg/kg组雌性中的平均绝对心脏重量降低。2000mg/kg组雌性中唾液腺平均重量降低。2000mg/kg组雌性中平均脾重量增加。

相对(与体重相比)器官重量变化包括2000mg/kg组雄性和雌性中脑重量增加。还观察到1000mg/kg和2000mg/kg组雄性的平均睾丸重量增加。2000mg/kg组雄性以及1000mg/kg和2000mg/kg组雌性中相对胸腺重量降低。2000mg/kg组雌性中平均相对脾重量增加。

此外，相对(与脑重量相比)器官重量变化包括2000mg/kg组雄性中相对肺重量降低。在1000mg/kg和2000mg/kg组雄性和雌性中相对胸腺重量降低。在2000mg/kg组雄性中相对前列腺和精囊平均重量也降低。在2000mg/kg组雌性中，平均相对心脏重量降低，平均唾液腺相对重量降低。在2000mg/kg组雌性中，相对脾重量增加。

器官重量减少(胸腺、肺、心脏、唾液腺、前列腺、精囊和脑)被解释为从属于1000mg/kg和2000mg/kg组动物中出现的普遍体重损失。在1000mg/kg和2000mg/kg组动物中镜检观察到的胸腺萎缩与所观察到的胸腺重量减少一致。其它损失重量的组织在镜检中没有相互关联。脾重量增加被解释为是镜检所观察到的红细胞生成活性的结果。

E.病理学

显微镜检查。胸腺萎缩和淋巴组织坏死(lymphoid necrosis)的发生率在1000mg/kg组和2000mg/kg组动物中增加，但在500mg/kg组动物中不受影响。然而，因为剂量-反应关系不强，胸腺萎缩和淋巴组织坏死的临床显著性被解释为意义不明确的。此外，这些胸腺变化常常表现为受到各种因素胁迫的动物中出现的非特异性变化，在本研究中在1000mg/kg和2000mg/kg组动物中观察到显著的体重下降。

在1000mg/kg和2000mg/kg组雄性和雌性中脾内红细胞生成的增加足以将它们与对照区别开来，但500mg/kg组动物的脾与对照类似。在2000mg/kg组雄性和雌性中肝内肝细胞生成的增加足以将它们与对照区别开来，但500mg/kg和1000mg/kg组动物的肝与对照类似。在2000mg/kg组雄性和雌性中观察到胸骨骨髓增生。脾内红细胞生成、肝内肝细胞生成增加和骨髓增生都被解释为所观察到的轻度贫血(血液学结果的一部分)的预期和适当反应。这些结果符合持续治疗期间贫血的反应性质。

该研究中有几项其它显微镜检查所观察到的变化。这些变化是在啮齿动物管饲法研究中观察到的常见的不严重的炎症或一般类型和发生率的退行性变化。

毒理动力学。第1天和第28天收集另外54只动物(27只雄性和27只雌性)用于药代动力学分析的样品。在这两天，在下面六个时间点收集样品(每个时间点两只动物轮换)：给药后0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时和24小时。从血液制备血浆，分析dival-L-dC和三种代谢物的浓度：L-dC、L-dU和dival-L-dC的部分去酯化形式β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯。仅定性L-dC和β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯。1000mg/kg组和2000mg/kg组的平均血浆浓度-时间数据使用WinNonlin 1.5(200型)进行非区室药代动力学分析。对500mg/kg组的分析正在进行中。

1000mg/kg剂量组中代谢物L-dC的平均血浆浓度在给药后2小时(T_max)达到最高值(C_max)，2000mg/kg剂量组中该浓度在给药后1-4小时达到最高值。1000mg/kg和2000mg/kg剂量组每一组内雄性和雌性的平均C_max值相似，并且两个组内第28天与第1天的该值近似。C_max在大多数情况下随剂量增加，但增加程度各异。每一组的L-dC浓度达到C_max后，以表观二阶指数的方式下降。1000mg/kg剂量组的预计末期半衰期(9-17小时)倾向于比2000mg/kg剂量组的半衰期(6-8小时)更长，但应该小心解释所述半衰期。半衰期的估计仅需要使用三个数据点，而数据是易变的。此外，所使用的三个数据点中的一个是在4小时，在该时间末期可能还未确立。所有数据组中L-dC浓度的T_last出现在24小时。每组内雄性和雌性的AUC_last相似，并且该值在第28天与第1天相比看起来没有实质上的不同。虽然如上面所观察到的，L-dC的C_max看起来并不随dival-L-dC的剂量增加以一致的方式增加，但L-dC的AUC_last随dival-L-dC以看起来与剂量近似成比例的关系增加。

β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的血浆平均浓度在给药后1到2小时(T_max)达到最大值(C_max)。每一剂量组内雄性和雌性的平均C_max值相似，而雌性的值更高。除2000mg/kg组外，每一组雌性在第1天和第28天的C_max值比雄性约高14％到50％，而2000mg/kg组雌性的β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯C_max值在第28天比雄性高约164％。当在每种性别内比较值时，除2000mg/kg组外第28天的C_max值与第1天相似，2000mg/kg组中第28天的C_max值比第1天高130％。在每种情况下C_max随剂量增加，但其比例因子一般与剂量不是线性比例关系。

β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的表观末期清除期没有很好地鉴定，因此没有报告半衰期。β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的T_last在1000mg/kg剂量组中出现出现在4-8小时，在2000mg/kg剂量组中出现在8-24小时。如对C_max观察到的，雌性的AUC_last比雄性高25％到50％。雄性和雌性在第28天的AUC_last一致地比第1天轻度提高(30％到62％)。AUC_last随剂量增加而提高，其关系看起来与剂量大致成线性比例。

这些数据提示：L-dC和β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯相当快速地进入系统循环。L-dC的总暴露根据C_max测量比β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的总暴露高10到40倍，根据AUC_last测量则高35到80倍。在1000-2000mg/kg/天的剂量范围内，暴露看起来与剂量成比例地增加。L-dC在第29天的总暴露与第1天观察到的总暴露相似，而β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的暴露在第28天一般更大，这提示β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯的积累可能发生在重复给药之后。

表30展示毒理动力学结果的综述。

表30 对大鼠口服给予单剂和重复剂量dival-L-dC 1000mg/kg和2000mg/kg的药代动力学分析

剂量(mg/kg/天)	天	性别	药代动力学参数¹
			药代动力学参数¹						C_max(μg/mL)	T_max(小时)	T_last(小时)	AUC_last(μg·小时/mL)	AUC(μg·小时/mL)	t_1/2(小时)
			10001000100010002000200020002000	1128281282828	MFMFMFMF	L-dC						AUC_last(μg·小时/mL)	AUC(μg·小时/mL)	t_1/2(小时)
33.648.552.946.670.959.451.177.7	22222241	2424242424242424				L-dC						255239254239700461500578	363279334277478487550561	17.39.412.98.85.85.6NA8.5
33.648.552.946.670.959.451.177.7	22222241	2424242424242424				10001000100010002000200020002000	112828112828	MFMFMFMF	β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯
1.311.701.321.972.382.712.366.24	12222212	448488824	2.814.073.965.368.0910.211.016.5	IDIDIDIDIDIDIDID	IDIDIDIDIDIDIDID				β-L-2′-脱氧胞苷-5′-缬氨酸酯

NA＝不可应用；末期未充分表现特征。

ID＝没有充分数据定义所有动物的末期。

实施例43：鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)和大肠杆菌(E.coli)平板掺入突变测定(基因毒性)

dival-L-dC当口服给予动物时快速转化成L-dC，使得产生L-dC的高血浆浓度，而检测不到dival-L-dC。因此，使用L-dC进行体外致突变性研究。该研究按照FDA GLP规则进行。测试L-dC在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurirm strain)TA98、TA100、TA1535和TA1537株的组氨酸操纵子和大肠杆菌WP2uvrA株色氨酸操纵子引起突变的潜力。测试浓度为50、100、500、1000和5000mg/平板的L-dC以及阳性对照和阴性对照。测试菌株在缺乏外源激活以及存在诱导的大鼠肝S-9提取物加辅因子的情况下暴露于L-dC。温育约68小时后，评估L-dC和对照的每平板回复体数目和背景小菌落菌苔的完整性。

阴性对照和阳性对照符合测试要求。确定测定(definitive assay)和证实测定(confirmatory assay)的结果都表明：在存在或缺乏诱导的大鼠肝S-9提取物的情况下，L-dC并不诱导任何测试菌株的回复体数目的任何显著增加。根据该研究发现，得出结论：在鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌平板掺入突变测试中，L-dC浓度直到5000mg/平板对没有致突变性的迹象。

实施例44：染色体畸变测定

dival-L-dC当口服给予动物时快速转化成L-dC，使得产生L-dC的高血浆浓度，而检测不到dival-L-dC。因此，使用L-dC进行体外致突变性研究。该研究按照FDA GLP规则进行。测试L-dC在培养CHO细胞中引起染色体畸变的潜力。在确定测试中，在有或没有代谢激活的情况下，测试浓度为100、500、1000和5000mg/平板的L-dC以及阳性对照和阴性对照。连续处理18小时后，根据相对细胞生长(RCG)和相对有丝分裂指数(RMI)的降低测定毒性。根据RCG和RMI结果，从三个最高浓度(500、1000和5000mg/mL)计数染色体畸变。从每个浓度水平重复培养物(包括阳性对照和阴性对照)的每个平板计数一百个中期。

在没有激活仅采用1.0、10、100、500、1000和5000mg/ml浓度的L-dC进行确定测定。连续处理18小时后，测定RCG和RMI的降低。基于RCG和RMI的结果，从三个最高浓度(500、1000和5000mg/mL)计数染色体畸变。从每个浓度水平重复培养物(包括阳性对照和阴性对照)的每个平板计数一百个中期。

确定测定和证实测定的结果表明：与溶剂对照相比，在有或没有代谢激活的情况下，L-dC在任何测试浓度并不诱导携带畸变的细胞的百分率在统计学上显著增加(根据卡方检验，p值￡0.05确定)。根据所述研究结果，得出结论：在CHO测试中，暴露于L-dC直到浓度5000mg/mL后没有染色体畸变的迹象，不认为L-dC是一种诱裂剂。

实施例45：小鼠微核测定

dival-L-dC当口服给予动物时快速转化成L-dC，使得产生L-dC的高血浆浓度，而检测不到dival-L-dC。因此，使用L-dC进行体外致突变性研究。该研究按照FDA GLP规则进行。假定啮齿动物中口服生物利用度是10-20％(见Pharmacology and Toxicology，第8.1.7.3节)，暴露于L-dC(2000mg/kg剂量)将达到或超过400mg/kg。该暴露水平将超过预期人类暴露20到50倍。

在雄性和雌性小鼠的骨髓细胞中测定L-dC诱导微核多形核红细胞(MPCE)的潜力。测试浓度为500、1000和2000mg/kg的L-dC和阳性对照和阴性对照。通过单剂口服管饲法给予研究药物。给予L-dC或阴性对照约24和48小时后进行两次收获，给予阳性对照约24小时后进行一次收获。每个收获时间每个剂量组使用五只雄性小鼠和poly chromatic五只雌性小鼠。测定每个时间点的多染性红细胞(PCE)百分率和MPCE频率。

研究结果表明：与阴性对照相比，在任何时间点任何L-dC剂量组中的MPCE数目没有在统计学上显著增加(根据单尾斯氏t检验，p值￡0.025确定)。在每测试药物剂量水平的两个性别中，在24小时收获时间观察到PCE百分率比媒介物对照降低超过20％(雄性是-30.5％到-43.1％，雌性是-26.1％到-32.2％)，这是毒性的指征。该降低也表明将受试物适当暴露于耙组织。然而，在任何测试药物剂量水平的两个性别中，在48小时收获时间没有观察到上述超过20％的降低。

该研究表明：在测试条件下，根据评估测试结果所设的标准，L-dC在直到2000mg/kg的剂量对雄性或雌性动物的微核测定是阴性。

实施例46：毒理学发现的综合总结

使用常规的基于细胞的测定来评估L-dC和任何细胞代谢物的细胞毒性。L-dC对于人肝细胞瘤细胞系2.2.15是无细胞毒性的(50％细胞毒性浓度，CC₅₀，＞2000μM)，2.2.15细胞系常规用于测定可能的抗病毒剂的抗-I-IBV活性。L-dC对人外周血单核细胞没有细胞毒性(PBMC；CC₅₀＞100μM)，对于人骨髓祖先细胞没有细胞毒性(粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)和类红细胞爆破形成单位(BFU-E)测定，50％抑制浓度，IC₅₀，＞10μM)。

表31 L-dC的体外细胞毒性

细胞系^a	CC₅₀ ^b(mM)
细胞系^a	CC₅₀ ^b(mM)	2.2.15^cPBMC^dHFF^c，eDaudi^c，eMDCK^bCV-1^cMA-104^c	＞2000＞200＞100＞50＞100＞100＞100

a.PBMC，外周血单核细胞；HFF，人包皮成纤维细胞；Daudi，Burkitt氏B细胞淋巴瘤；MDCK，犬肾上皮细胞；CV-1，非洲绿猴肾成纤维细胞；MA-104，恒河猴肾上皮细胞。

b.CC₅₀＝50％细胞毒性浓度；‘＞’表明在最高测试药物浓度没有达到CC₅₀。

c.NIH，Antiviral Research and Antimicrobial ChemistryProgram。

d.R.Schinazi，Emory University，V eterans Affairs MedicalCenter。

e.结果以μM/mL而不是μM显示。

此外，L-dC对于人和其它哺乳动物来源的多种其它细胞系是无细胞毒性的。没有观察到线粒体功能、形态学或DNA含量的可辨别变化，并且在L-dC处理(IC₅₀＞10μM)的肝细胞中没有乳酸积累。L-dC的三磷酸形式在直到100μM的浓度也不抑制人α、β和γDNA聚合酶。

在大鼠和猴中进行的急性单剂量(包括500、1000和2000mg/kg单剂口服剂量)毒理学研究(剂量在第1、4、7、10和14天逐步上升直到2000mg/kg)中，没有毒性的明显迹象，并且在体重、食物消耗或临床病理学参数(血液学和血清化学)上没有任何与dival-L-dC相关的影响。此外，在尸体剖检时没有观察到肉眼可见损伤，组织形态学分析也没有任何可归因于dival-L-dC的显微镜检查发现。根据这些研究的结果，dival-L-dC在Sprague-Dawley大鼠和猕猴中口服管饲法单剂给药时未观察到不良反应的水平(NOAEL)是2000mg/kg。

在猴中进行的亚慢性(25天)毒理学研究中，dival-L-dC的NOAEL低于500mg/kg。胸腺萎缩是唯一可能与dival-L-dC有关的显微镜检查发现，但其临床显著性被解释为意义不明确。在500mg/kg剂量水平观察到轻度非溶血性贫血(红细胞计数降低，血红蛋白和血细胞比容减少)以及无明显后果的多形核白细胞计数的绝对值和百分率降低。除血液学变化外，在任何剂量组没有鉴定出其它毒性。

在大鼠中进行的亚慢性(28天)毒理学研究中，dival-L-dC的NOAEL小于500mg/kg。将dival-L-dC以2000mg/kg剂量口服给予大鼠28天导致处理相关的变化，包括轻度巨红细胞性贫血、胸腺重量降低、脾重量增加(仅雌性)、体重减少以及脾、肝和胸骨骨髓内红细胞生成。将dival-L-dC以1000mg/kg剂量口服给予大鼠28天导致处理相关变化，包括轻度巨红细胞性贫血、胸腺重量降低(仅雌性)以及脾内红细胞生成。在肝、脾和骨髓内观察到的组织形态学变化反映了对轻度贫血的血液学反应。将dival-L-dC以500mg/kg剂量口服给予大鼠28天导致轻度巨红细胞性贫血。除所观察到的血液学变化和红细胞生成反应外，在任何剂量组没有鉴定出其它毒性。

在急性(10mg/kg单剂剂量，静脉内给予和口服给予)和亚慢性(以10mg/kg/天口服给予28天或以1mg/kg/天口服给予12周)研究中，在正常健康旱獭或慢性感染乙型肝炎病毒的旱獭(治疗HBV感染的功效模型)中，在接受L-dC的动物中没有观察到毒性。与对照动物相比，在L-dC处理组中没有重量损失，临床病理学参数(血液学和血清化学)在正常范围内，在12周研究处理结束后进行的肝活组织检查没有显示脂肪变化(微血管脂肪变性)。

L-dC在S.typhimurium或大肠杆菌掺入致突变性测定中在直到5000μg/平板的浓度是无致突变性的。在中国仓鼠卵巢(CHO)测定中，暴露于直到5000μg/mL(或22.0mM)浓度的L-dC后没有染色体畸变的迹象。在小鼠微核测定中，L-dC在直到2000mg/kg的剂量对雄性或雌性动物是无诱裂性的。

在猴中观察到的轻度贫血甚至在最高剂量(2000mg/kg)没有任何临床相关性，而在大鼠中在500mg/kg没有任何临床相关性。此外，网织红细胞计数没有变化。虽然这些研究中没有正式的可逆性成分，但明显的是，如在大鼠中最高剂量在脾和肝内观察到的髓外造血所指示的，出现血液学反跳。

表32 根据重量和身体表面积进行的剂量的物种间比较

物种	体重(kg)	剂量(mg/kg)	剂量(mg/动物)	转换因子	人等效剂量(HED)(mg/kg)	差异倍数
物种	体重(kg)	剂量(mg/kg)	剂量(mg/动物)	转换因子	人等效剂量(HED)(mg/kg)	差异倍数	大鼠	0.2	500	100	6	16.6	23

猴	4.0	500	2000	3	666	938
猴	4.0	500	2000	3	666	938	旱獭	3.0	10	30	3	10	14
人	70	0.71	50(计划)	1	0.71	-	旱獭	3.0	10	30	3	10	14

在对拉米夫定(EpMr-HBVT^TM)和伐昔洛韦(Valtrex^TM)的临床前毒性研究中，在相似或更低剂量观察到类似的血清学变化。这两种获批准的药物与dival-L-dC都是已经充分鉴定的同一种类(核苷或核苷类似物)的成员。选择拉米夫定进行比较是基于以下事实：拉米夫定与dival-L-dC都是胞嘧啶衍生物，并且它已经获得批准用于治疗慢性乙型肝炎感染。选择伐昔洛韦进行比较是基于以下事实：它是核苷阿昔洛韦的缬氨酸酯前体药物。

已经参照本发明的优选实施方案描述了本发明。根据前面本发明的详细描述，对本发明的改变和修改对于本领域内技术人员是显而易见的。所有这些改变和修改都包括在本发明的范围内。

Claims

1.下面式(I)的3′-取代-β-L核苷或其药学上可接受的盐：

其中

R²是氨基酸残基；

X是O、S、SO₂或CH₂；并且

BASE选自腺嘌呤、N⁶-烷基嘌呤；N⁶-酰基嘌呤，其中酰基是C(O)烷基、C(O)芳基、C(O)烷芳基或C(O)芳烷基；N⁶-苄基嘌呤、N⁶-乙烯基嘌呤、N⁶-炔属嘌呤、N⁶-羟基烷基嘌呤、N²-烷基嘌呤、N²-烷基-6-硫代嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、6-氮杂嘧啶、2-和/或4-巯基嘧啶、尿嘧啶、5-卤尿嘧啶、C⁵-烷基嘧啶、C⁵-苄基嘧啶、C⁵-卤嘧啶、C⁵-乙烯基嘧啶、C⁵-炔属嘧啶、C⁵-酰基嘧啶、C⁵-羟基烷基嘌呤、C⁵-酰氨基嘧啶、C⁵-氰基嘧啶、C⁵-硝基嘧啶、C⁵-氨基嘧啶、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿苷基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基和吡唑并嘧啶基；

其中所述的烷基、环状烷基、烷氧基和芳烷基的烷基部分为伯、仲、叔C_1-10烷基，并且是未取代的或者被选自以下的一个或多个取代基取代：羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸根、膦酸、磷酸根或膦酸根，且

所述芳基、芳氧基和芳烷基的芳基部分为苯基、联苯基或萘基。

2.权利要求1的化合物，其中X是O。

3.权利要求2的化合物，其中R²是式C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)的氨基酸残基，其中

R⁹是氢、烷基或芳基；和

R¹⁰和R¹¹独立地是氢、酰基或烷基。

4.权利要求3的化合物，其中R⁹中的烷基是C₁-C₄烷基；而在R¹⁰和R¹¹中，酰基是连接于R⁸的酰基衍生物。

5.权利要求3的化合物，其中R²是L-缬氨酰基。

6.权利要求2的化合物，其中R¹是氢。

7.权利要求2的化合物，其中R¹是CO-烷基。

8.权利要求2的化合物，其中R¹是式C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)的氨基酸残基，其中

R⁹是氢、烷基或芳基；和

R¹⁰和R¹¹独立地是氢、酰基或烷基。

9.权利要求8的化合物，其中R⁹中的烷基是C₁-C₄烷基；而在R¹⁰和R¹¹中，酰基是连接于R⁸的酰基衍生物。

10.权利要求8的化合物，其中R¹是L-缬氨酰基。

11.权利要求10的化合物，其中R¹和R²独立地是L-缬氨酰基。

12.权利要求2的化合物，其中所述3′-取代-β-L核苷是下式的β-L-2′-脱氧嘧啶或其药学上可接受的盐：

其中

R²是氨基酸残基；

Y是OR³、NR³R⁴或SR³；和

R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸根、二磷酸根或三磷酸根或磷酸根衍生物。

13.权利要求12的化合物，其中所述二烷基氨基亚烷基是二甲氨基亚甲基。

14.权利要求12的化合物，其中R²是式C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)的氨基酸残基，其中

R⁹是氢、烷基或芳基；和

R¹⁰和R¹¹独立地是氢、酰基或烷基。

15.权利要求14的化合物，其中R⁹中的烷基是C₁-C₄烷基；而在R¹⁰和R¹¹中，酰基是连接于R⁸的酰基衍生物。

16.权利要求14的化合物，其中R²是L-缬氨酰基。

17.权利要求12的化合物，其中R¹是氢。

18.权利要求12的化合物，其中R¹是CO-烷基。

19.权利要求12的化合物，其中R¹是式C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)的氨基酸残基，其中

R⁹是氢、烷基或芳基；和

R¹⁰和R¹¹独立地是氢、酰基或烷基。

20.权利要求19的化合物，其中R⁹中的烷基是C₁-C₄烷基；而在R¹⁰和R¹¹中，酰基是连接于R⁸的酰基衍生物。

21.权利要求19的化合物，其中R¹是L-缬氨酰基。

22.权利要求12的化合物，其中R¹是氢，R²是L-缬氨酰基。

23.权利要求12的化合物，其中R¹和R²独立地是式C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)的氨基酸残基，其中

R⁹是氢、烷基或芳基；和

R¹⁰和R¹¹独立地是氢、酰基或烷基。

24.权利要求23的化合物，其中R⁹中的烷基是C₁-C₄烷基；而在R¹⁰和R¹¹中，酰基是连接于R⁸的酰基衍生物。

25.权利要求23的化合物，其中R¹和R²独立地是L-缬氨酰基。

26.权利要求12的化合物，其中所述β-L-2′-脱氧嘧啶是下式的β-L-2′-脱氧胞苷或其药学上可接受的盐：

其中

R²是氨基酸残基；

R³和R⁴独立地是H、直链烷基、支链烷基或环状烷基、二烷基氨基亚烷基、CO-烷基、CO-芳基、CO-烷氧基烷基、CO-芳氧基烷基、CO-取代芳基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、氨基酸残基、一磷酸根、二磷酸根或三磷酸根或磷酸根衍生物。

27.权利要求26的化合物，其中所述二烷基氨基亚烷基是二甲氨基亚甲基。

28.权利要求26或27的化合物，其中R²是式C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)的氨基酸残基，其中

R⁹是氢、烷基或芳基；和

R¹⁰和R¹¹独立地是氢、酰基或烷基。

29.权利要求28的化合物，其中R⁹中的烷基是C₁-C₄烷基；而在R¹⁰和R¹¹中，酰基是连接于R⁸的酰基衍生物。

30.权利要求28的化合物，其中R²是L-缬氨酰基。

31.权利要求26的化合物，其中R¹是氢。

32.权利要求26的化合物，其中R¹不是氢。

33.权利要求26的化合物，其中R¹是CO-烷基。

34.权利要求33的化合物，其中所述CO-烷基是CO-甲基。

35.权利要求33的化合物，其中所述CO-烷基是CO-丙基。

36.权利要求26的化合物，其中R¹是式C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)的氨基酸残基，其中

R⁹是氢、烷基或芳基；和

R¹⁰和R¹¹独立地是氢、酰基或烷基。

37.权利要求36的化合物，其中R⁹中的烷基是C₁-C₄烷基；而在R¹⁰和R¹¹中，酰基是连接于R⁸的酰基衍生物。

38.权利要求36的化合物，其中R¹是L-缬氨酰基。

39.权利要求26的化合物，其中R¹是氢，R²是L-缬氨酰基。

40.权利要求26的化合物，其中R¹和R²独立地是式C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)的氨基酸残基，其中

R⁹是氢、烷基或芳基；和

R¹⁰和R¹¹独立地是氢、酰基或烷基。

41.权利要求40的化合物，其中R⁹中的烷基是C₁-C₄烷基；而在R¹⁰和R¹¹中，酰基是连接于R⁸的酰基衍生物。

42.权利要求40的化合物，其中R¹和R²独立地是L-缬氨酰基。

43.权利要求42的化合物，其中R³和R⁴是氢。

44.权利要求42的化合物，其中R³是氢，R⁴是二甲氨基亚甲基。

45.权利要求42的化合物，其中R³是氢，R⁴是CO-烷基。

46.权利要求45的化合物，其中R³是氢，R⁴是CO-甲基。

47.权利要求42的化合物，其中R³是氢，R⁴是L-缬氨酰基。

48.一种用于治疗或预防宿主乙型肝炎病毒感染的药用组合物，所述组合物包含前面权利要求1-47中任一项的化合物或其药学上可接受的盐以及一种药学上可接受的载体或稀释剂。

49.一种用于治疗或预防宿主乙型肝炎病毒感染的药用组合物，所述组合物包含前面权利要求1-47中任一项的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种抗乙型肝炎病毒剂，还任选含有一种药学上可接受的载体或稀释剂。

50.权利要求49的药用组合物，其中所述抗乙型肝炎病毒剂是一种β-L-脱氧核糖核苷。

51.权利要求50的药用组合物，其中所述β-L-脱氧核糖核苷选自：β-L-脱氧核糖胸苷、β-L-脱氧核糖胞嘧啶、β-L-脱氧核糖尿苷、β-L-脱氧核糖腺嘌呤、β-L-脱氧核糖鸟嘌呤或β-L-脱氧核糖肌苷。

52.权利要求51的药用组合物，其中所述β-L-脱氧核糖核苷是β-L-脱氧核糖胸苷。

53.权利要求52的药用组合物，其中所述化合物是3′-val-β-L-脱氧核糖胞嘧啶，所述抗乙型肝炎病毒剂是β-L-脱氧核糖胸苷。

54.权利要求52的药用组合物，其中所述化合物是3′，5′-二val-β-L-脱氧核糖胞嘧啶，所述抗乙型肝炎病毒剂是β-L-脱氧核糖胸苷。

55.前面权利要求1-47中任一项的化合物在生产用于预防或治疗宿主乙型肝炎病毒感染的药物中的用途。

56.前面权利要求1-47中任一项的化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种抗乙型肝炎病毒剂以及任选的一种药学上可接受的载体或稀释剂在生产用于预防或治疗宿主乙型肝炎病毒感染的药物中的用途。

57.权利要求56的用途，其中所述抗乙型肝炎病毒剂是一种β-L-脱氧核糖核苷。

58.权利要求57的用途，其中所述β-L-脱氧核糖核苷选自：β-L-脱氧核糖胸苷、β-L-脱氧核糖胞嘧啶、β-L-脱氧核糖尿苷、β-L-脱氧核糖腺嘌呤、β-L-脱氧核糖鸟嘌呤或β-L-脱氧核糖肌苷。

59.权利要求58的用途，其中所述β-L-脱氧核糖核苷是β-L-脱氧核糖胸苷。

60.权利要求59的用途，其中所述化合物是3′-val-β-L-脱氧核糖胞嘧啶，所述抗乙型肝炎病毒剂是β-L-脱氧核糖胸苷。

61.权利要求59的用途，其中所述化合物是3′，5′-二val-β-L-脱氧核糖胞嘧啶，所述抗乙型肝炎病毒剂是β-L-脱氧核糖胸苷。

62.下式化合物或其药学上可接受的盐：

63.下式化合物或其药学上可接受的盐：

64.一种药用组合物，所述组合物包含下式化合物或其药学上可接受的盐

和β-L-脱氧核糖胸苷，还任选含有一种药学上可接受的载体或稀释剂。

65.一种药用组合物，所述组合物包含下式化合物或其药学上可接受的盐

66.一种药用组合物，所述组合物包含下式化合物或其药学上可接受的盐：

和一种或多种抗乙型肝炎病毒剂，还任选含有一种药学上可接受的载体或稀释剂。

67.一种药用组合物，所述组合物包含下式化合物或其药学上可接受的盐：

68.一种药用组合物，所述组合物包含下式化合物或其药学上可接受的盐或其酯

和一种药学上可接受的载体或稀释剂。

69.一种药用组合物，所述组合物包含下式化合物或其药学上可接受的盐

和一种药学上可接受的载体或稀释剂。

70.权利要求62-69中任一项的化合物或组合物在制备用于治疗或预防宿主乙型肝炎病毒感染的药物中的用途。

71.下式化合物或其药学上可接受的盐和任选的药学上可接受的载体或稀释剂在生产用于治疗或预防宿主乙型肝炎病毒感染的药物中的用途

72.下式化合物或其药学上可接受的盐和任选的药学上可接受的载体或稀释剂在生产用于治疗或预防宿主乙型肝炎病毒感染的药物中的用途

73.下式化合物或其药学上可接受的盐与治疗量的β-L-脱氧核糖胸苷联合或交替和任选的药学上可接受的载体或稀释剂在生产用于治疗或预防宿主乙型肝炎病毒感染的药物中的用途

74.下式化合物或其药学上可接受的盐与治疗量的β-L-脱氧核糖胸苷联合或交替和任选的药学上可接受的载体或稀释剂在生产用于治疗或预防宿主乙型肝炎病毒感染的药物中的用途

75.下式化合物或其药学上可接受的盐与治疗量的一种或多种抗乙型肝炎病毒剂联合或交替和任选的药学上可接受的载体或稀释剂在生产用于治疗或预防宿主乙型肝炎病毒感染的药物中的用途

76.下式化合物或其药学上可接受的盐与治疗量的一种或多种抗乙型肝炎病毒剂联合或交替和任选的药学上可接受的载体或稀释剂在生产用于治疗或预防宿主乙型肝炎病毒感染的药物中的用途

77.权利要求55的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于口服递药。

78.权利要求55的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于静脉内递药。

79.权利要求55的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于胃肠外递药。

80.权利要求55的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于真皮内递药。

81.权利要求55的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于皮下递药。

82.权利要求55的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于局部递药。

83.权利要求55的用途，其中所述化合物为剂量单位形式。

84.权利要求83的用途，其中所述剂量单位含有7-3000mg的所述化合物。

85.权利要求83的用途，其中所述剂量单位为片剂或胶囊。

86.权利要求55的用途，其中所述宿主是人。

87.权利要求71-76中任一项的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于口服递药。

88.权利要求71-76中任一项的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于静脉内递药。

89.权利要求71-76中任一项的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于胃肠外递药。

90.权利要求71-76中任一项的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于真皮内递药。

91.权利要求71-76中任一项的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于皮下递药。

92.权利要求71-76中任一项的用途，其中所述药学上可接受的载体适用于局部递药。

93.权利要求71-76中任一项的用途，其中所述化合物为剂量单位形式。

94.权利要求93的用途，其中所述剂量单位含有7-3000mg的所述化合物。

95.权利要求94的用途，其中所述剂量单位为片剂或胶囊。

96.权利要求71-76中任一项的用途，其中所述宿主是人。

97.权利要求48的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于口服递药。

98.权利要求48的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于静脉内递药。

99.权利要求48的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于胃肠外递药。

100.权利要求48的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于真皮内递药。

101.权利要求48的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于皮下递药。

102.权利要求48的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于局部递药。

103.权利要求48的药用组合物，其中所述化合物为剂量单位形式。

104.权利要求103的药用组合物，其中所述剂量单位含有7-3000mg的所述化合物。

105.权利要求103的药用组合物，其中所述剂量单位为片剂或胶囊。

106.权利要求48的药用组合物，其中所述宿主是人。

107.权利要求64-69中任一项的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于口服递药。

108.权利要求64-69中任一项的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于静脉内递药。

109.权利要求64-69中任一项的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于胃肠外递药。

110.权利要求64-69中任一项的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于真皮内递药。

111.权利要求64-69中任一项的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于皮下递药。

112.权利要求64-69中任一项的药用组合物，其中所述药学上可接受的载体适用于局部递药。

113.权利要求64-69中任一项的药用组合物，其中所述化合物为剂量单位形式。

114.权利要求113的药用组合物，其中所述剂量单位含有7-3000mg的所述化合物。

115.权利要求114的药用组合物，其中所述剂量单位为片剂或胶囊。

116.权利要求64-69中任一项的药用组合物，其中所述宿主是人。

117.权利要求1的3′-取代-β-L核苷，其中所述BASE是6-氮杂胞嘧啶。

118.权利要求1的3′-取代-β-L核苷，其中所述BASE是5-氟尿嘧啶。