TWI730952B

TWI730952B - 病毒顆粒至紋狀體和皮質的增強遞送

Info

Publication number: TWI730952B
Application number: TW105104342A
Authority: TW
Inventors: 麗莎斯坦尼克; 琳亞謝哈布丁
Original assignee: 美商健臻公司
Priority date: 2015-02-10
Filing date: 2016-02-15
Publication date: 2021-06-21
Also published as: JP2018506585A; EP3256594A2; WO2016130591A2; EA201791803A1; SG10201912926VA; CA2976082A1; AU2022204583A1; SI3256594T1; IL285060B; PL3256594T3; IL296466A; HUE057272T2; EP4219728A2; IL285060B2; HK1246340A1; AU2016219398A1; MX2017010370A; CN107530447A; ES2904504T3; LT3256594T

Abstract

本申請提供用於將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒遞送至哺乳動物(例如，人)的中樞神經系統的新方法。在一些方面，所述方法涉及將含有異源核酸的rAAV顆粒投予至紋狀體並引起所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。

Description

病毒顆粒至紋狀體和皮質的增強遞送

相關申請的交叉引用

本發明要求保護2015年2月10日申請的美國臨時申請號62/114,544和2015年9月19日申請的美國臨時申請號62/220,997的優先權，其每項內容出於全部的目的在此處以參考方式整體併入。

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本發明關於AAV基因治療載體向腦部例如紋狀體和/或皮質的遞送。

基於腺相關病毒(AAV)的載體已成為優選的用於神經系統基因治療的載體系統，其具有出色的建立在多次臨床試驗上的安全性記錄(Kaplitt等，(2007)Lancet 369：2097-2105；Eberling等，(2008)Neurology 70：1980-1983；Fiandaca等，(2009)Neuroimage 47 Suppl.2：T27-35)。神經系統病症的有效治療由於AAV載體遞送影響細胞種群的問題所阻礙。該遞送問題對於涉及大腦皮質病症中特別嚴重。簡單注射不能有效分配AAV載體，依賴於擴散，其僅在1-3mm半徑內有效。可替換的方法對流增強遞送(CED)(Nguyen等，(2003)J.Neurosurg.98：584-590)，已在臨床上用於帕金森氏病的基因療法中使用(Fiandaca等，(2008)Exp.Neurol.209：51-57)。CED的基本原理涉及在足夠的壓力下泵輸注入腦實質以克服組織間液的靜水壓力，由此迫使輸注的顆粒與腦部密集的周圍血管系統緊密接觸。這些血管的脈動作為泵發揮功能，將所述顆粒在遍佈實質的大的距離上進行分配(Hadaczek等，(2006)Hum.GeneTher.17：291-302)。為增加CED的安全性和效力，可採用抗返流套管(Krauze等，(2009)Methods Enzymol.465：349-362)伴隨具有即時MRI的監測遞送。監測的遞送允許對異常事件如套管返流和輸注洩露入腦室進行量化和控制(Eberling等，(2008)Neurology 70：1980-1983；Fiandaca等，(2009)Neuroimage 47 Suppl.2：T27-35；Saito等，(2011)Journal of Neurosurgery Pediatrics 7：522-526)。然而，對於實現AAV載體在皮質和/或紋狀體中廣泛表現的改進方法仍存在需求。

本發明提供一種用於遞送重組腺相關病毒(rAAV)顆粒至哺乳動物的中樞神經系統的方法，其包括投予rAAV顆粒至紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。在一些方面中，本發明提供用於遞送rAAV顆粒至哺乳動物的中樞神經系統的方法，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現且其中所述rAAV顆粒包含AAV血清型1(AAV1)衣殼。在一些方面中，本發明提供用於遞送rAAV顆粒至哺乳動物的中樞神經系統的方法，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現且其中所述rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。在一些具體實例中，所述哺乳動物是人。

在一些具體實例中，將所述rAAV顆粒至少投予至紋狀體的殼核和尾狀核。在一些具體實例中，將所述rAAV顆粒至少投予至紋狀體每半球的殼核和尾狀核。在一些具體實例中，將所述rAAV顆粒至少投予至尾狀核中的一處位點和殼核中的兩處位點。在一些具體實例中，投予至殼核的rAAV顆粒與投予至尾狀核的rAAV顆粒的比例為至少約2：1。在一些具體實例中，所述異源核酸至少在哺乳動物的額葉皮質、枕葉皮質和/或層IV中表現。在一些具體實例中，所述異源核酸至少在前額葉相關皮質區、運動前區皮質、初級軀體感覺皮質區、感覺運動皮質、頂葉皮質、枕葉皮質和/或初級運動皮質中表現。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒在大腦皮質中經歷逆行或順行轉運。在一些具體實例中，所述異源核酸進一步在丘腦、底丘腦核、蒼白球、黑質和/或海馬區中表現。在一些具體實例中，將rAAV顆粒以大於1μL/分鐘至約5μL/分鐘的速率投予至尾狀核和殼核。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些具體實例中，所述AAV血清型是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10或AAVrh10。在一些具體實例中，所述rAAV載體包含側翼為一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列的異源核酸。在一些具體實例中，所述異源核酸側翼為兩個AAV ITR。在一些具體實例中，所述AAV ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、 AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些具體實例中，所述AAV ITR為AAV2 ITR。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒的ITR和衣殼源自相同的AAV血清型。在一些具體實例中，所述ITR和所述衣殼源自AAV2。在其他具體實例中，所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自不同的AAV血清型。在一些具體實例中，所述ITR源自AAV2且所述衣殼源自AAV1。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸可操作地與啟動子連接。在一些具體實例中，所述啟動子在CNS的細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述啟動子在腦細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述啟動子在神經元和/或神經膠質細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述神經元是尾狀核的中型多棘神經元、殼核的中型多棘神經元、皮質層IV的神經元和/或皮質層V的神經元。在一些具體實例中，所述神經膠質細胞是星形膠質細胞。在一些具體實例中，所述啟動子是CBA啟動子、最小CBA啟動子、CMV啟動子或GUSB啟動子。在其他具體實例中，所述啟動子是誘導型。在進一步的具體實例中，所述rAAV載體包含一個或多個增強子、剪接供體/剪接受體對、基質附接位點或多聚腺苷酸化信號。在一些具體實例中，所述rAAV載體是自身互補的rAAV載體。在一些具體實例中，所述載體包含編碼異源核酸的第一核酸序列和編碼所述異源核酸的互補物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。在一些具體實例中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列經由突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失且包含末端解析序列(terminal resolution sequence)的突變。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療多肽或治療核酸。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療多肽。在一些具體實例中，所述治療多肽是酶、神經營養因子、在具有CNS相關病症的個體中缺失或突變的多肽、抗氧化劑、抗細胞凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎症因子、α-突觸核蛋白、酸性β-葡糖苷酶(GBA)、β-半乳糖苷酶-1(GLB1)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、半乳糖神經醯胺酶(GALC)、甘露糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶(MAN2B1)、β-甘露糖苷酶(MANBA)、假芳基硫酸酯酶A(ARSA)、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶(GNPTAB)、酸性鞘磷脂酶(ASM)、尼曼-匹克C蛋白(Niemann-Pick C蛋白)(NPC1)、酸性α-1,4-葡糖苷酶(GAA)、己糖胺酶β亞基、HEXB、N-硫代葡糖胺磺基水解酶(MPS3A)、N-α-乙醯葡糖胺酶(NAGLU)、肝素乙醯-CoA、α-葡糖胺酶N-乙醯轉移酶(MPS3C)、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶(GNS)、α-N-乙醯半乳糖胺酶(NAGA)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、己糖胺酶α亞基(HEXA)、亨廷頓蛋白(huntingtin)(HTT)、溶酶體酸性脂肪酶(LIPA)、天冬胺醯葡糖胺酶、α-半乳糖苷酶A、棕櫚醯蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶體跨膜蛋白、半胱胺酸轉運蛋白、酸性神經醯胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、組織蛋白酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸、酸性β-半乳糖苷酶或α-神經胺酸酶。在其他具體實例中，所述異源核酸編碼治療核酸。在一些具體實例中，所述治療核酸是siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述治療多肽或治療核酸用於治療CNS的病症。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述CNS的病症是溶酶體貯積症(LSD)、亨廷頓氏病(Huntington's Disease)、癲癇、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病(Alzheimer's Disease)、中風、皮質基底節變性(CBD)、皮質基底神經節變性(CBGD)、額顳葉癡呆(FTD)、多系統萎縮(MSA)、進行性核上性麻痹(PSP)或腦癌。在一些具體實例中，所述病症是選自下組的溶酶體貯積症：天冬胺醯葡糖胺尿症(Aspartylglusoaminuria)、法布裡病(Fabry)、小兒巴藤病(Infantile Batten Disease)(CNL1)、經典晚期小兒巴藤病(Classic Late Infantile Batten Disease)(CNL2)、青少年巴藤病(Juvenile Batten Disease)(CNL3)、Batten形式CNL4、Batten形式CNL5、Batten形式CNL6、Batten形式CNL7、Batten形式CNL8、胱胺酸貯積症(Cystinosis)、法伯氏病(Farber)、岩藻糖苷貯積症(Fucosidosis)、半乳糖苷唾液酸貯積症(Galactosidosialidosis)、高歇氏病1型(Gaucher disease type 1)、高歇氏病2型(Gaucher disease type 2)、高歇氏病3型(Gaucher disease type 3)、GM1神經節苷脂貯積症(GM1 gangliosidosis)、亨特病(Hunter Disease)、克拉伯病(Krabbe Disease)、α甘露糖苷貯積症(α mannosidosis Disease)、β甘露糖苷貯積症(β mannosidosis Disease)、馬-拉病(Maroteaux-Lamy)、異染性腦白質營養不良症(metachromatic leukodystrophy Disease)、莫爾丘病A(Morquio A)、莫爾丘病B(Morquio B)、黏脂貯積症II/III病(mucolipidosisII/III Disease)、尼曼-匹克A病(Niemann-Pick A Disease)、尼曼-匹克B病(Niemann-Pick B Disease)、尼曼-匹克C病(Niemann-Pick C Disease)、龐貝氏症(Pompe Disease)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、聖菲利柏氏病A型(Sanfillipo A disease)、聖菲利柏氏病B型(Sanfillipo B disease)、聖菲利柏氏病C型(Sanfillipo C disease)、Sanfillipo D病(Sanfillipo D disease)、辛德勒病(Schindler disease)、Schindler-Kanzaki、唾液酸貯積症(sialidosis)、斯利氏病(Sly Disease)、泰-薩克斯病(Tay-Sachs Disease)和沃爾曼病(Wolman Disease)。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV顆粒在組合物中。在進一步的具體實例中，所述組合物是包含藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV顆粒通過將編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸三重轉染入宿主細胞而產生，其中所述核酸至所述宿主細胞的轉染生成能夠產生rAAV顆粒的宿主細胞。在其他具體實例中，所述rAAV顆粒藉由包含一個或多個編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸的生產細胞系產生。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV顆粒藉由立體定向遞送進行遞送。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒藉由對流增強遞送進行遞送。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒使用CED遞送系統遞送。在一些具體實例中，所述CED系統包含套管。在一些具體實例中，所述套管是抗返流套管或階梯套管。在一些具體實例中，所述CED系統包含泵。在一些具體實例中，所述泵是手動泵。在一些具體實例中，所述泵是滲透泵。在一些具體實例中，所述泵是輸注泵。

在一些方面中，本發明提供用於遞送rAAV顆粒至哺乳動物的中樞神經系統的方法，其包括通過CED將含有rAAV顆粒的組合物投予至紋狀體，其中所述組合物以大於1μL/分鐘至約5μL/分鐘的速率投予至紋狀體。在一些方面中，本發明提供用於遞送rAAV顆粒至哺乳動物的中樞神經系統的方法，其包括藉由CED將含有rAAV顆粒的組合物投予至紋狀體，其中所述組合物包含rAAV顆粒和泊洛沙姆(poloxamer)。在一些具體實例中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些具體實例中，泊洛沙姆在組合物中的濃度為約0.0001%至約0.01%。在一些具體實例中，泊洛沙姆在組合物中的濃度為約0.001%。在一些具體實例中，所述組合物進一步包含氯化鈉，其中所述組合物中氯化鈉的濃度為約100mM至約250mM。在一些具體實例中，所述組合物中氯化鈉的濃度為約180mM。在一些具體實例中，所述組合物進一步包含磷酸鈉，其中所述組合物中磷酸鈉的濃度為約5mM至約20mM且pH為約7.0至約8.0。在一些具體實例中，所述組合物進一步包含磷酸鈉，其中所述組合物中磷酸鈉的濃度為約10mM且pH為約7.5。在一些具體實例中，將所述組合物以大於1μL/分鐘至約5μL/分鐘的速率投予至尾狀核和殼核。在一些具體實例中，遞送至殼核的組合物的量為約遞送至尾狀核的體積的兩倍。在一些具體實例中，將約20μL至約50μL的組合物投予至每半球的尾狀核和約40μL至約100μL的組合物投予至每半球的殼核。在一些具體實例中，將約30μL的組合物投予至每半球的尾狀核和約60μL的組合物投予至每半球的殼核。

在一些具體實例中，本發明提供在哺乳動物中治療CNS的病症的方法，其包括藉由上文所述的方法投予有效量的rAAV顆粒至哺乳動物。

在一些方面中，本發明提供在哺乳動物中治療亨廷頓氏病的方法，其包括投予有效量的rAAV顆粒至紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1衣殼或AAV2衣殼。在其他方面中，本發明提供在哺乳動物中治療帕金森氏病的方法，其包括投予有效量的rAAV顆粒至紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物大腦皮質和紋狀體中表現。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV2衣殼。在一些具體實例中，所述哺乳動物是人。

在一些具體實例中，至少將所述rAAV顆粒投予至紋狀體的殼核和尾狀核。在一些具體實例中，至少將所述rAAV顆粒投予至紋狀體每半球的殼核和尾狀核。在一些具體實例中，至少將所述rAAV顆粒投予至尾狀核中的一處位點或殼核中的兩處位點。在一些具體實例中，投予至殼核的rAAV顆粒與投予至尾狀核的rAAV顆粒的比例為至少約2：1。在一些具體實例中，所述異源核酸至少在哺乳動物的額葉皮質、枕葉皮質和/或層IV中表現。在一些具體實例中，所述異源核酸至少在前額葉相關皮質區、運動前區皮質、初級軀體感覺皮質區、感覺運動皮質、頂葉皮質、枕葉皮質和/或初級運動皮質中表現。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒在大腦皮質中經歷逆行或順行轉運。在一些具體實例中，所述異源核酸進一步在丘腦、底丘腦核、蒼白球、黑質和/或海馬區中表現。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些具體實例中，所述AAV血清型是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10或AAVrh10。在一些具體實例中，所述rAAV載體包含側翼為一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列的異源核酸。在一些具體實例中，所述異源核酸側翼為兩個AAV ITR。在一些具體實例中，所述AAV ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些具體實例中，所述AAV ITR為AAV2 ITR。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒的ITR和衣殼源自相同的AAV血清型。在一些具體實例中，所述ITR和所述衣殼源自AAV2。在其他具體實例中，所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自不同的AAV血清型。在一些具體實例中，所述ITR源自AAV2且所述衣殼源自AAV1。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸可操作地與啟動子連接。在一些具體實例中，所述啟動子在CNS的細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述啟動子在腦細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述啟動子在神經元和/或神經膠質細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述神經元是尾狀核的中型多棘神經元、殼核的中型多棘神經元、皮質層IV的神經元和/或皮質層V的神經元。在一些具體實例中，所述神經膠質細胞是星形膠質細胞。在一些具體實例中，所述啟動子是CBA啟動子、最小CBA啟動子、CMV啟動子或GUSB啟動子。在其他具體實例中，所述啟動子是誘導型。在進一步的具體實例中，所述rAAV載體包含一個或多個增強子、剪接供體/剪接受體對、基質附接位點或多聚腺苷酸化信號。在一些具體實例中，所述rAAV載體是自身互補的rAAV載體。在一些具體實例中，所述載體包含編碼異源核酸的第一核酸序列和編碼所述異源核酸的互補物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。在一些具體實例中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失且包含末端解析序列的突變。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療多肽或治療核酸。在一些具體實例中，所述治療多肽或治療核酸編碼在具有亨廷頓氏病的哺乳動物CNS的細胞中抑制HTT的表現或抑制HTT的積累。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼靶向亨廷頓蛋白的miRNA。在一些具體實例中，所述亨廷頓蛋白包含與亨廷頓氏病相關的突變。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸編碼用於治療亨廷頓氏病的治療多肽或治療核酸。在一些具體實例中，所述治療多肽或治療核酸在具有亨廷頓氏病的哺乳動物的CNS的細胞中抑制HTT的表現或抑制HTT的積累。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼靶向亨廷頓蛋白的miRNA。在一些具體實例中，所述亨廷頓蛋白包含與亨廷頓氏病相關的突變。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸編碼用於治療帕金森氏病的治療多肽或治療核酸。在一些具體實例中，所述治療多肽是膠質衍生的生長因子(GDNF)、腦衍生的生長因子(BDNF)、酪胺酸羥化酶(TH)、GTP-環化水解酶(GTPCH)和/或胺基酸脫羧酶(AADC)。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV顆粒通過將編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸三重轉染入宿主細胞而產生，其中所述核酸至所述宿主細胞的轉染生成能夠產生rAAV顆粒的宿主細胞。在其他具體實例中，所述rAAV顆粒通過包含一個或多個編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸的生產細胞系產生。

在一些方面中，本發明提供用於在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現異源核酸的系統，其包含：a)含有rAAV顆粒的組合物，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體；和b)用於將rAAV顆粒遞送至紋狀體的裝置。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1衣殼或AAV2衣殼。在一些具體實例中，所述哺乳動物是人。

在本發明的系統的一些具體實例中，將所述rAAV顆粒投予至紋狀體的殼核和尾狀核。在一些具體實例中，將所述rAAV顆粒至少投予至尾狀核中的一處位點和殼核中的兩處位點。在一些具體實例中，投予至殼核的rAAV顆粒與投予至尾狀核的rAAV顆粒的比例為至少約2：1。在一些具體實例中，異源核酸在哺乳動物的額葉皮質、枕葉皮質和/或層IV中表現。在一些具體實例中，所述異源核酸在前額葉相關皮質區、運動前區皮質、初級軀體感覺皮質區、感覺運動皮質、頂葉皮質、枕葉皮質和/或初級運動皮質中表現。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒在大腦皮質中經歷逆行或順行轉運。在一些具體實例中，所述異源核酸進一步在丘腦、底丘腦核、蒼白球、黑質和/或海馬區中表現。

在本發明的系統的一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV、或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼。在一些具體實例中，所述AAV血清型是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10 或AAVrh10。在一些具體實例中，所述rAAV載體包含側翼為一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列的異源核酸。在一些具體實例中，所述異源核酸側翼為兩個AAV ITR。在一些具體實例中，所述AAV ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些具體實例中，所述AAV ITR為AAV2 ITR。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒的ITR和衣殼源自相同的AAV血清型。在一些具體實例中，所述ITR和所述衣殼源自AAV2。在其他具體實例中，所述rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自不同的AAV血清型。在一些具體實例中，所述ITR源自AAV2且所述衣殼源自AAV1。

在本發明的系統的一些具體實例中，所述異源核酸可操作地與啟動子連接。在一些具體實例中，所述啟動子在CNS的細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述啟動子在腦細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述啟動子在神經元和/或神經膠質細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述神經元是尾狀核的中型多棘神經元、殼核的中型多棘神經元、皮質層IV的神經元和/或皮質層V的神經元。在一些具體實例中，所述神經膠質細胞是星形膠質細胞。在一些具體實例中，所述啟動子是CBA啟動子、最小CBA啟動子、CMV啟動子或GUSB啟動子。在其他具體實例中，所述啟動子是誘導型。在進一步的具體實例中，所述rAAV載體包含一個或多個增強子、剪接供體/剪接受體對、基質附接位點或多聚腺苷酸化信號。在一些具體實例中，所述rAAV載體是自身互補的rAAV載體。在一些具體實例中，所述載體包含編碼異源核酸的第一核酸序列和編碼所述異源核酸的互補物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。在一些具體實例中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列經由突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失且包含末端解析序列的突變。

在本發明的系統的一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療多肽或治療核酸。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療多肽。在一些具體實例中，所述治療多肽是酶、神經營養因子、在具有CNS相關病症的個體中缺失或突變的多肽、抗氧化劑、抗細胞凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎症因子、α-突觸核蛋白、酸性β-葡糖苷酶(GBA)、β-半乳糖苷酶-1(GLB1)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、半乳糖神經醯胺酶(GALC)、甘露糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶(MAN2B1)、β-甘露糖苷酶(MANBA)、假芳基硫酸酯酶A(ARSA)、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶(GNPTAB)、酸性鞘磷脂酶(ASM)、尼曼-匹克C蛋白(Niemann-Pick C蛋白)(NPC1)、酸性α-1,4-葡糖苷酶(GAA)、己糖胺酶β亞基、HEXB、N-硫代葡糖胺磺基水解酶(MPS3A)、N-α-乙醯葡糖胺酶(NAGLU)、肝素乙醯-CoA、α-葡糖胺酶N-乙醯轉移酶(MPS3C)、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶(GNS)、α-N-乙醯半乳糖胺酶(NAGA)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、己糖胺酶α亞基(HEXA)、亨廷頓蛋白(huntingtin)(HTT)、溶酶體酸性脂肪酶(LIPA)、天冬胺醯葡糖胺酶、α-半乳糖苷酶A、棕櫚醯蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶體跨膜蛋白、半胱胺酸轉運蛋白、酸性神經醯胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、組織蛋白酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸、酸性β-半乳糖苷酶或α-神經胺酸酶。在其他具體實例中，所述異源核酸編碼治療核酸。在一些具體實例中，所述治療核酸是siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述治療多肽或治療核酸用於治療CNS的病症。

在本發明的系統的一些具體實例中，所述CNS的病症是溶酶體貯積症(LSD)、亨廷頓氏病(Huntington's Disease)、癲癇、帕金森氏病(Parkinson's Disease)、阿爾茨海默氏病(Alzheimer's Disease)、中風、皮質基底節變性(CBD)、皮質基底神經節變性(CBGD)、額顳葉癡呆(FTD)、多系統萎縮(MSA)、進行性核上性麻痹(PSP)或腦癌。在一些具體實例中，所述病症是選自下組的溶酶體貯積症：天冬胺醯葡糖胺尿症(Aspartylglusoaminuria)、法布裡病(Fabry)、小兒巴藤病(Infantile Batten Disease)(CNL1)、經典晚期小兒巴藤病(Classic Late Infantile Batten Disease)(CNL2)、青少年巴藤病(Juvenile Batten Disease)(CNL3)、Batten形式CNL4、Batten形式CNL5、Batten形式CNL6、Batten形式CNL7、Batten形式CNL8、胱胺酸貯積症(Cystinosis)、法伯氏病(Farber)、岩藻糖苷貯積症(Fucosidosis)、半乳糖苷唾液酸貯積症(Galactosidosialidosis)、高歇氏病1型(Gaucher disease type 1)、高歇氏病2型(Gaucher disease type 2)、高歇氏病3型(Gaucher disease type 3)、GM1神經節苷脂貯積症(GM1 gangliosidosis)、亨特病(Hunter Disease)、克拉伯病(Krabbe Disease)、α甘露糖苷貯積症(α mannosidosis Disease)、β甘露糖苷貯積症(β mannosidosis Disease)、馬-拉病(Maroteaux-Lamy)、異染性腦白質營養不良症(metachromatic leukodystrophy Disease)、莫爾丘病A(Morquio A)、莫爾丘病B(Morquio B)、黏脂貯積症II/III病(mucolipidosisII/III Disease)、尼曼-匹克A病(Niemann-Pick A Disease)、尼曼-匹克B病(Niemann-Pick B Disease)、尼曼-匹克C病(Niemann-Pick C Disease)、龐貝氏症(Pompe Disease)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、聖菲利柏氏病A型(Sanfillipo A disease)、聖菲利柏氏病B型(Sanfillipo B disease)、聖菲利柏氏病C型(Sanfillipo C disease)、Sanfillipo D病(Sanfillipo D disease)、辛德勒病(Schindler disease)、Schindler-Kanzaki、唾液酸貯積症(sialidosis)、斯利氏病(Sly Disease)、泰-薩克斯病(Tay-Sachs Disease)和沃爾曼病(Wolman Disease)。

在一些具體實例中，本發明的rAAV包含編碼用於治療亨廷頓氏病的治療多肽或治療核酸的異源核酸。在一些具體實例中，所述治療多肽或治療核酸在具有亨廷頓氏病的哺乳動物的CNS的細胞中抑制HTT的表現或抑制HTT的積累。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼靶向亨廷頓蛋白的miRNA。在一些具體實例中，所述亨廷頓蛋白包含與亨廷頓氏病相關的突變。

在一些具體實例中，本發明的rAAV顆粒包含編碼用於治療帕金森氏病的治療多肽或治療核酸的異源核酸。在一些具體實例中，所述治療多肽是膠質衍生的生長因子(GDNF)、腦衍生的生長因子(BDNF)、酪胺酸羥化酶(TH)、GTP-環化水解酶(GTPCH)和/或胺基酸脫羧酶(AADC)。

在本發明的系統的一些具體實例中，所述rAAV顆粒在組合物中。在進一步的具體實例中，所述組合物是包含藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。

在本發明的系統的一些具體實例中，所述rAAV顆粒通過將編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸三重轉染入宿主細胞而產生，其中所述核酸至所述宿主細胞的轉染生成能夠產生rAAV顆粒的宿主細胞。在其他具體實例中，所述rAAV顆粒藉由包含一個或多個編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸的生產細胞系產生。

在本發明的系統的一些具體實例中，所述rAAV顆粒藉由立體定向遞送進行遞送。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒藉由對流增強遞送進行遞送。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒使用CED遞送系統遞送。在一些具體實例中，所述CED系統包含套管。在一些具體實例中，所述套管是抗返流套管或階梯套管。在一些具體實例中，所述CED系統包含泵。在一些具體實例中，所述泵是手動泵。在一些具體實例中，所述泵是滲透泵。在一些具體實例中，所述泵是輸注泵。

在一些方面中，本發明提供用於在上述任何方法中使用的套組，其中所述套組包含rAAV顆粒，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型1(AAV1)衣殼。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。

在一些方面中，本發明提供用於在哺乳動物中治療亨廷頓氏病的套組，其包含含有有效量的rAAV顆粒的組合物，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。在一些方面中，本發明提供用於在哺乳動物中治療帕金森氏病的套組，其包含含有有效量的rAAV顆粒的組合物，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。在一些具體實例中，所述套組的rAAV顆粒包含AAV血清型1(AAV1)衣殼或AAV血清型2(AAV2)衣殼。在一些具體實例中，所述套組進一步包含用於將rAAV顆粒遞送至紋狀體的裝置。在一些具體實例中，所述套組的rAAV顆粒在組合物中。在一些具體實例中，所述組合物包含緩衝劑和/或藥學上可接受的賦形劑。在進一步的具體實例中，所述套組包含用於將rAAV顆粒的組合物遞送至紋狀體的說明書。

在一些方面中，本發明提供用於上述任何方法中使用的rAAV顆粒。在一些方面中，本發明提供用於將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒遞送至哺乳動物的中樞神經系統的rAAV顆粒，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。在一些方面中，本發明提供用於將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒遞送至哺乳動物的中樞神經系統的rAAV顆粒，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現，且其中所述rAAV顆粒包含AAV血清型1(AAV1)衣殼。在一些方面中，本發明提供用於將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒遞送至哺乳動物的中樞神經系統的rAAV顆粒，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現，且其中所述rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。

在一些方面中，本發明提供用於在哺乳動物中治療亨廷頓氏病的rAAV顆粒，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。在一些方面中，本發明提供用於在哺乳動物中治療帕金森氏病的rAAV顆粒，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV2衣殼。在一些具體實例中，所述哺乳動物是人。

在一些具體實例中，將本發明的rAAV顆粒至少投予至紋狀體的殼核和尾狀核。在一些具體實例中，將所述rAAV顆粒至少投予至紋狀體每半球的殼核和尾狀核。在一些具體實例中，將所述rAAV顆粒至少投予至尾狀核中的一處位點和殼核中的兩處位點。在一些具體實例中，投予至殼核的rAAV顆粒與投予至尾狀核的rAAV顆粒的比例為至少約2：1。在一些具體實例中，所述異源核酸在哺乳動物的額葉皮質、枕葉皮質和/或層IV中表現。在一些具體實例中，所述異源核酸在前額葉相關皮質區、運動前區皮質、初級軀體感覺皮質區、感覺運動皮質、頂葉皮質、枕葉皮質和/或初級運動皮質中表現。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒在大腦皮質中經歷逆行或順行轉運。在一些具體實例中，所述異源核酸進一步在丘腦、底丘腦核、蒼白球、黑質和/或海馬區中表現。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸可操作地與啟動子連接。在一些具體實例中，所述啟動子在CNS的細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述啟動子在腦細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述啟動子在神經元和/或神經膠質細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述神經元是尾狀核的中型多棘神經元、殼核的中型多棘神經元、皮質層IV的神經元和/或皮質層V的神經元。在一些具體實例中，所述神經膠質細胞是星形膠質細胞。在一些具體實例中，所述啟動子是CBA啟動子、最小CBA啟動子、CMV啟動子或GUSB啟動子。在其他具體實例中，所述啟動子是誘導型。在進一步的具體實例中，所述rAAV載體包含一個或多個增強子、剪接供體/剪接受體對、基質附接位點或多聚腺苷酸化信號。在一些具體實例中，所述rAAV載體是自身互補的rAAV載體。在一些具體實例中，所述載體包含編碼異源核酸的第一核酸序列和編碼所述異源核酸的互補物的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。在一些具體實例中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列經由突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失且包含末端解析序列的突變。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療多肽或治療核酸。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療多肽。在一些具體實例中，所述治療多肽是酶、神經營養因子、在具有CNS相關病症的個體中缺失或突變的多肽、抗氧化劑、抗細胞凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎症因子、α-突觸核蛋白、酸性β-葡糖苷酶(GBA)、β-半乳糖苷酶-1(GLB1)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、半乳糖神經醯胺酶(GALC)、甘露糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶(MAN2B1)、β-甘露糖苷酶(MANBA)、假芳基硫酸酯酶A(ARSA)、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶(GNPTAB)、酸性鞘磷脂酶(ASM)、尼曼-匹克C蛋白(Niemann-Pick C蛋白)(NPC1)、酸性α-1,4-葡糖苷酶(GAA)、己糖胺酶β亞基、HEXB、N-硫代葡糖胺磺基水解酶(MPS3A)、N-α-乙醯葡糖胺酶(NAGLU)、肝素乙醯-CoA、α-葡糖胺酶N-乙醯轉移酶(MPS3C)、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶(GNS)、α-N-乙醯半乳糖胺酶(NAGA)、 β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、己糖胺酶α亞基(HEXA)、亨廷頓蛋白(huntingtin)(HTT)、溶酶體酸性脂肪酶(LIPA)、天冬胺醯葡糖胺酶、α-半乳糖苷酶A、棕櫚醯蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶體跨膜蛋白、半胱胺酸轉運蛋白、酸性神經醯胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、組織蛋白酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸、酸性β-半乳糖苷酶或α-神經胺酸酶。在其他具體實例中，所述異源核酸編碼治療核酸。在一些具體實例中，所述治療核酸是siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述治療多肽或治療核酸用於治療CNS的病症。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述CNS的病症是溶酶體貯積症(LSD)、亨廷頓氏病(Huntington's Disease)、癲癇、帕金森氏病(Parkinson's Disease)、阿爾茨海默氏病(Alzheimer's Disease)、中風、皮質基底節變性(CBD)、皮質基底神經節變性(CBGD)、額顳葉癡呆(FTD)、多系統萎縮(MSA)、進行性核上性麻痹(PSP)或腦癌。在一些具體實例中，所述病症是選自下組的溶酶體貯積症：天冬胺醯葡糖胺尿症(Aspartylglusoaminuria)、法布裡病(Fabry)、小兒巴藤病(Infantile Batten Disease)(CNL1)、經典晚期小兒巴藤病(Classic Late Infantile Batten Disease)(CNL2)、青少年巴藤病(Juvenile Batten Disease)(CNL3)、Batten形式CNL4、Batten形式CNL5、Batten形式CNL6、Batten形式CNL7、Batten形式CNL8、胱胺酸貯積症(Cystinosis)、法伯氏病(Farber)、岩藻糖苷貯積症(Fucosidosis)、半乳糖苷唾液酸貯積症(Galactosidosialidosis)、高歇氏病1型(Gaucher disease type 1)、高歇氏病2型(Gaucher disease type 2)、高歇氏病3型(Gaucher disease type 3)、GM1神經節苷脂貯積症(GM1 gangliosidosis)、亨特病(Hunter Disease)、克拉伯病(Krabbe Disease)、α甘露糖苷貯積症(α mannosidosis Disease)、β甘露糖苷貯積症(β mannosidosis Disease)、馬-拉病(Maroteaux-Lamy)、異染性腦白質營養不良症(metachromatic leukodystrophy Disease)、莫爾丘病A(Morquio A)、莫爾丘病B(Morquio B)、黏脂貯積症II/III病(mucolipidosisII/III Disease)、尼曼-匹克A病(Niemann-Pick A Disease)、尼曼-匹克B病(Niemann-Pick B Disease)、尼曼-匹克C病(Niemann-Pick C Disease)、龐貝氏症(Pompe Disease)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、聖菲利柏氏病A型(Sanfillipo A disease)、聖菲利柏氏病B型(Sanfillipo B disease)、聖菲利柏氏病C型(Sanfillipo C disease)、Sanfillipo D病(Sanfillipo D disease)、辛德勒病(Schindler disease)、Schindler-Kanzaki、唾液酸貯積症(sialidosis)、斯利氏病(Sly Disease)、泰-薩克斯病(Tay-Sachs Disease)和沃爾曼病(Wolman Disease)。

在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV顆粒藉由將編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸三重轉染入宿主細胞而產生，其中所述核酸至所述宿主細胞的轉染生成能夠產生rAAV顆粒的宿主細胞。在其他具體實例中，所述rAAV顆粒通過包含一個或多個編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸的生產細胞系產生。

本文引用的全部參考文獻，包括專利申請和公開，其以參考方式整體併入。

發明詳述

如本文詳述，發明人發現當遞送至紋狀體時(例如，通過對流增強遞送，CED)，AAV載體(例如AAV1和AAV2載體)有效靶向恒河猴腦中的紋狀體和皮質結構兩者。這些研究還評估了兩種不同的生產平臺，且這些研究證明藉由三重轉染和生產細胞系生成的AAV靶向恒河猴腦中的紋狀體和皮質結構兩者。使用兩平臺產生的rAAV顆粒(例如，AAV1和AAV2載體)的紋狀體內遞送能夠轉導定位於距離輸注位點(例如，皮質結構)相當遠的神經元以及紋狀體中的神經元。因此，本發明提供用於藉由將rAAV顆粒投予至紋狀體而將包含編碼異源核酸的rAAV載體的重組腺相關病毒(rAAV)顆粒遞送至哺乳動物的中樞神經系統的方法，其中異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體表現。

本發明還提供用於藉由將編碼至少在大腦皮質和紋狀體中表現的異源核酸的rAAV顆粒投予至紋狀體而治療哺乳動物中CNS病症(例如亨廷頓氏病)的方法，以及使用本文所述的rAAV顆粒用於在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現異源核酸的系統和套組。本發明中的方法還可採用用於將rAAV顆粒遞送至哺乳動物紋狀體的遞送裝置(例如CED裝置)等，本發明的系統和套組可進一步包含用於將rAAV顆粒遞送至哺乳動物紋狀體的裝置。

I. 一般技術

本文描述和引用的技術和方法為本領域的技術人員一般充分理解的且使使用常規方法學所通常採用的，如例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook等，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等編，2003)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor編，1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane，編，1988)；Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney，第6版，J.Wiley and Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編，Academic Press,1998)；Introduction toCell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths，和D.G.Newell，編，J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell，編，1996)；Gene Transfer vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos，編，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等編，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等編，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等編，J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等，2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.編，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean，編，Oxford University Press,2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra，編，Harwood Academic Publishers,1995)和Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等編，J.B.Lippincott Company,2011)中所述的廣泛採用的方法學。

II. 定義

如本文使用的“載體”指包含體外或體內待遞送入宿主細胞的重組質體或病毒。

如本文使用的術語“多核苷酸”或“核酸”指任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)的多聚形式。因此，該術語包括但不限於單-、雙-或多鏈DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體或包含嘌呤和嘧啶鹼基的多聚物或其他天然、化學或生物修飾的、非天然的或衍生的核苷酸鹼基。多核苷酸骨架可包含糖和磷酸基團(如通常在RNA或DNA中所發現)，或修飾或取代的糖或磷酸基團。可替換地，多核苷酸骨架可包含合成亞基如胺基磷酸酯的多聚物且因此可以是寡脫氧核苷胺基磷酸酯(P-NH₂)或混合胺基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外，雙鏈多核苷酸可從化學合成的單鏈多核苷酸產物通過合成互補鏈和在合適的條件下退火該鏈，或用合適的引物通過使用DNA聚合酶從頭合成互補鏈而獲得。

術語“多肽”和“蛋白”可互換使用以指代胺基酸殘基的多聚物且不限於最小長度。這種胺基酸殘基的多聚物可包含天然或非天然胺基酸殘基，且包括但不限於肽、寡肽、胺基酸殘基的二聚體、三聚體和多聚體。定義涵蓋全長的蛋白及其片段兩者。術語還包括多肽的表現後修飾，例如，糖基化、唾液酸化、乙醯化，磷酸化等。此外，就本發明而言，“多肽”指包含對天然序列的修飾的蛋白，如缺失、添加和取代(通常是性質上保守的)，只要蛋白保持預期活性。這些修飾可以是刻意的，如通過定點誘變，或可以是意外發生的，如通過產生蛋白的宿主的突變或由於PCR擴增的錯誤。

“重組病毒載體”指包含一個或多個異源序列(即非病毒來源的核酸序列)的重組多核苷酸載體。在重組AAV載體的情況中，重組核酸側翼為至少一個反向末端重複序列(ITR)。在一些具體實例中，重組核酸側翼為兩個ITR。

“重組AAV載體(rAAV載體)”指包含一個或多個異源序列(即非AAV來源的核酸序列)的多核苷酸載體，所屬異源序列側翼為至少一個或兩個AAV反向末端重複序列(ITR)。當存在於已用合適的輔助病毒感染(或表現合適的輔助功能)且表現AAV rep和cap基因產物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主細胞中，這種rAAV載體可複製並包裝入傳染性病毒顆粒。當rAAV載體併入更大的多核苷酸(例如在染色體中或另一用於選殖或轉染的載體如質體)時，則rAAV載體可稱作“促載體”，其在AAV包裝功能和合適的輔助功能存在下可藉由複製和衣殼化“挽救(rescue)”。rAAV載體可以是任何多種形式的，包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質的複合、包囊於脂質體內和衣殼化於病毒顆粒中；例如AAV顆粒。rAAV載體可包裝入AAV病毒衣殼以生成“重組腺相關病毒顆粒(rAAV顆粒)”。

“異源”意為源自與其所比較的或其所導入或併入的其餘實體基因型上獨特的實體。例如，通過基因工程技術導入不同細胞類型的多核苷酸是異源多核苷酸(且，當表現時，可編碼異源多肽)。相似地，併入病毒載體的細胞序列(例如基因或其部分)是相對於該載體的異源核苷酸序列。異源核酸可指源自與其所比較的或其所導入或併入的其餘實體基因型上獨特的實體的核酸。

術語“異源核酸”指導入細胞且能夠轉錄成RNA且任選地翻譯和/或在合適條件下表現的多核苷酸。在一些方面中，其賦予所導入的細胞預期的特徵，或以其他方式導致預期的治療或診斷成果。另一方面，其可轉錄成介導RNA干擾的分子，如miRNA、siRNA或shRNA。

“雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子”指源自雞β-肌動蛋白基因的多核苷酸序列(例如，原雞(Gallus gallus)β肌動蛋白，由GenBank Entrez基因ID 396526所示)。如本文使用的“雞β-肌動蛋白啟動子”可指包含巨細胞病毒(CMV)早期增強元件、該啟動子和雞β-肌動蛋白基因的第一外顯子和內含子和兔β-珠蛋白基因的剪接受體的啟動子，如描述於Miyazaki,J.等(1989)Gene 79(2)：269-77的序列。如本文使用的術語“CAG啟動子”可互換使用。如本文使用的術語“CMV早期增強子/雞β肌動蛋白(CAG)啟動子”可互換使用。

如提及病毒滴度使用的術語“基因組顆粒(gp)”、“基因組等價物”或“基因組拷貝”指包含重組AAV DNA基因組的病毒顆粒數目，無論感染性或功能性。特定載體製備物的基因組顆粒數目可藉由如描述於本文實施例或例如Clark等(1999)Hum.Gene Ther.,10：1031-1039；Veldwijk等(2002)Mol.Ther.,6：272-278中的方法測量。

如本文使用的術語“載體基因組(vg)”可指包含載體例如病毒載體的多核苷酸序列集合的一個或多個多核苷酸。載體基因組可以在病毒顆粒中衣殼化。取決於特定的病毒載體，載體基因組可包含單鏈DNA、雙鏈DNA或單鏈RNA或雙鏈RNA。載體基因組可包含與特定病毒載體相關的內源序列和/或任何藉由重組技術插入特定病毒載體的異源序列。例如，重組AAV載體基因組可包含啟動子側翼的至少一個ITR序列、感興趣的序列(例如異源核酸)和多聚腺苷酸化序列。完整的載體基因組可包含載體多核苷酸序列的完整集合。在一些具體實例中，病毒載體的核酸滴度可以vg/mL計測量。適於測量該滴度的方法為本領域已知(例如定量PCR)。

如指代病毒滴度使用的術語“感染單位(iu)”、“感染顆粒”或“複製單位”指如藉由感染性中心測定法(也稱為複製中心測定法，如例如McLaughlin等(1988)J.Virol.,62：1963-1973中所述)所測量的感染性和有複製能力的重組AAV載體顆粒的數目。

指代病毒滴度所使用的術語“轉導單位(tu)”指如本文實施例所述的功能性測定法或例如Xiao等(1997)Exp.Neurobiol.,144：113-124或Fisher等(1996)J.Virol.,70：520-532(LFU試驗)中所測量的導致功能性異源核酸產物產生的感染性重組AAV載體顆粒的數目。

“反向末端重複”或“ITR”序列是本領域熟知的術語且指代在病毒基因組末端發現的處於相反方向的相對短的序列。

“AAV反向末端重複(ITR)”序列為本領域熟知，是在天然單鏈AAV基因組兩末端都存在的約145個核苷酸的序列。ITR最外側的125個核苷酸可以可替換的兩個方向存在，導致不同AAV基因組之間和單AAV基因組兩末端之間的異質性。最外側的125個核苷酸還包含數個自我互補的較短區(稱為A、A'、B、B'、C、C'和D區)，允許鏈內鹼基配對以在ITR的該部分內發生。

“末端解析序列”或“trs”是AAV ITR D區中的序列，其在病毒DNA複製過程中通過AAV rep蛋白裂解。突變的末端解析序列難以藉由AAV rep蛋白裂解。

“AAV輔助功能”指允許AVV通過宿主細胞複製並包裝的功能。AAV輔助功能可以任何多種形式提供，包括但不限於幫助AAV複製和包裝的輔助病毒或輔助病毒基因。其他AAV輔助功能為本領域已知如遺傳毒性劑。

AAV的“輔助病毒”指允許AAV(其為有缺陷的細小病毒)通過宿主細胞複製並包裝的病毒。輔助病毒提供"輔助功能"，其允許AAV的複製。已確定多種這樣的輔助病毒，包括腺病毒、皰疹病毒(herpesvirus)和痘病毒(poxvirus)如牛痘(vaccinia)和桿狀病毒(baculovirus)。腺病毒涵蓋多種不同的亞群，儘管亞群C的5型腺病毒(Ad5)是最常使用的。人、非人哺乳動物和禽類來源的多種腺病毒為已知且可從寄存機構如ATCC獲得。皰疹病毒家族(也可從寄存機構如ATCC獲得)包括例如單純皰疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)，巨細胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)和偽狂犬病病毒(pseudorabies virus)(PRV)。用於AAV複製的腺病毒輔助功能的實例包括E1A功能、E1B功能、E2A功能、VA功能和E4orf6功能。可從寄存機構獲得的桿狀病毒(Baculovirus)包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)。

據稱，如果感染性AAV顆粒與感染性輔助病毒顆粒的比率至少為約10²：1、至少約10⁴：1、至少約10⁶：1或至少約10⁸：1或更多，則rAAV的製備“基本上無”輔助病毒。在一些具體實例中，製劑還基本上無等量的輔助病毒蛋白(即如果上文所示的輔助病毒顆粒雜質以破壞的形式存在，則蛋白將作為該輔助病毒水平的結果存在)。病毒和/或細胞蛋白污染一般可從考馬斯染色條帶在SDS凝膠上存在而觀察到(例如，除對應於AAV衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的那些之外的條帶的出現)。

“AAV輔助功能”指允許AAV複製並通過宿主細胞包裝的功能。AAV輔助功能可以多種形式中的任意提供，包括但不限於幫助AAV複製和包裝的輔助病毒或輔助病毒基因。其他AAV輔助功能為本領域已知如遺傳毒性劑。AAV的“輔助病毒”指允許AAV(其為有缺陷的細小病毒)複製並通過宿主細胞包裝的病毒。已鑒別多種這樣的輔助病毒，包括腺病毒、皰疹病毒和痘病毒如牛痘。腺病毒涵蓋多種不同的亞群，儘管亞群C的5型腺病毒(Ad5)是最常用的。多種人、非人哺乳動物和禽類來源的腺病毒為已知且可從寄存機構如ATCC獲得。皰疹病毒家族的病毒也可從寄存機構如ATCC獲得，其包括例如單純皰疹病毒(HSV)，EB病毒(EBV)，巨細胞病毒(CMV)和偽狂犬病病毒(PRV)。

相對於參照多肽或核酸序列的“百分比(%)序列同一性”定義為對齊序列和導入缺口後(如果需要的話)以實現最大百分比序列同一性，且不考慮任何保守取代作為序列同一性的部分，與參照多肽或核酸序列中的胺基酸殘基或核苷酸相同的候選序列中的胺基酸殘基或核苷酸的百分比。出於確定百分比胺基酸或核酸序列同一性的目的，可以多種本領域已知的方式實現比對，例如，使用公眾可獲得的計算機軟體程序，例如，描述於Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等編，1987),Supp.30,section 7.7.18，表7.7.1的那些，且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。比對程序的實例是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,Pennsylvania)。本領域的技術人員可確定用於測量比對的合適參數，包括任何以實現在所比較的序列全長上實現最大比對所需的算法。就本文而言，給定胺基酸序列A對、與或針對給定胺基酸序列B的%胺基酸序列同一性(其可替換地可稱為具有或包含對、與或針對胺基酸序列B一定%胺基酸序列同一性的胺基酸序列A)如下計算：100乘以分數X/Y，其中X是在A和B的程序比對中通過序列比對軟體評分為相同匹配的胺基酸殘基的數目，且其中Y是B中胺基酸殘基的總數。可以理解的是其中胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不等，A對B的%胺基酸序列同一性將不等於B對A的%胺基酸序列同一性。就本文而言，給定核酸序列C對、與或針對給定核酸序列D的%核酸序列同一性(其可替換地可稱為對、與或針對給定核酸序列D具有或包含一定%核酸序列的給定核酸序列C)如下計算：100乘以分數 W/Z，其中W是在C和D的程序比對中通過序列比對軟體評分為相同匹配的核苷酸的數目，且其中Z是D中核苷酸的總數。可以理解的是其中核酸序列C的長度不等於核酸序列D的長度，C對D的%核酸序列同一性將不等於D對C的%核酸序列同一性。

“分離的”分子(例如核酸或蛋白)或細胞意為已鑑定和分離和/或從其天然環境的組分回收。

“有效量”是足以影響有益的或預期的結果，包括臨床結果(例如改善症狀、實現臨床終點等)的量。有效量可以一次或多次投予。就疾病狀態而言，有效量是足以改善、穩定或延遲疾病進展的量。

如本文使用的術語“對流增強遞送(CED)”可指治療劑藉由以其中流體靜力壓力導致對流分配的速率向CNS的遞送。在一些具體實例中，輸注以大於0.5μL/分鐘的速率完成。然而，可使用任何合適的流動速率進而使顱內壓維持在合適的水平從而不損傷腦組織。可例如通過使用合適的導管或套管(例如，步驟設計無反流套管)經由至少在靶CNS組織接近處定位套管的尖端(例如，將尖端插入CNS組織)實現CED，。定位套管後，其通過套管尖端與遞送治療劑的泵連接以靶向CNS組織。來自套管尖端的壓力梯度可在輸注過程中維持。在一些具體實例中，輸注可通過可檢測的追蹤劑由成像方法如術中磁共振(iMRI)或另一即時MRI技術監測和/或通過標準立體注射設備和技術遞送(例如來自MRI Interventions,Memphis,TN的ClearPoint®系統)。

如本文使用的術語“泊洛沙姆(poloxamer)”可指嵌段共聚物，其由側翼為兩條聚氧乙烯鏈的聚氧丙烯鏈生成。泊洛沙姆下可售的商品名包括但不限於PLURONIC^®(BASF)、KOLLIPHOR^®(BASF)、LUTROL^®(BASF)和SYNPERONIC^®(Croda International)。

“個體”或“受試者”是哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物(例如，牛、綿羊(sheep)、貓、狗和馬)、靈長類動物(例如，人和非人靈長類動物如猴)、兔和齧齒類動物(例如小鼠和大鼠)。在一些具體實例中，個體或受試者是人。

如本文使用的“治療”是用於獲得有益或預期的臨床結果的方式。就本發明而言，有益或預期的臨床結果包括但不限於症狀改善、疾病程度的減少、疾病的穩定化(例如未惡化)狀態、疾病傳播(例如轉移)的防止、疾病進展的延遲或減緩、疾病狀態的改善或緩和以及緩解(無論部分或全部)，無論是可檢測的或不可檢測的。“治療”還可意為與未接受治療的預期生存率相比延長生存率。

如本文使用的術語“預防性治療”指治療，其中個體已知或疑似具有或處於具有病症的風險，但未顯示或顯示最小的病症症狀。經歷預防性治療的個體可在症狀發生前治療。

“亨廷頓氏病(HD)”指進展性腦病症，通常由HTT基因中的突變引起(又名亨廷頓蛋白，HD或IT15)。其可通過下列症狀表徵：異常運動(稱為舞蹈病)、運動功能逐漸喪失、情緒或精神疾病和漸進性認知障礙。儘管大多症狀在30和40歲出現，但已發現疾病的青少年形式。對於HD的進一步描述，參見OMIM Entry No.143100，其在本文以參考方式整體併入。

“亨廷頓蛋白(HTT)”可指與大多數亨廷頓氏病情況相關的基因或其多肽產物。亨廷頓蛋白的正常功能尚未完全理解。然而，已知亨廷頓蛋白基因中的突變引起HD。這些突變通常以常染色體顯性遺傳方式遺傳且涉及HTT基因中三核苷酸CAG重複的擴增，導致Htt蛋白中的多聚穀胺醯胺(多聚Q)束。

如本文使用的“治療”劑(例如治療多肽、核酸、轉基因等等) 是提供有益或預期臨床結果的那些，如上文所述的例示性臨床結果。由此，治療劑可用於如上文所述的治療。

本文值或參數“約”的指代包括(和描述)針對值或參數本身的具體實例。例如，指“約X”的描述包括“X”的描述。

除非另外指示，如本文使用的製品的單數形式“一種”、“一個”和“所述”包括複數指稱。

可以理解的是，本文所述的本發明的方面和具體實例包括“包含”、“由...組成”和/或“基本上由...組成”的方面和具體實例。

III. 用於遞送rAAV顆粒的方法

在一些方面中，本發明提供用於遞送重組腺相關病毒(rAAV)顆粒至哺乳動物的中樞神經系統的方法，其包括投予rAAV顆粒至紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。另一方面，本發明提供用於遞送rAAV顆粒至哺乳動物的中樞神經系統的方法，其包括投予rAAV顆粒至紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現且其中所述rAAV顆粒包含AAV血清型1(AAV1)衣殼。另一方面，本發明提供用於遞送rAAV顆粒至哺乳動物的中樞神經系統的方法，其包括投予所述rAAV顆粒至紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現且其中所述rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。另一方面，本發明提供用於治療哺乳動物中亨廷頓氏病的方法，其包括投予所述rAAV顆粒至紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。在一些具體實例中，所述哺乳動物是人。

本文的一些方面涉及將rAAV顆粒投予至中樞神經系統(CNS)的一個或多個區域。在一些具體實例中，將rAAV顆粒投予至紋狀體。已知紋狀體作為腦的一個區域接受來自大腦皮質(術語“皮質”在本文可交換使用)的輸入並將輸出送至基底節(紋狀體還指紋狀核和新紋狀體)。如上文所述，紋狀體控制運動神經運動和情感控制/動力且已牽涉多種神經疾病如亨廷頓氏病。數種感興趣的細胞類型都位於紋狀體，包括但不限於多棘投射神經元(也稱為中型多棘神經元)、GABA能中間神經元和膽鹼能中間神經元。中型多棘神經元構成大部分的紋狀體神經元。這些神經元為GABA能且表現多巴胺受體。腦部的每個半球都包含紋狀體。

紋狀體重要的亞結構包括尾狀核和殼核。在一些具體實例中，將rAAV顆粒投予至尾狀核(術語“尾狀葉”在本文可交換使用)。已知尾狀核是背側紋狀體的結構。尾狀核已牽涉功能控制如指向性運動、空間工作記憶、記憶、目標指向性行為、情緒、睡眠、語言和學習。腦部的每個半球都包含尾狀核。

在一些具體實例中，將rAAV顆粒投予至殼核。連同尾狀核，殼核已知是背側紋狀體的結構。殼核包含豆狀核的部分且將大腦皮質與黑質和蒼白球連接。與許多腦部其他結構高度整合，殼核已牽涉功能的控制如學習、運動學習、運動表現，運動任務和肢體運動。腦部的每個半球都包含殼核。

可將rAAV顆粒投予至紋狀體的一個或多個位點。在一些具體實例中，將rAAV顆粒投予至紋狀體的殼核和尾狀核。在一些具體實例中，將rAAV顆粒投予至每個半球紋狀體的殼核和尾狀核。在一些具體實例中，將rAAV顆粒投予至尾狀核中的至少一個位點和殼核中的至少兩個位點。

在一些具體實例中，將rAAV顆粒投予至腦部的一個半球。在一些具體實例中，將rAAV顆粒投予至腦部的兩個半球。例如，在一些具體實例中，將rAAV顆粒投予至每半球紋狀體的殼核和尾狀核。在一些具體實例中，將包含rAAV顆粒的組合物使用至每半球的紋狀體。在其他具體實例中，將包含rAAV顆粒的組合物投予至左半球的紋狀體或右半球的紋狀體和/或左半球的殼核或右半球的殼核。在一些具體實例中，將包含rAAV顆粒的組合物投予至左半球尾狀核、右半球尾狀核、左半球殼核和右半球殼核的任何組合。

在一些具體實例中，將包含rAAV顆粒的組合物同時或順序投予於多於一個位置。在一些具體實例中，包含rAAV顆粒的組合物的多次注射為不多於大約任何下列間隔：1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、9小時、12小時或24小時。在一些具體實例中，包含rAAV顆粒的組合物的多次注射間隔多於約24小時。

一般地，可遞送約1μL至約1mL的本發明的組合物(例如約100μL至約500μL的組合物)。在一些具體實例中，遞送至殼核的組合物的量多於遞送至尾狀核的體積。在一些具體實例中，遞送至殼核的組合物的量為遞送至尾狀核的體積的約2倍。在其他具體實例中，遞送至殼核的組合物的量為遞送至尾狀核的體積的大約下述中的任何：1倍、1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、2.25倍、2.5倍、2.75倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍或10倍(或其中的任何比率)。例如，在一些具體實例中，投予至殼核的rAAV顆粒與投予至尾狀核的rAAV顆粒的比率為至少約2：1(例如將約30μL的組合物投予至每半球的尾狀核和將將約60μL的組合物投予至每半球的殼核)。在一些具體實例中，將約20μL至約50μL的組合物(或其間的任何量)投予至每半球的尾狀核，且將約40μL至約100μL的組合物(或其間的任何量)投予至每半球的殼核。在一些具體實例中，投予至每半球尾狀核的組合物的體積少於大約任何下列體積(μL)：50、45、40、35、30或25。在一些具體實例中，投予至每半球尾狀核的組合物的體積多於大約任何下列體積(μL)：20、25、30、35、40或45。也就是說，投予至每半球尾狀核的組合物的體積可以是具有50、45、40、35、30或25的上限和獨立選自20、25、30、35、40或45的下限間的任何體積範圍，其中所述下限少於所述上限。在一些具體實例中，投予至每半球殼核的組合物的體積少於大約任何下列體積(μL)：100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50或45。在一些具體實例中，投予至每半球殼核的組合物的體積多於任何下列體積(μL)：40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95。也就是說，投予至每半球殼核的組合物的體積可以是具有100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50或45的上限和獨立選自40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95的下限間的任何體積範圍，其中所述下限少於所述上限。

在一些具體實例中，組合物以多於1μL/分鐘至約5μL/分鐘的速率投予至紋狀體。在一些具體實例中，組合物以多於1μL/分鐘至約5μL/分鐘的速率投予至尾狀核和殼核。在一些具體實例中，將組合物以多於大約任何下列的速率投予至紋狀體(尾狀核和/或殼核)：1μL/分鐘、2μL/分鐘、3μL/分鐘、4μL/分鐘、5μL/分鐘、6μL/分鐘、7μL/分鐘、8μL/分鐘、9μL/分鐘或10μL/分鐘。在一些具體實例中，將組合物以下列的任何速率投予至紋狀體(尾狀核和/或殼核)：約1μL/分鐘至約10μL/分鐘、約1μL/分鐘至約9μL/分鐘、約1μL/分鐘至約8μL/分鐘、約1μL/分鐘至約7μL/分鐘、約1μL/分鐘至約6μL/分鐘、約1μL/分鐘至約5μL/分鐘、約1μL/分鐘至約4μL/分鐘、約1μL/分鐘至約3μL/分鐘、約1μL/分鐘至約2μL/分鐘、約2μL/分鐘至約10μL/分鐘、約2μL/分鐘至約9μL/分鐘、約2μL/分鐘至約8μL/分鐘、約2 μL/分鐘至約7μL/分鐘、約2μL/分鐘至約6μL/分鐘、約2μL/分鐘至約5μL/分鐘、約2μL/分鐘至約4μL/分鐘、約2μL/分鐘至約3μL/分鐘、約3μL/分鐘至約10μL/分鐘、約3μL/分鐘至約9μL/分鐘、約3μL/分鐘至約8μL/分鐘、約3μL/分鐘至約7μL/分鐘、約3μL/分鐘至約6μL/分鐘、約3μL/分鐘至約5μL/分鐘、約3μL/分鐘至約4μL/分鐘、約4μL/分鐘至約10μL/分鐘、約4μL/分鐘至約9μL/分鐘、約4μL/分鐘至約8μL/分鐘、約4μL/分鐘至約7μL/分鐘、約4μL/分鐘至約6μL/分鐘、約4μL/分鐘至約5μL/分鐘、約5μL/分鐘至約10μL/分鐘、約5μL/分鐘至約9μL/分鐘、約5μL/分鐘至約8μL/分鐘、約5μL/分鐘至約7μL/分鐘、約5μL/分鐘至約6μL/分鐘、約6μL/分鐘至約10μL/分鐘、約6μL/分鐘至約9μL/分鐘、約6μL/分鐘至約8μL/分鐘、約6μL/分鐘至約7μL/分鐘、約7μL/分鐘至約10μL/分鐘、約7μL/分鐘至約9μL/分鐘、約7μL/分鐘至約8μL/分鐘、約8μL/分鐘至約10μL/分鐘、約8μL/分鐘至約9μL/分鐘或約9μL/分鐘至約10μL/分鐘。在一些具體實例中，在遞送的過程中將組合物以逐漸增加的流速(即“步進”)投予。

在一些具體實例中，實施一次rAAV顆粒投予。在其他具體實例中，多於一次投予rAAV顆粒的投予。本領域的技術人員可部分基於例如待治療的病症和/或對治療響應的患者確定實施多少次rAAV顆粒的投予。

在一些具體實例中，所述方法包括投予CNS有效量的重組病毒顆粒至紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在大腦皮質和紋狀體中表現。在一些具體實例中，rAAV顆粒的病毒滴度為至少大約任何下列：5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²、9×10¹²、10×10¹²、11×10¹²、15×10¹²、20×10¹²、25×10¹²、30×10¹²或50×10¹²基因組拷貝/mL。在一些具體實例中，rAAV顆粒的病毒滴度為大約任何下列：5×10¹²至6×10¹²、6×10¹²至7×10¹²、7×10¹²至8×10¹²、8×10¹²至 9×10¹²、9×10¹²至10×10¹²、10×10¹²至11×10¹²、11×10¹²至15×10¹²、15×10¹²至20×10¹²、20×10¹²至25×10¹²、25×10¹²至30×10¹²、30×10¹²至50×10¹²或50×10¹²至100×10¹²基因組拷貝/mL。在一些具體實例中，rAAV顆粒的病毒滴度為大約任何下列：5×10¹²至10×10¹²、10×10¹²至25×10¹²、或25×10¹²至50×10¹²基因組拷貝/mL。在一些具體實例中，rAAV顆粒的病毒滴度至少為大約任何下列：5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、10×10⁹、11×10⁹、15×10⁹、20×10⁹、25×10⁹、30×10⁹或50×10⁹轉導單位/mL。在一些具體實例中，rAAV顆粒的病毒滴度為大約任何下列：5×10⁹至6×10⁹、6×10⁹至7×10⁹、7×10⁹至8×10⁹、8×10⁹至9×10⁹、9×10⁹至10×10⁹、10×10⁹至11×10⁹、11×10⁹至15×10⁹、15×10⁹至20×10⁹、20×10⁹至25×10⁹、25×10⁹至30×10⁹、30×10⁹至50×10⁹或50×10⁹至100×10⁹轉導單位/mL。在一些具體實例中，rAAV顆粒的病毒滴度為大約任何下列：5×10⁹至10×10⁹、10×10⁹至15×10⁹、15×10⁹至25×10⁹或25×10⁹至50×10⁹轉導單位/mL。在一些具體實例中，rAAV顆粒的病毒滴度為至少大約任何下列：5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰、9×10¹⁰、10×10¹⁰、11×10¹⁰、15×10¹⁰、20×10¹⁰、25×10¹⁰、30×10¹⁰、40×10¹⁰或50×10¹⁰感染單位/mL。在一些具體實例中，rAAV顆粒的病毒滴度為至少大約任何下列：5×10¹⁰至6×10¹⁰、6×10¹⁰至7×10¹⁰、7×10¹⁰至8×10¹⁰、8×10¹⁰至9×10¹⁰、9×10¹⁰至10×10¹⁰、10×10¹⁰至11×10¹⁰、11×10¹⁰至15×10¹⁰、15×10¹⁰至20×10¹⁰、20×10¹⁰至25×10¹⁰、25×10¹⁰至30×10¹⁰、30×10¹⁰至40×10¹⁰、40×10¹⁰至50×10¹⁰或50×10¹⁰至100×10¹⁰感染單位/mL。在一些具體實例中，rAAV顆粒的病毒滴度為至少大約任何下列：5×10¹⁰至10×10¹⁰、10×10¹⁰至15×10¹⁰、15×10¹⁰至25×10¹⁰或25×10¹⁰至50×10¹⁰感染單位/mL。

在一些具體實例中，所述方法包括投予CNS有效量的重組病毒顆粒至紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含編碼至少在大腦皮質和紋狀體中表現的異源核酸的rAAV載體。在一些具體實例中，投予至個體的病毒顆粒的劑量為至少大約任何1×10⁸至約1×10¹³基因組拷貝/kg體重。在一些具體實例中，投予至個體的病毒顆粒的劑量為大約1×10⁸-1×10¹³基因組拷貝/kg體重。

在一些具體實例中，所述方法包括向CNS投予有效量的重組病毒顆粒於紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含編碼至少在大腦皮質和紋狀體中表現的異源核酸的rAAV載體。在一些具體實例中，投予至個體的病毒顆粒的總量為至少大約1×10⁹至約1×10¹⁴基因組拷貝。在一些具體實例中，投予至個體的病毒顆粒的總量為大約1×10⁹至約1×10¹⁴基因組拷貝。

可單獨使用本發明的組合物(例如rAAV顆粒)或與一個或多個額外的治療劑組合用於治療任何或全部本文描述的病症。順序投予之間的時間間隔可以至少(或可替換地少於)數分鐘、數小時或數天而言。

IV. 表現構築體

在一些方面中，本發明提供用於通過投予rAAV顆粒至紋狀體遞送rAAV顆粒至哺乳動物的CNS的方法。在一些具體實例中，rAAV顆粒包含rAAV載體。rAAV載體可編碼異源核酸(例如至少在大腦皮質和紋狀體中表現的異源核酸)。rAAV載體將在下文進一步詳述。

在一些具體實例中，rAAV載體編碼異源核酸。在一些具體實例中，異源核酸可編碼治療多肽或治療核酸。可使用治療多肽或治療核酸，例如以改善症狀、預防或延遲進展和/或提供病症的治療(例如本文所述的病症)。在一些具體實例中，將治療多肽或治療核酸用於治療如下文進一步詳述的CNS的病症。

異源核酸可表現於CNS內一個或多個感興趣的區域。例如，在一些具體實例中，異源核酸至少表現於大腦皮質和紋狀體。異源核酸能夠遍在地在整個CNS中表現，或其可表現於CNS細胞中的亞群。

在一些具體實例中，異源核酸表現於哺乳動物的額葉皮質、枕葉皮質和/或IV層。已知大腦皮質為哺乳動物腦部外側，其對於語言、感知、記憶、注意力和意識至關重要。大腦皮質由於其大量的解剖學和複雜的功能細分為數個不同的組分和區域。其可分為左半球和右半球。此外，其包含四個總葉：額葉、頂葉、顳葉、枕葉。額葉皮質可指皮質的額葉且已知提供廣泛的與非基於任務記憶、社交交流、做出決策和其他複雜的認知功能相關的神經功能。枕葉皮質可指皮質的枕葉且已知涉及視覺處理。頂葉皮質可指皮質的頂葉且已知涉及語言處理、本體感覺和與觸碰相關的感覺輸入。顳葉皮質可指皮質的顳葉且已知涉及語言、記憶和感情聯繫。

此外，描述了皮質區域的三種一般類型：感覺、運動和聯想。這些可以分為5中功能性亞類：主要運動皮質(參與肌肉控制)、運動前皮質(命令主要運動區域的高階運動區)、聯合區(例如頂葉-顳葉-枕葉或前額，這些區域參與計劃、記憶、注意力和其他更高的認知任務且假定人皮質的大部分)、高階區域(感覺處理)和初級感覺區(例如聽覺、視覺和體感)。在一些具體實例中，異源核酸表現於前額葉關聯皮質區、前運動皮質、初級體感皮質區、感覺運動皮質、頂葉皮質、枕葉皮質和/或初級運動皮質。

此外，大腦皮質可分為不同皮層(從淺表移動至深)，每一層包含神經連通性和細胞類型的特徵類型。這些層可分為上顆粒層(層I-III)、內顆粒層(IV)和下皮層(V和VI)。上顆粒層通常投射至其他皮層層次，而下皮層接受來自上顆粒層的輸入並將輸出送至皮質外的結構(例如運動、感覺和丘腦區域)。層V包含具有與皮層下結構如基底節連接的軸突的錐體神經元。初級運動皮質中的層V神經元還形成對於自發運動控制至關重要的皮質脊髓束。層IV接受來自丘腦的輸入並與列的其他部分連接，由此提供與丘腦和皮質的整合相關的重要功能。層IV的特徵性細胞包括星狀細胞(例如多棘星狀細胞)和錐體神經元。

在一些具體實例中，rAAV顆粒經歷逆行或順行轉運至大腦皮質中。逆行轉運指通過其將負載(例如rAAV顆粒)從神經元過程(例如軸突)移至細胞體的現象。順行轉運指從細胞體至細胞膜(例如突觸)的移動。認為AAV顆粒的順行轉運經由受體介導的內化在軸突末端發生，隨後微管介導運輸至核(參見例如Kaspar等，(2002)Mol.Ther.5：50-56；Boulis等，(2003)Neurobiol.Dis.14：535-541；Kaspar等，(2003)Science 301：839-842)。已知紋狀體包含來自其他腦區域的投射，如皮質區域。逆行和順行轉運允許rAAV顆粒遍及腦部分佈，如在皮質和丘腦間(參見例如Kells,A.P.等(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.106：2407-2411)。因此，不受理論限制，認為將AAV顆粒注射入一個腦部區域(例如紋狀體、尾狀核和/或殼核)可允許AAV顆粒通過逆行轉運遞送至腦部的其他區域(例如皮質)。

在一些具體實例中，異源核酸進一步表現於丘腦、黑質和/或海馬區。如上文所述，機制如順行和/或逆行轉運可允許注射入大腦皮質和/或紋狀體的rAAV顆粒分佈至腦部的其他區域，特別是與皮質連接的那些。丘腦在皮質和中腦間，從皮質下區域傳遞信號(例如感覺和運動)至皮質，並在警覺性和睡眠中發揮作用。丘腦還與海馬區(邊緣系統的部分和長期記憶鞏固的關鍵媒介)連接。基底節的部分黑質包含許多多巴胺能神經元且對於運動和獎勵至關重要。CNS病症如帕金森氏病與黑質中多巴胺能神經元的喪失相關。其進一步提供多巴胺至紋狀體，對於正常的紋狀體功能至關重要。

在一些方面中，本發明提供rAAV載體在預防和治療哺乳動物中一個或多個基因缺陷(例如遺傳性基因缺陷、體細胞基因改變等)的方法中的用途，如例如，導致受試者中多肽缺陷或多肽過剩的基因缺陷，或用於治療或減少體現與細胞和組織中這種多肽的缺陷相關聯的CNS相關病症受試者中缺陷的嚴重性或程度。在一些具體實例中，方法涉及以在具有或疑似具有CNS相關病症的受試者中足以治療所述病症的量和持續時間將藥學上可接受的載劑中的編碼一種或多種治療肽、多肽、功能性RNA、抑制性核酸、shRNA、微小RNA、反義核苷酸等的rAAV載體投予於受試者。

rAAV載體可包含轉基因，其為調節或治療CNS相關病症的蛋白或功能性RNA。下列是與CNS-相關病症有關的非限制性列表：神經凋亡抑制蛋白(NAIP)、神經生長因子(NGF)、神經膠質衍生的生長因子(GDNF)、腦衍生的生長因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、酪胺酸羥化酶(TM)，GTP-環化水解酶(GTPCH)、天門冬醯基酶(ASPA)、超氧化物歧化酶(SOD1)和胺基酸脫羧酶(AADC)。例如，在治療帕金森氏病中有用的轉基因編碼TH，其是一種在多巴胺合成中的限速酶。編碼生成TII輔因子四氫生物蝶呤的GTPCII的轉基因也可用於治療帕金森氏病。編碼GDNF或BDNF或AADC(其促進左旋多巴轉換成DA)的轉基因也可用於治療帕金森氏病。對於ALS的治療，有效的轉基因可編碼：GDNF、BDNF或CNTF。還對於ALS的治療，有用的轉基因可編碼抑制SOD1表現的功能性RNA，例如shRNA、miRNA。對於腦缺血的治療，有用的轉基因可編碼NAIP或NGF。編碼B-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的轉基因對於一些溶酶體貯積症(例如黏多糖貯積症VII型(MPS VII))的治療有用。編碼前體藥物激活基因的轉基因例如HSV-胸苷激酶(其將更昔洛韋(ganciclovir)轉化成破壞DNA合成並導致細胞死亡的毒性核苷酸)可用於治療一些癌症，例如當與前體藥物組合投予時。編碼內源性阿片如β-內啡肽的轉基因可用於治療疼痛。可用於本發明的rAAV載體的轉基因的其他實例對於本領域的技術人員會是顯而易見的(參見例如Costantini LC，等，Gene Therapy(2000)7,93-109)。

在一些具體實例中，異源核酸可編碼治療核酸。在一些具體實例中，治療核酸可包括但不限於siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。由此，治療核酸可編碼RNA，當其從載體核酸轉錄時，藉由干擾與本發明病症相關的異常或過剩蛋白的翻譯或轉錄治療本發明的病症(例如CNS病症)。例如，本發明的核酸可編碼RNA，所述RNA藉由高度特異性消除或減少編碼異常和/或過剩蛋白的mRNA來治療病症。治療RNA序列包括RNAi，小抑制性RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和/或核酶(如錘頭和髮夾狀核酶)，其可藉由高度特異性消除或減少編碼異常和/或過剩蛋白來治療病症。

在一些具體實例中，異源核酸可編碼治療多肽。治療多肽可例如補給多肽和/或酶活性，其在細胞或生物體中不存在或以減少的水平存在。可替換地，治療多肽可補給間接抵消細胞或生物體中失衡的多肽和/或酶活性。例如，用於由代謝酶或活性缺陷引起的代謝物的積聚相關的病症的治療多肽可補給失去的代謝酶或活性，或其可補給其他導致代謝物減少的酶或活性。治療多肽還可用於通過充當例如顯性負多肽來減少多肽的活性(例如通過獲得功能的突變過表現、活化的多肽，或其活性以其他方式誤調節的(misregulated)多肽)。

在一些具體實例中，治療多肽或治療核酸用於治療CNS的病症。不希望受理論限制，認為治療多肽或治療核酸可用於減少和消除其獲得功能已與病症相關的多肽的表現和/或活性，或增強多肽的表現和/或活性以補充與病症相關的缺陷(例如其表現顯示相似或相關活性的基因中的突變)。可藉由本發明的治療多肽或治療核酸治療的本發明CNS病症的非限制性實例(對於每種病症可靶向或補給的示例性基因在括號中提供)包括中風(例如caspase-3、Beclin1、Ask1、PAR1、HIF1α、PUMA和/或Fukuda,A.M.和Badaut,J.(2013)Genes(Basel)4：435-456中所述的任何基因)、亨廷頓氏病(突變的HTT)、癲癇(例如SCN1A、NMDAR、ADK和/或Boison,D.(2010)Epilepsia 51：1659-1668中所述的任何基因)、帕金森氏病(α-突觸核蛋白)、葛雷克氏症(Lou Gehrig，sdisease)(也稱為肌萎縮性側索硬化；SOD1)、阿爾茨海默氏病(tau、澱粉樣前體蛋白)、皮質基底節變性或CBD(tau)、皮質基底神經節變性或CBGD(tau)、額顳葉癡呆或FTD(tau)、進行性核上麻痹或PSP(tau)、多系統萎縮或MSA(α-突觸核蛋白)、腦癌(例如突變或過表現的牽涉腦癌的原癌基因)和溶酶體貯積症(LSD)。本發明的病症可包括涉及皮質大區域的那些，例如皮質的多於一個功能區域，皮質的多於一葉和/或整個皮質。其他可由本發明的治療多肽或治療核酸治療的本發明的疾病的非限制性實例包括創傷性腦損傷、酶功能障礙病症、精神病症(包括創傷後應激綜合征)、神經退行性疾病和認知病症(包括癡呆、自閉症和抑鬱)。酶功能障礙病症包括但不限於腦白質營養不良(包括Canavan病(Canavan’s Disease))和任何下文所述的溶酶體貯積症。

在一些具體實例中，治療多肽或治療核酸用於治療溶酶體貯積症。如本領域公知，溶酶體貯積症是罕見的遺傳代謝病症，其特徵在於溶酶體功能的缺陷。這種病症經常由對於正常的黏多糖、糖蛋白和/或脂質代謝所需的酶的缺陷引起，導致溶酶體保存的細胞材料的病理性積累。可由本發明的治療多肽或治療核酸治療的本發明溶酶體貯積症的非限制性實例(對於每種病症可靶向或補給的示例性基因在括號中提供)包括2型或3型高歇氏病(Gaucher disease)(酸性β-葡糖苷酶，GBA)、GM1神經節苷脂貯積症(β-半乳糖苷酶-1，GLB1)、亨特病(Hunter Disease)(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，IDS)、克拉伯病(Krabbe Disease)(半乳糖神經醯胺酶，GALC)、甘露糖苷貯積症(甘露糖苷酶，如α-D-甘露糖苷酶，MAN2B1)、β甘露糖苷貯積症(β-甘露糖苷酶，MANBA)、異染性腦白質營養不良症(metachromatic leukodystrophy Disease)(假芳基硫酸酯酶A，ARSA)、黏多糖貯積症II/III病(N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶，GNPTAB)、尼曼-匹克A症(Niemann-Pick A Disease)(酸性鞘磷脂酶，ASM)、尼曼-匹克C症(尼曼-匹克C蛋白，NPC1)、龐貝氏症(Pompe Disease)(酸性α-1,4-葡糖苷酶，GAA)、桑德霍夫病(Sandhoff Disease)(己糖胺酶β亞基，HEXB)，聖菲利柏氏病A型(N-磺基葡糖胺磺基水解酶，MPS3A)、聖菲利柏氏病B型(N-α-乙醯葡糖胺酶，NAGLU)、聖菲利柏氏病C型(肝素乙醯-CoA：α-葡糖胺酶N-乙醯轉移酶，MPS3C)、Sanfillipo D病(N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶，GNS)、辛德勒病(Schindler disease)(α-N-乙醯半乳糖胺酶，NAGA)、斯利氏病(β-葡糖醛酸糖苷酶，GUSB)、泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease)(己糖胺酶α亞基，HEXA)和沃爾曼病(Wolman disease)(溶酶體酸性脂肪酶，LIPA)。

其他的溶酶體貯積症以及與每種疾病相關的缺陷酶列於下列表1中。在一些具體實例中，列於下表的疾病藉由本發明的治療多肽或治療核酸治療，其補足或以其他方式補償相應地酶缺陷。

由此，在一些具體實例中，治療多肽是caspase-3、Beclin1、Ask1、PAR1、HIF1α、PUMA、SCN1A、NMDAR、ADK、α-突觸核蛋白、SOD1、β-葡萄糖苷酸(GBA)、β-半乳糖苷酶-1(GLB1)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、半乳糖神經醯胺酶(GALC)、甘露糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶(MAN2B1)、β-甘露糖苷酶(MANBA)、假芳基硫酸酯酶A(ARSA)、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶(GNPTAB)、酸性鞘磷脂酶(ASM)、尼曼-匹克蛋白C(NPC1)、酸性α-1,4-葡糖苷酶(GAA)、己糖胺酶β亞基、HEXB、N-硫代葡糖胺磺基水解酶(MPS3A)、N-α-乙醯葡糖胺酶(NAGLU)、肝素乙醯-CoA、α-葡糖胺酶N-乙醯轉移酶(MPS3C)、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶(GNS)、α-N-乙醯半乳糖胺酶(NAGA)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、己糖胺酶α亞基(HEXA)、亨廷頓蛋白(HTT)或溶酶體酸性脂肪酶(LIPA)。治療多肽可增加或減少受試者中靶多肽的功能(例如其可補給溶酶體貯積症中喪失的功能，或減少MSA中α-突觸核蛋白的水平，如caspase阻斷其功能或功能障礙)。在一些具體實例中，治療核酸是caspase-3、Beclin1、Ask1、PAR1、HIF1α、PUMA、SCN1A、NMDAR、ADK、α-突觸核蛋白、SOD1、β-葡萄糖苷酸(GBA)、β-半乳糖苷酶-1(GLB1)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、半乳糖神經醯胺酶(GALC)、a甘露糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶(MAN2B1)、β-甘露糖苷酶(MANBA)、假芳基硫酸酯酶A(ARSA)、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶(GNPTAB)、酸性鞘磷脂酶(ASM)、尼曼-匹克蛋白C(NPC1)、酸性α-1,4-葡糖苷酶(GAA)、己糖胺酶β亞基、HEXB,N-硫代葡糖胺磺基水解酶(MPS3A)、N-α-乙醯葡糖胺酶(NAGLU)、肝素乙醯-CoA、α-葡糖胺酶N-乙醯轉移酶(MPS3C)、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶(GNS)、α-N-乙醯半乳糖胺酶(NAGA)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、己糖胺酶α亞基(HEXA)或溶酶體酸性脂肪酶(LIPA)。治療核酸可增加或減少受試者中靶多肽的功能(例如其可補給溶酶體貯積症中喪失的功能或減少MSA中α-突觸核蛋白的水平，如caspaseRNAi)。

皮質和紋狀體中AAV表現可有效的例示性疾病是亨廷頓氏病(HD)。亨廷頓氏病由CAG重複擴大突變導致，其在突變的亨廷頓蛋白蛋白(mHTT)中編碼拉長的多聚穀胺醯胺(多聚Q)重複。HD是基於DNA和RNA 療法特別引人注目的靶標，這是由於其為由單等位基因上的突變導致的常染色體顯性遺傳疾病。AAV載體提供理想的遞送系統用於核酸治療且允許這些降低腦中分子的亨廷頓蛋白持久和持續的表現。為實現HD中的最大臨床效力，可能需要向紋狀體和皮質都遞送。HD患者腦部的事後分析揭示了紋狀體中廣泛的中型多棘神經元的喪失，以及大腦皮質和海馬區錐體神經元的喪失。進來使用HD的條件性轉基因小鼠模型顯示在紋狀體和皮質中遺傳上降低神經元群體中的mHTT表現相比在單獨的各位點降低mHTT提供顯著更高的效力(Wang等，(2014)Nature medicine 20：536-541)。總之，該證據表明基因治療劑遞送至紋狀體和皮層兩區域對於最大治療效力可能是理想的。

使用基因治療載體以遞送生物製劑至牽涉亨廷頓氏病例生成的關鍵腦區是挑戰性的，很大程度上是由於特異性有效遞送載體至紋狀體和大腦皮質的物理限制。儘管多重直接輸注在小動物腦中有效，由於靈長類動物中腦組織的結構和體積，藉由單一位點輸注實現廣泛的紋狀體和皮質遞送變得更加困難。因此，發明人發現的紋狀體投予可實現廣發的rAAV分佈包括皮質和紋狀體在治療亨廷頓氏病中具有功用。

因此，本發明的一些方面涉及在哺乳動物中用於治療亨廷頓氏病的方法，其包括投予rAAV顆粒至紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。HD藉由涉及整體運動和運動控制、認知和心理健康的進行性症狀表徵。雖然症狀的精確特徵和程度在個體間不同，症狀一般隨時間進展。在大多數的情況中，症狀在30-40歲開始出現，伴隨運動技能、認知和個性的細微中斷。隨時間這些進展成為不平穩、無法控制的運動和肌肉控制喪失、癡呆和精神疾病如抑鬱、侵略、焦慮和強迫行為。死亡通常在症狀發病後的10-15年發生。少於10%的HD情況涉及疾病的青少年發病形式，其由更快的疾病進展表徵。認為約10,000的美國人中約有1人具有HD。

HD的大多數情況與HTT基因中的三核苷CAG重複擴展相關。HTT基因中CAG重複的數目與HD的表現強烈相關。例如，具有35或更少重複的個體通常不發展HD，但具有27-35重複的個體具有更高的風險其後代將具有HD。具有36至40-42重複的個體具有不完全顯性的HD，而具有多於40-42重複的個體顯示完全的顯性。青少年發病的HD情況可與60或更多大小的CAG重複相關。

由該CAG重複擴大導致的多聚Q-擴大的Htt蛋白與細胞聚集物或包涵體、擾動的蛋白穩態和轉錄失調相關。儘管這些毒性表型可與機體的數個部分相關，其最常與神經元細胞死亡相關。HD患者經常顯示皮質變薄和紋狀體神經元驚人的、進行性喪失。紋狀體表現為對HD最脆弱的腦部區域(特別是紋狀體中型多棘神經元)，在殼核和尾狀核中可見早期影響。在HD患者的腦中觀察到紋狀體多棘神經元中的細胞死亡、增加數目的星形膠質細胞和小神經膠質細胞的激活。HD還可影響海馬區、大腦皮質、丘腦、下丘腦和小腦的一些區域。

HD的動物模型可用於測試潛在的治療策略，如本公開的組合物和方法。用於HD的小鼠模型為本領域已知。這些包括具有突變的HTT片段的小鼠模型如R6/1和N171-82Q HD小鼠(Harper等，(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5820-5825,Rodriguez-Lebron等，(2005)Mol.Ther.12：618-633,Machida等，(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.343：190-197)。本文所述的小鼠HD模型的另一實例是YAC128小鼠模型。該模型具有表現有128 CAG重複的突變人HTT基因的酵母人工染色體(YAC)，且YAC128在12個月齡小鼠紋狀體中顯示Htt聚集體的顯著和廣泛的積累 (Slow等，(2003)Hum.Mol.Genet.12：1555-1567,Pouladi等，(2012)Hum.Mol.Genet.21：2219-2232)。

還可使用用於HD的其他動物模型。例如，已描述了轉基因大鼠(von Horsten,S.等(2003)Hum.Mol.Genet.12：617-24)和恒河猴(Yang,S.H.等(2008)Nature 453：921-4)模型。還已知非遺傳模型。這些最經常涉及興奮毒性化合物(如喹啉酸或紅藻胺酸)或線粒體毒素(如3-硝基丙酸和丙二酸)的使用以誘導齧齒動物或非人靈長類中的狀體神經元細胞死亡(對於更多的描述和參考，參見Ramaswamy,S.等(2007)ILAR J.48：356-73)。

在一些方面中，本發明提供用於改善HD症狀的方法，其包括投予包含編碼異源核酸的AAV載體的rAAV顆粒至紋狀體，所述異源核酸至少在大腦皮質和紋狀體中表現。在一些具體實例中，HD的症狀包括但不限於舞蹈病、強直、無法控制的身體運動、肌肉失去控制、缺乏協調、躁動、減緩眼部運動、異常姿態、不穩、共濟失調步態、表情異常、言語障礙、咀嚼和/或吞咽困難、睡眠障礙、癲癇、癡呆，認知障礙(例如涉及規劃、抽象思維、靈活性、規則獲取、人際關係敏感性、自我控制、注意力、學習、記憶的能力減退)、抑鬱、焦慮、人格改變、侵略、強迫行為、著迷-強迫行為、性欲亢進、精神病、情感淡漠、煩躁、自殺的念頭、體重下降、肌肉萎縮、心衰竭、減少葡萄糖耐受、睾丸萎縮和骨質疏鬆症。

在一些方面中，本發明提供方法以預防或延遲HD的進展。常染色體顯性HD是遺傳性疾病，其可進行基因分型。例如，HTT中CAG重複的數目可通過基於PCR重複大小確定。該類診斷可在生命的任何階段通過直接檢測青少年或成人(例如伴隨臨床症狀顯現)、產前篩查或產前排除測試(例如通過絨毛取樣或羊膜穿刺術)或胚胎植入前篩查實施。此外，HD可通過腦部成像、尋找尾狀核和/或殼核的收縮和/或腦室擴大來診斷。這些症狀與HD家族史和/或臨床症狀組合可指示HD。

用於確定HD症狀改善的方式為本領域已知。例如，美國亨廷頓氏病評定量表(UHDRS)可用於評估運動功能、認知功能、行為異常和功能性能力(參見例如Huntington Study Group(1996)Movement Disorders 11：136-42)。建立該評定量表以提供統一、全面的測試用於疾病病理的多面性，併入來自測試如HD活動和日常生活能力量表(HD Activities and Daily Living Scale)、馬斯登和奎因的舞蹈病嚴重程度量表(Marsden and Quinn’s chorea severity scale)、肢體殘疾和獨立量表(Physical Disability and Independence scales)、HD運動評定量表(HD motor rating scale)(HDMRS)、HD功能性能力量表(HD functional capacity scale)(HDFCS)和神經定量檢查(QNE)的元素。其他有效用於確定HD症狀改善的測試可包括但不限於蒙特利爾認知評估(Montreal Cognitive Assessment)、腦成像(例如MRI)、分類流暢性測驗(Category Fluency Test)、連線測驗(Trail Making Test)、地圖搜索(Map Search)、斯特魯普字閱讀測試(Map Search)、加快拍打任務(Speeded Tapping Task)和符號數字模式測試(Symbol Digit Modalities Test)。

在本發明的一些方面中，使用用於治療具有HD的人的方法。如上文所述，HD以常染色體顯性遺傳的方式遺傳且由HTT基因中的CAG重複擴展導致。rAAV顆粒可包括例如編碼靶向HTT的治療多肽或核酸的異源核酸。青少年發病的HD最經常從父系遺傳。亨廷頓疾病樣表型已與其他基因座如HDL1、PRNP、HDL2、HDL3和HDL4相關。認為其他基因座可修飾HD症狀的表現，包括GRIN2A、GRIN2B、MSX1、GRIK2和APOE基因中的突變。

在一些具體實例中，重組病毒顆粒藉由將病毒顆粒注射至紋狀體進行。紋狀體內投予將重組病毒顆粒遞送至腦部區域、紋狀體(包括殼核和尾狀核)，這受HD高度影響。此外，且不希望受理論限制，認為注射入紋狀體的重組病毒顆粒(例如rAAV顆粒)還可分散(例如通過逆行轉運)至腦部的其他區域，包括但不限於投射區域(例如大腦皮質)。在一些具體實例中，重組病毒顆粒藉由對流增強遞送進行遞送(例如對流增強遞送至紋狀體)。

在一些具體實例中，轉基因(例如本文所述的異源核酸)與啟動子可操作地連接。例示性啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子、GUSB啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猴病毒40(SV40)啟動子和CK6啟動子、轉甲狀腺素啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素反應性啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合體肝臟特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β-珠蛋白啟動子(CAG啟動子；Niwa等，Gene,1991,108(2)：193-9)和延伸因子1-α啟動子(EF1-α)啟動子(Kim等，Gene,1990,91(2)：217-23和Guo等，Gene Ther.,1996,3(9)：802-10)。在一些具體實例中，所述啟動子包含人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子或與雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子連接的巨細胞病毒增強子。所述啟動子可以是組成型、誘導型或阻遏型啟動子。在一些具體實例中，本發明提供重組載體，其包含與CBA啟動子可操作連接的編碼本發明異源核酸的核酸。在一些具體實例中，啟動子是CBA啟動子、最小CBA啟動子、CMV啟動子或GUSB啟動子。

組成型啟動子的實例包括但不限於逆轉錄病毒勞斯肉瘤病毒(retroviral Rous sarcoma virus)(RSV)LTR啟動子(任選地具有RSV增強子)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(任選地具有CMV增強子)[參見例如Boshart等，Cell,41：521-530(1985)]、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、13-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和EFLA啟動子[Invitrogen]。

誘導型啟動子允許調節基因表現且可藉由外源補給化合物、環境因素如溫度或特定的生理狀態(例如急性期、細胞的特定分化狀態或僅在複製細胞中)的存在來調節。誘導型啟動子和誘導系統可從多種商業來源獲得，包括但不限於Invitrogen、Clontech和Ariad。已描述了許多其他的系統且可由本領域的技術人員容易地選擇。藉由外源補給啟動子調節的誘導型啟動子的實例包括鋅誘導羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(Dex)-誘導型小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088)；蛻皮激素昆蟲啟動子(No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93：3346-3351(1996))、四環素阻遏系統(Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：5547-5551(1992))、四環素誘導系統(Gossen等，Science,268：1766-1769(1995),see also Harvey等，Curr.Opin.Chem.Biol.,2：512-518(1998))、RU486-誘導系統(Wang等，Nat.Biotech.,15：239-243(1997)和Wang等，Gene Ther.,4：432-441(1997))和雷帕黴素-誘導系統(Magari等，J.Clin.Invest.,100：2865-2872(1997))。其他可在該背景中有效的誘導型啟動子類型是藉由特定生理狀態調節的那些，例如溫度、急性期、細胞的特定分化狀態或僅在複製中的細胞。

在另一具體實例中，可使用用於轉基因的天然啟動子或其片段。當預期表現的轉基因應模擬天然表現時，天然啟動子可以是優選的。當轉基因的表現必須暫時或發展性或以組織特異性的方式或響應特定轉錄刺激調節時，可以使用天然啟動子。在進一步的具體實例中，也可使用其他天然表現控制元件如增強子元件、多聚腺苷酸化位點或Kozak共有序列以模擬天然表現。

在一些具體實例中，調節序列賦予組織特異性基因表現能力。在一些情況中，組織特異性調節序列結合以組織特異性的方式誘導轉錄的組織特異性轉錄因子。這種組織特異性調節序列(例如啟動子、增強子等)為本領域熟知。例示性組織特異性調節序列包括但不限於下列組織特異性啟動子：神經性如神經元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子(Andersen等，Cell.Mol.Neurobiol.,13：503-15(1993))、神經絲輕鏈基因啟動子(Piccioli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88：5611-5(1991))和神經元特異性vgf基因啟動子(Piccioli等，Neuron,15：373-84(1995))。在一些具體實例中，組織特異性啟動子是選自下組的基因啟動子：神經元細胞核(NeuN)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、腺瘤性結腸息肉病(APC)和離子鈣結合適配分子1(Iba-1)。其他合適的組織特異性啟動子對本領域的技術人員將是顯而易見的。在一些具體實例中，啟動子是雞β-肌動蛋白啟動子。

在一些具體實例中，啟動子在CNS的細胞中表現異源核酸。由此，在一些具體實例中，本發明的治療多肽或治療核酸可用於治療CNS病症。在一些具體實例中，啟動子在腦細胞中表現異源核酸。腦細胞可指本領域已知的任何腦細胞，包括但不限於神經元(如感覺神經元、運動神經元、中間神經元、多巴胺能神經元、中型多棘神經元、膽鹼能神經、GABA能神經元、錐體神經元等)、神經膠質細胞(如小神經膠質細胞(microglia)、大膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、室管膜細胞、徑向膠質細胞等)、腦實質細胞、小神經膠質細胞(microglial cell)、室管膜細胞和/或浦肯野(Purkinje)細胞。在一些具體實例中，啟動子在神經元和/或神經膠質細胞中表現異源核酸。在一些具體實例中，神經元是尾狀核的中型多棘神經元、殼核的中型多棘神經元、皮質層IV的神經元和/或皮質層V的神經元。

在CNS細胞、腦細胞、神經元和神經膠質細胞中表現轉錄物(例如異源轉基因)的多種啟動子為本領域已知且描述於本文。這種啟動子可包含與所選基因或異源控制序列相關的控制序列。經常，有效的異源控制序列包括源自編碼哺乳動物或病毒基因的序列的那些。實例包括但不限於SV40早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、單純皰疹病毒(HSV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子如CMV即刻早期啟動子區(CMVIE)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、合成的啟動子、雜合啟動子等等。此外，也可使用源自非病毒基因如鼠類金屬硫蛋白基因的序列。這種啟動子序列為商業上可從例如Stratagene(San Diego,CA)得到。可使用CNS-特異性啟動子和誘導型啟動子。CNS-特異性啟動子的實例包括但不限於分離自CNS-特異性基因如髓鞘鹼性蛋白(MBP)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和神經元特異性烯醇化酶(NSE)的那些。誘導型啟動子的實例包括對於蛻皮激素、四環素、金屬硫蛋白、缺氧(hypoxia)等反應的DNA元件。

本發明涵蓋重組病毒基因組用於將一個或多個編碼如本文所述的RNAi的核酸序列導入或包裝入AAV病毒顆粒的用途。重組病毒基因組可包括任何元件以建立異源轉基因的表現，例如，啟動子、異源核酸、ITR、核糖體結合元件、終止子、增強子、選擇性標記物、內含子、多聚A信號和/或複製起點。在一些具體實例中，rAAV載體包含一個或多個增強子、剪接供體/剪接受體對、基質附接位點或多聚腺苷酸化信號。

在一些具體實例中，包含編碼治療核酸或多肽的載體的rAAV顆粒有效量的投予在或鄰近投予位點(例如紋狀體和/或皮質)或在投予位點的更遠處轉導細胞(例如CNS細胞、腦細胞、神經元和/或神經膠質細胞)。在一些具體實例中，轉導了多於約下列任何比率的神經元：5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或100%。在一些具體實例中，轉導了約5%至約100%、約10%至約50%、約10%至約30%、約25%至約75%、約25%至約50%或約30%至約50%的神經元。鑒別通過表現miRNA的重組病毒顆粒轉導的神經元的方法為本領域已知；例如，免疫組化、RNA檢測(例如qPCR、Northern印跡、RNA-seq、原位雜合等)或使用共表現標記物如可使用增強的綠色螢光蛋白以檢測表現。

在一些方面中，本發明提供包含重組自身互補基因組(例如自身互補的rAAV載體)的病毒顆粒。具有自身互補載體基因組的AAV病毒顆粒和自身互補的AAV基因組的使用方法描述於美國專利號6,596,535；7,125,717；7,465,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054和8,361,457和Wang Z.，等，(2003)Gene Ther 10：2105-2111，其每一篇以其全文通過提述併入本文。包含自身互補基因組的rAAV將憑藉其部分互補序列(例如異源核酸的互補編碼和非編碼鏈)迅速形成雙鏈DNA分子。在一些具體實例中，載體包含編碼異源核酸的第一核酸序列和編碼核酸的互補物的第二核酸序列，其中第一核酸序列可與第二核酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內鹼基對。

在一些具體實例中，第一異源核酸序列和第二異源核酸序列經由突變的ITR(例如右側ITR)連接。在一些具體實例中，ITR包含多核苷酸序列5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3’(SEQ ID NO：1)。突變的ITR包含含有末端解析序列的D區的缺失。作為結果，在複製AAV病毒基因組時，rep蛋白將不會在突變的ITR裂解病毒基因組且由此以5'-3'包含下列的重組病毒基因組將包裝入病毒衣殼：AAV ITR、包括調節序列的第一異源多核苷酸序列、突變的AAV ITR、與第一異源多核苷酸反向的第二異源多核苷酸和第三AAV ITR。

V.病毒顆粒和產生病毒顆粒的方法 rAAV病毒顆粒

本發明提供用於投予rAAV顆粒的方法和系統。在一些具體實例中，rAAV顆粒包含rAAV載體。在一些具體實例中，病毒顆粒是包含含有側翼為一個或兩個AAV反向末端重複(ITR)的異源核酸的核酸的重組AAV顆粒。核酸在AAV顆粒中衣殼化。AAV顆粒還包含衣殼蛋白。在一些具體實例中，核酸包含轉錄方向的感興趣的編碼序列(例如異源核酸)可操作地連接的元件、包括轉錄初始和終止序列的控制序列，由此形成表現盒。表現盒在5'和3'末端側翼為至少一個功能性AAV ITR序列。“功能性AAV ITR序列”意為功能目的在於挽救、複製和包裝AAV病毒體的ITR序列。參見Davidson等(2000)PNAS 97：3428-32；Passini等(2003)J.Virol.77：7034-40；和Pechan等(2009)Gene Ther.16：10-16，上述所有在本文係以參考方式正體併入。對於實施本發明的一些方面，所述重組載體包含至少全部用於衣殼化所必需的AAV序列和用於由rAAV感染的物理結構。AAV ITR在本發明載體中的用途不需具有野生型核苷酸序列(例如，如Kotin Hum.Gene Ther.(1994)5：793-801中所述)，而可由核苷酸的插入、缺失或取代改變，或所述AAV ITR可源自數種AAV血清型中的任一種。已知多於40種的AAV血清型，且新的血清型和存在的血清型的變體被持續鑑定。參見Gao等(2002)PNAS 99：11854-6；Gao等(2003)PNAS 100：6081-6；和Bossis等(2003)J.Virol.77：6799-810。任何AAV血清型的使用都應認為在本發明的保護範圍之內。rAAV載體可以是源自任何AAV血清型的載體，包括但不限於AAV ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV等等。在一些具體實例中，AAV ITR中的核酸為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、 AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITRs等等。在一些具體實例中，AAV中的核酸包含AAV2 ITR。

在一些具體實例中，載體可包含填充(stuffer)核酸。在一些具體實例中，填充核酸可編碼綠色螢光蛋白。在一些具體實例中，填充核酸可位於啟動子和編碼RNAi的核酸之間。

在進一步的具體實例中，rAAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV4衣殼、AAV5衣殼、AAV6衣殼(例如野生型AAV6衣殼或變體AAV6衣殼如ShH10如U.S.PG Pub.2012/0164106中所述)、AAV7衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8衣殼、AAVrh8R衣殼、AAV9衣殼(例如野生型AAV9衣殼或U.S.PG Pub.2013/0323226中所述的修飾的AAV9衣殼)、AAV10衣殼、AAVrh10衣殼、AAV11衣殼、AAV12衣殼、酪胺酸衣殼突變體、肝素結合衣殼突變體、AAV2R471A衣殼、AAVAAV2/2-7m8衣殼、AAV DJ衣殼(例如AAV-DJ/8衣殼、AAV-DJ/9衣殼或U.S.PG Pub.2012/0066783中所述的任何其他衣殼)、AAV2 N587A衣殼、AAV2 E548A衣殼、AAV2 N708A衣殼、AAV V708K衣殼、山羊AAV衣殼、AAV1/AAV2嵌合衣殼、牛AAV衣殼、小鼠AAV衣殼、rAAV2/HBoV1衣殼或美國專利號8,283,151或國際公開號WO/2003/042397中所述的AAV衣殼。在一些具體實例中，突變的衣殼蛋白保持形成AAV衣殼的能力。在一些具體實例中，rAAV顆粒包含AAV5酪胺酸突變衣殼(Zhong L.等，(2008)Proc Natl Acad Sci U S A 105(22)：7827-7832。在進一步的具體實例中，rAAV顆粒包含來自進化枝A-F的AAV血清型的衣殼蛋白(Gao，等，J.Virol.2004,78(12)：6381)。在一些具體實例中，rAAV顆粒包含AAV1衣殼蛋白或其突變體。在其他具體實例中，rAAV顆粒包含AAV2衣殼蛋白或其突變體。在一些具體實例中，AAV血清型是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、或AAVrh10。在一些具體實例中，rAAV顆粒包含AAV血清型1(AAV1)衣殼。在一些具體實例中，rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。

使用不同的AAV血清型以優化特定靶細胞的轉導或以靶向特定靶組織(例如CNS組織)內的特定細胞類型。rAAV顆粒可包含源自相同血清型和不同血清型(例如混合血清型)的病毒蛋白和病毒核酸。例如，在一些具體實例中，rAAV顆粒可包含AAV1衣殼蛋白和至少一個AAV2 ITR或其可包含AAV2衣殼蛋白和至少一個AAV1 ITR。本文提供用於產生rAAV顆粒的AAV血清型的任何組合，如每個組合都在本文明確敘述一般。在一些具體實例中，本發明提供包含本公開的AAV1衣殼和rAAV載體的rAAV顆粒(例如包含異源核酸的表現盒)，側翼為至少一個AAV2 ITR。在一些具體實例中，本發明提供包含AAV2衣殼的rAAV顆粒。在一些具體實例中，ITR和衣殼源自AAV2。在一些具體實例中，ITR源自AAV2且衣殼源自AAV1。

AAV顆粒的產生

用於產生rAAV載體的多種方法為本領域已知，包括轉染、穩定細胞系產生和感染性雜合病毒產生系統(其包括腺病毒-AAV雜合體、皰疹病毒-AAV雜合體(Conway,JE等，(1997)J.Virology 71(11)：8780-8789)和桿狀病毒-AAV雜合體)。用於產生rAAV病毒顆粒的rAAV生產培養都需要：1)合適的宿主細胞，包括例如，衍生自人的細胞系如HeLa、A549或293細胞或在桿狀病毒產生系統的情況中昆蟲衍生細胞系如SF-9；2)合適的輔助病毒功能，由野生型或突變腺病毒(如溫度敏感的腺病毒)、皰疹病毒、桿狀病毒或提供輔助功能的質體構築體提供；3)AAV rep和cap基因和基因產物；4) 側翼為至少一個AAV ITR序列的核酸(如治療核酸)；和5)合適的介質或介質組分以支持rAAV產生。在一些具體實例中，AAV rep和cap基因產物可來自任何AAV血清型。一般而言但不是強制性的，AAV rep基因產物為與rAAV載體基因組的ITR相同的血清型，只要rep基因產物可發揮功能以複製和包裝rAAV基因組。本領域已知的合適介質可用於產生rAAV載體。該介質包括但不限於Hyclone Laboratories和JRH生成的介質，包括改進的Eagle介質(MEM)、杜貝爾克氏改進的Eagle介質(DMEM)，定制配方如描述於美國專利號6,566,118的那些和如美國專利號6,723,551中所述的Sf-900 II SFM介質，其每一篇以參考方式整體併入，特別是關於用於產生重組AAV載體的定制介質配方。在一些具體實例中，AAV輔助功能由腺病毒或HSV提供。在一些具體實例中，AAV輔助功能由桿狀病毒提供且宿主細胞是昆蟲細胞(例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞)。

在一些具體實例中，rAAV顆粒可通過三重轉染的方法產生，如下文提供的例示性三重轉染方法。簡言之，包含基因和衣殼基因的質體以及輔助腺病毒質體可轉染(例如使用磷酸鈣方法)入細胞系(例如HEK-293細胞)，且可收集並純化病毒。如此，在一些具體實例中，rAAV顆粒可通過編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸三重轉染入宿主細胞而產生，其中所述核酸轉染至宿主細胞生成能夠產生rAAV顆粒的細胞。

在一些具體實例中，rAAV顆粒可由生產細胞系方法產生，如下文提供的例示性生產細胞系方法(還參見(參照Martin等，(2013)HumanGeneTherapy Methods 24：253-269)。簡言之，細胞系(例如HeLa細胞系)可用包含rep基因、衣殼基因和啟動子-異源核酸序列的質體穩定轉染。可篩選細胞系以選擇先導選殖用於rAAV產生，其隨後可擴大至生產生物反應器並用腺病毒(例如野生型腺病毒)作為輔助感染以初始rAAV產生。隨後可收穫病毒，腺病毒可失活(例如通過加熱)或和/或去除，且可純化rAAV顆粒。如此，在一些具體實例中，藉由包含一個或多個編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸的生產細胞系產生rAAV顆粒。

在一些方面中，提供用於產生任何如本文所述的rAAV顆粒的方法，其包括(a)在產生rAAV顆粒的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含(i)一個或多個AAV包裝基因，其中每種所述AAV包裝基因編碼AAV複製和/或衣殼化蛋白；(ii)rAAV促載體，其包含編碼如本文所述的側翼為至少一個AAV ITR的異源核酸的核酸，和(iii)AAV輔助功能；和(b)回收由宿主細胞產生的rAAV顆粒。在一些具體實例中，所述至少一個AAV ITR選自下組：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR等等。在一些具體實例中，所述衣殼化蛋白選自下組：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼蛋白或其突變體。在一些具體實例中，衣殼蛋白是AAV5衣殼蛋白，其包括具有酪胺酸衣殼突變的AAV5衣殼蛋白。在一些具體實例中，衣殼蛋白是AAV5衣殼蛋白，其包括具有酪胺酸衣殼突變的AAV5衣殼蛋白且ITR是AAV2 ITR。在進一步的具體實例中，rAAV顆粒包含來自進化枝A-F的AAV血清型的衣殼蛋白。在一些具體實例中，rAAV顆粒包含AAV1衣殼和含有AAV2 ITR、突變的AAV2 ITR和編碼治療轉基因/核酸的核酸的重組基因組。在一些具體實例中，AAV ITR是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些具體實例中，AAV ITR是AAV2 ITR。

本發明適當的rAAV生產培養基可以0.5%-20%(v/v或w/v)的水平補充血清或血清衍生的重組蛋白。可替換地，如本領域已知，rAAV載體可在無血清條件(也稱為不具有動物衍生產物的介質)中產生。本領域的技術人員可以理解的是設計以支持rAAV載體產生的銷售或定制的介質還可補充一個或多個本領域已知的細胞培養組分，包括但不限於葡萄糖、維生素、胺基酸和/或生長因子，進而增加培養基中rAAV的滴度。

rAAV生產培養在多種適於利用的特定宿主細胞的條件(在廣泛的溫度範圍、持續多種時間長度等)下生長。如本領域已知，rAAV生產培養包括附著-依賴培養，其可在適於附著-依賴的容器如例如滾瓶、空心纖維過濾器、微載體和填充床或流化床生物反應器中培養。rAAV載體產生培養還可包括懸浮適應的宿主細胞如HeLa、293和SF-9細胞，其可以多種方式培養包括例如旋轉燒瓶、攪拌釜生物反應器和一次性系統如Wave氣囊系統。

本發明的rAAV載體顆粒可從rAAV生產培養基通過裂解生產培養的宿主細胞或通過從生產培養用過的介質(假定細胞在本領域已知引起rAAV顆粒從完整細胞釋放入介質的條件下培養)收穫，如美國專利號6,566,118中更詳細的描述。裂解細胞的適當方法為本領域已知且包括例如多次冷凍/融化循環、超聲、微流體化和用化學物質的治療如洗滌劑和/或蛋白酶。

在進一步的具體實例中，純化了rAAV顆粒。本文使用的術語“純化”包括缺少至少一部分其他組分的rAAV顆粒的製劑，其可存在於rAAV顆粒天然存在處或初始製備處。因此，例如，分離的rAAV顆粒可使用純化技術製備以從來源混合物如培養裂解物或生產培養上清液將其富集。富集可以多種方式測量，如例如，藉由存在於溶液中的DNA酶抗性顆粒(DRP)或基因組拷貝(gc)部分，或藉由感染性，或其可相對在來源混合物中存在的第二、潛在干擾物質如污染物(包括生產培養基污染物或進程內污染物，包括輔助病毒、介質組分等)測量。

在一些具體實例中，澄清rAAV生產培養收穫物以去除宿主細胞碎片。在一些具體實例中，生產培養收穫物通過過濾由系列深度過濾器包括例如等級DOHC Millipore Millistak+HC Pod過濾器、等級A1HC Millipore Millistak+HC Pod過濾器和0.2μm Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC Hydrophilic Membrane過濾器收穫。澄清還可藉由多種其他本領域已知的標準技術實現，如藉由任何0.2μm或本領域已知的更大孔徑的醋酸纖維素過濾器離心或過濾。

在一些具體實例中，rAAV生產培養收穫物進一步用Benzonase^®處理以消化存在於生產培養中的任何高分子量DNA。在一些具體實例中，Benzonase^®消化在本領域已知的標準條件下實施，包括例如1-2.5單位/ml終濃度的Benzonase^®在室溫至37℃進行30分鐘至數小時的時間。

可使用一個或多個下列純化步驟分離或純化rAAV顆粒：平衡離心；流通陰離子交換過濾；用於濃縮rAAV顆粒的切向流過濾(TFF)；通過磷灰石色譜的rAAV捕獲；輔助病毒的加熱滅活；通過疏水相互作用層析的rAAV捕獲；通過大小排阻色譜(SEC)的緩衝交換；納濾；和通過陰離子交換色譜、陽離子交換色譜或親和層析的rAAV捕獲。這些步驟可單獨、在多種組合中或以不同順序使用。在一些具體實例中，所述方法包括以如下所述的順序的全部步驟。已發現純化rAAV顆粒的方法，例如，Xiao等，(1998)Journal of Virology 72：2224-2232；美國專利號6,989,264和8,137,948和WO 2010/148143中。

在一些具體實例中，rAAV顆粒在藥物組合物中。藥物組合物可適於任何本文所述的投予模式。包含編碼治療轉基因/核酸的核酸的重組病毒顆粒的藥物組合物可導入CNS(例如紋狀體和/或大腦皮質)。

在一些具體實例中，rAAV顆粒在包含藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物中。如本領域已知，藥學上可接受的賦形劑是相對惰性的物質，其促進藥理學上有效物質的投予且可作為液體溶液或懸液、作為乳液或作為使用前適於溶解或懸浮在液體中固體形式補給。例如，賦形劑可給予形式或一致性，或作為稀釋劑發揮作用。適當的賦形劑包括但不限於穩定劑、潤濕劑和乳化劑、用於不同滲透壓的鹽、封裝劑、pH緩衝物質和緩沖劑。這種賦形劑包括任何適於直接遞送至眼部的藥物作用劑，其可投予而無過度的毒性。藥學上可接受的賦形劑包括但不限於山梨糖醇、多種TWEEN化合物中的任何，和液體如水、鹽水、甘油和乙醇。藥學上可接受的鹽可包括其中，例如，無機酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；和有機酸的鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。藥物上可接受的賦形劑的徹底討論可在REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中得到。

在一些具體實例中，投予的化合物包括rAAV顆粒和泊洛沙姆。術語“泊洛沙姆”可涵蓋許多化合物，因為不同長度的聚氧化丙烯和聚氧乙烯鏈可組合使用。例如，泊洛沙姆可具有HO(C₂H₄O)_n(C₃H₆O)_m(C₂H₄O)_nH的化學式，其中n(即聚氧乙烯鏈的長度)具有約60至約150的值，且m(即聚氧丙烯鏈的長度)具有約25至約60的值。

在一些具體實例中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188(例如CAS No.9003-11-6)。泊洛沙姆可藉由指定其大約的分子量和聚氧乙烯含量百分比的編號系統描述。這些值經常指代泊洛沙姆組合物中的平均值，而非組合物中每個泊洛沙姆分子的絕對值。在這種方法學下，前兩個數字乘以100以給出聚氧丙烯嵌段的近似分子量，且第三個數字乘以10以給出聚氧乙烯嵌段的重量百分數。例如，泊洛沙姆188可指代如上所述式中具有約80的n值和具有約27的m值的泊洛沙姆。泊洛沙姆188可具有約7680至約9510g/mol的平均分子量。

在商品名如PLURONIC^®下銷售的泊洛沙姆可在不同方法學下命名。可使用字母以表明物理狀態(例如F用於固體、P用於膏或L用於液體)。2或3位數字可用於表明化學性質。前一或兩位數字可乘以300以給出聚氧丙烯嵌段的近似分子量，且第三數字乘以10以給出聚氧乙烯嵌段的重量百分比。例如，PLURONIC^®或LUTROL^® F68可指如上所述式中具有約80的n值和具有約27的m值的固體泊洛沙姆。因此，在一些具體實例中，泊洛沙姆188可以是PLURONIC^® F68或LUTROL^® F68。

在一些具體實例中，泊洛沙姆在組合物中的濃度範圍為約0.0001%至約0.01%。在一些具體實例中，泊洛沙姆在組合物中的濃度少於約下列任何百分比：0.01、0.005、0.001或0.0005。在一些具體實例中，泊洛沙姆在組合物中的濃度多於下列任何百分比：0.0001、0.0005、0.001或0.005。也就是說，泊洛沙姆在組合物中各濃度可以是具有0.01、0.005、0.001或0.0005上限和獨立選擇的下限0.0001、0.0005、0.001或0.005的任何百分比範圍，其中所述下限少於所述上限。在一些具體實例中，泊洛沙姆在組合物中的濃度為約0.001%。

在一些具體實例中，所述組合物進一步包含氯化鈉。在一些具體實例中，組合物中氯化鈉的濃度範圍為約100mM至約250mM。在一些具體實例中，組合物中氯化鈉的濃度少於大約任何下列濃度(mM)：250、225、200、175、150或125。在一些具體實例中，組合物中氯化鈉的濃度多於大約任何下列濃度(mM)：100、125、150、175、200或225。也就是說，組合物中氯化鈉的濃度可以是具有250、225、200、175、150或125上限和獨立選擇的下限100、125、150、175、200或225的任何濃度範圍(mM)，其中所述下限少於所述上限。在一些具體實例中，組合物中氯化鈉的濃度為約180mM。

在一些具體實例中，組合物進一步包含磷酸鈉。磷酸鈉可指任何單一種類的磷酸鈉(例如磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉等等)，或其可指磷酸鈉緩衝劑，即磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉溶液的混合物。跨一系列pH值的磷酸鈉緩衝劑的配方可在多種標準分子生物學方法中獲得，如Promega Protocols & Applications Guide,“Buffers for Biochemical Reactions，”附錄B的C部分。

在一些具體實例中，磷酸鈉在組合物中的濃度為約5mM至約20mM。在一些具體實例中，磷酸鈉在組合物中的濃度少於大約任何下列濃度(mM)：20、15或10。在一些具體實例中，磷酸鈉在組合物中的濃度多於大約任何下列濃度(mM)：5、10或15。也就是說，磷酸鈉在組合物中的濃度可以是具有20、15、或10的上限和獨立選擇的下限5、10或15的任何濃度範圍(mM)，其中所述下限少於所述上限。在一些具體實例中，組合物中磷酸鈉的濃度為約10mM。

在一些具體實例中，組合物中磷酸鈉的pH為約7.0至約8.0。例如，在一些具體實例中，磷酸鈉在組合物中的pH為約7.0、約7.2、約7.4、約7.5、約7.6、約7.8或約8.0。在一些具體實例中，磷酸鈉在組合物中的pH為約7.5。本文所述的磷酸鈉的任何pH值可以與上文所述的任何磷酸鈉濃度值組合。例如，在一些具體實例中，磷酸鈉在組合物中的濃度為約10mM，且pH為約7.5。

在一些具體實例中，包含本文所述的rAAV顆粒和藥學上可接受的載劑的藥物組合物適於投予於人。這種載劑為本領域熟知(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences,15th Edition,pp.1035-1038和1570-1580)。在一些具體實例中，藥物組合物進一步包含泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188，如PLURONIC^®或LUTROL^® F68)。在一些具體實例中，包含本文所述的rAAV和藥學上可接受的載劑的藥物組合物適於注射入哺乳動物的CNS。

這種藥學上可接受的載劑可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，如花生油、大豆油、礦物油等。還可採用鹽水溶液和葡萄糖水溶液、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液作為液體載劑，特別是用於可注射的溶液。藥物組合物可進一步包含其他成分，例如防腐劑、緩衝劑、張力劑、抗氧化劑和穩定劑、非離子型潤濕劑或澄清劑、增黏劑等。本文描述的藥物組合物可包裝成單一單位劑量或多重劑量形式。所述組合物一般配製為無菌或基本上等滲的溶液。

VI. 用於rAAV顆粒遞送的系統

還提供了用於在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現異源核酸的系統，其包含：(a)含有rAAV顆粒的組合物，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體；和(b)用於遞送rAAV顆粒至紋狀體的裝置。本發明的系統和裝置可用於遞送本文所述的任何rAAV顆粒至哺乳動物的 CNS(例如紋狀體)。如上文所述，遞送至紋狀體的rAAV顆粒可用於導入編碼用於在大腦皮質和紋狀體中表現的異源核酸的rAAV載體。

在一些具體實例中，rAAV顆粒通過對流增強遞送(CED)進行遞送。CED基於在壓力下將輸注物(例如包含rAAV顆粒的組合物)泵入CNS，其中克服了組織液的靜水壓。其將輸注物與CNS周圍血管接觸，如泵一般將其利用以使輸注物藉由對流分佈並增強其遞送的程度(參見例如Hadaczek等，(2006)Hum.GeneTher.17：291-302；Bankiewicz等，(2000)Exp.Neurol.164：2-14；Sanftner,LM等，(2005)Exp.Neurol.194(2)：476-483；Forsayeth,JR等，(2006)Mol.Ther.14(4)：571-577；美國專利號6,953,575；美國專利公開號2002/0141980；美國專利公開號2007/0259031；WO 99/61066；和WO 2010/088560)。

如本文所述使用CED的優勢是貫穿腦部的輸注物的增強分佈。CED可導致在腦內注射位點的改進的遞送(例如紋狀體、尾狀核和/或殼核)。此外，遞送至腦部的其他區域(例如大腦皮質、額葉皮質、前額葉皮質的關聯區域、運動前皮質、初級軀體感覺皮質區和/或初級運動皮質)可通過CED實現。不希望收到理論限制，還可認為注射入紋狀體的重組病毒顆粒(例如rAAV顆粒)也可分散(例如通過逆行轉運)至腦部的其他區域，包括但不限於投射區(例如皮質)。

在一些具體實例中，使用CED遞送系統遞送rAAV顆粒。AAV顆粒可藉由CED遞送(參見例如WO 99/61066)。如本文所述，CED可使用任何本文所述的系統實現。用於CED(例如用於組合物包括rAAV顆粒的遞送)的裝置為本領域已知且一般採用泵(例如如下文所述的滲透和/或輸注泵)和注射裝置(例如導管、套管等)。任選地，可使用成像技術以引導注射裝置和/或監測輸注物(例如包含rAAV顆粒的組合物)的遞送。注射裝置可插入受試者中的CNS組織。本領域的技術人員能確定用於在靶CNS組織中放置注射裝置的合適坐標。在一些具體實例中，放置通過例如受試者腦部的CT和/或MRI成像獲得的解剖圖實現以引導注射裝置至靶CNS組織。在一些具體實例中，可實施iMRI和/或遞送的即時成像。在一些具體實例中，藉由本發明的方法將裝置用於投予rAAV顆粒至哺乳動物。

在一些具體實例中，可實施術中磁共振成像(iMRI)和/或遞送的即時成像。在一些具體實例中，藉由本發明的方法將裝置用於投予rAAV顆粒至哺乳動物。本領域已知iMRI為在患者手術過程中用於基於MRI的成像的技術，其幫助確認成功的手術操作(例如遞送rAAV顆粒至CNS)並減少損傷其他組織部分的風險(進一步描述參見例如Fiandaca等，(2009)Neuroimage 47 Suppl.2：T27-35)。在一些具體實例中，追蹤劑(例如MRI對比增強劑)可與輸注物(例如包含rAAV顆粒的組合物)共遞送以提供輸注物組織分佈的實施監測。參見例如Fiandaca等，(2009)Neuroimage 47 Suppl.2：T27-35；U.S.PG Pub 2007/0259031；和美國專利號7,922,999。追蹤劑的使用可報告遞送的停止。其他本領域已知的追蹤或成像方式也可用於追蹤輸注物的分佈。

在一些具體實例中，rAAV顆粒可通過標準立體注射使用本領域已知用於rAAV顆粒遞送的裝置和方法投予。一般地，這些方法可使用注射裝置、用於將靶向用於遞送的組織區翻譯成坐標系的規劃系統(例如沿側-側、背-腹和前部-尾部軸的參數)，和根據規劃的坐標用於立體定位的裝置(立體定向裝置，任選地包括探頭和用於與坐標系統對齊固定頭部的結構)。可有效用於MRI-引導的手術和/或立體注射系統的非限制性實例是ClearPoint®系統(MRI Interventions,Memphis,TN)。

在一些具體實例中，用於對流增強遞送的裝置包括泵(例如滲透泵和/或輸注泵)。滲透和/或輸注泵為商業上可得到的(例如來自ALZET® Corp.，Hamilton Corp.，ALZA Inc.Palo Alto,CA)。泵系統可以是可植入的。已發現示例性泵系統例如美國專利號7,351,239；7,341,577；6,042,579；5,735,815和4,692,147。在一些具體實例中，泵是手動泵。用於CED的示例性裝置(包括抗返流和階梯套管)可發現於WO 99/61066和WO 2006/042090，其在本文以參考方式整體併入。

在一些具體實例中，用於對流增強遞送的裝置包括抗返流套管(例如無返流步驟設計套管)。可在例如Krauze等，(2009)Methods Enzymol.465：349-362；U.S.PG Pub 2006/0135945；U.S.PG Pub 2007/0088295和PCT/US08/64011中發現進一步描述和例示性抗返流套管。在一些具體實例中，僅使用一個套管。在其他具體實例中，使用多於一個的套管。在一些具體實例中，用於對流增強遞送的裝置包括與產生足夠的壓力以引起輸注物以受控速率流過套管至靶組織的泵連接的抗返流套管。可使用任何合適的流速由此顱內壓以合適的水平維持從而不損傷腦組織。

在一些具體實例中，套管是階梯套管。如例如WO 2006/042090中所述，階梯套管具有多個階梯(例如WO 2006/042090的圖1中的4個)。最接近套管遠端的階梯是首先進入靶組織的那些，因此，進入靶組織(例如紋狀體)的階梯數目將依賴於所需的穿透的深度以達到受試者中靶標。關於遞送至腦，考慮到待治療的受試者的尺寸和靶向的腦內位置，操作者可輕鬆確定穿透的合適深度。

套管可與泵通過管系統連接。管道通過套管管腔延伸且輸注物可通過該管道遞送。在包含管道的具體實例中，管道可用套管的遠端沖洗。可替換地，管道從套管遠端延伸，在這些具體實例中，管道延伸的量可依賴於應用發生變化。一般地，管道將從套管約1mm延伸至約1cm(或其間的任何長度)，例如約1至約50mm(或其間的任何長度)或約1mm至約25mm(或其間的任何長度，包括但不限於1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm或25mm)，如其遠端外的10mm。

通過套管延伸的管道可具有在一個或多個區具有塗層或周圍材料，例如，以保護管道與輸注物接觸。因此，在一些具體實例中，管道(例如FEP(Teflon)管道)保護熔融石英管道部分延伸至不銹鋼套管近端。該熔融石英管道可與注射器通過任何合適的方式連接，包括但不限於Luer壓縮接頭，且注射器通過注射器泵驅動(手工、電子和/或電腦)。顯而易見的是注射器的大小可通過操作者選擇以遞送合適的量的產物。因此，可使用1mL、2.5mL、5mL或甚至更大的注射器。

階梯套管可由多種生理上可接受的材料製成，包括但不限於不銹鋼(例如316SS或304SS)、金屬、金屬合金、聚合物、有機纖維、無機纖維和/或其組合。

任選地，輸注接觸面(例如管道或塗層)可通過套管的內腔延伸。可使用多種材料用於輸注接觸面，包括但不限於金屬、金屬合金、聚合物、有機纖維、無機纖維和/或其組合。在一些具體實例中，產物接觸表面不是不銹鋼。在這種具體實例中，外部套管仍可由與靶組織生理上兼容的材料製成，但由於不存在產物接觸，其不需要與生物活性劑或產品製劑兼容。

在一些具體實例中，輸注物的穿透進一步藉由使用促進劑增強。促進劑能夠進一步促進輸注物遞送至靶組織(例如CNS靶組織)。促進劑的非限制性實例是低分子量肝素(參見例如美國專利號7,922,999)。

用於本文所述的藥物組合物的合適包裝為本領域已知，且包括例如小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、軟包裝(例如密封的Mylar或塑料袋)等。這些製品可進一步滅菌和/或密封。

本文進一步提供了用於治療哺乳動物中CNS病症的方法，其包括根據本文所述的方法投予rAAV顆粒至哺乳動物。還提供了用於治療哺乳動物中亨廷頓氏病的方法，其包括根據本文所述的方法使用如本文所述的系統投予rAAV顆粒至哺乳動物。

本發明還提供用於根據本發明的方法投予本文所述的rAAV顆粒至哺乳動物的套組。所述套組可包含本發明的任何rAAV顆粒或rAAV顆粒組合物。例如，該套組可包含具有編碼異源核酸的rAAV載體的rAAV顆粒，所述異源核酸至少在哺乳動物的大腦皮質和紋狀體中表現。在一些具體實例中，該套組進一步包含任何上文所述的裝置或系統。

在一些具體實例中，所述套組進一步包含用於rAAV顆粒組合物CNS遞送(例如遞送至哺乳動物的紋狀體)的說明。本文所述的套組可進一步包括其他從市場或使用者的立場理想的材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器和具有用於實施本文所述的任何方法的說明的包裝插頁。也可包括合適的包裝材料，且可以是任何本領域已知的包裝材料，包括例如，小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、軟包裝(例如密封的Mylar或塑料袋)等。這些製品可進一步滅菌和/或密封。在一些具體實例中，所述套組包含使用任何本文所述的方法和/或rAAV顆粒用於治療本文所述的CNS病症的說明。套組可包括適於注射入個體CNS的藥學上可接受的載劑和一個或多個：緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器和具有用於實施注射入哺乳動物紋狀體的說明的包裝插頁。

在一些具體實例中，套組進一步包含一個或多個緩衝劑和/ 或本文所述的藥學上可接受的賦形劑(例如如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991中所述)。在一些具體實例中，所述套組包括一個或多個藥學上可接受的賦形劑、載劑、溶液和/或其他本文所述的成分。本文所述的套組可以單一單位劑量或多重劑量形式包裝。套組的內容物一般配製成無菌且可凍幹或可作為基本上等滲的溶液提供。

圖1顯示恒河猴(Rhesus monkey)體重，即將手術前(黑色)和屍檢時(灰色)，在投予由三重轉染(TT)和生產細胞系(PCL)方法生成的AAV1和AAV2載體的動物中。

圖2A-2D顯示AAV1-GFP(TT)輸注入恒河猴尾狀核和殼核30天后GFP染色的代表性腦切片。圖2A-2D中的切片以前部至尾部方向延伸穿過腦。來自三種代表性動物的切片顯示於每個圖面中。

圖3A-3D顯示代表性的腦切片，其證明了將AAV1-GFP(TT)輸注入恒河猴尾狀核和殼核後，兩側星形膠質(圖3A & 3C)和皮層神經元(圖3B & 3D)中額葉皮質(圖3A & 3B)和枕葉皮質(圖3C & 3D)中GFP的皮質表現。

圖4A-4D顯示將AAV2-GFP(TT)輸注入恒河猴尾狀核和殼核30天后GFP染色的代表性腦切片。圖4A-4D中的切片以前部至尾部方向延伸穿過腦。來自三種代表性動物的切片顯示於每個圖面中。

圖5A-5D顯示將由生產細胞系(PCL)(圖5A & 5B)或三重轉染(TT)(圖5C & 5D)方法產生的AAV1-GFP輸注入恒河猴尾狀核和殼核30天后GFP染色的代表性腦切片。

圖6A-6D顯示將由生產細胞系(PCL)(圖6A & 6B)或三重轉染(TT)(圖6C & 6D)方法產生的AAV2-GFP輸注入恒河猴尾狀核和殼核30天后GFP染色的代表性腦切片。

圖7A & 7B顯示用AAV1-eGFP和AAV2-eGFP輸注的非人靈長類(NHP)腦中的GFP分佈。將AAV1-eGFP和AAV2-eGFP載體雙側輸注入9只恒河猴的紋狀體中。手術四周後，處理腦用於針對GFP的免疫組化(IHC)。柱狀圖顯示來自用AAV1-eGFP(三重轉染；TT)；AAV1-eGFP(生產細胞系；PCL)；AAV2-eGFP(TT)；AAV2-eGFP(PCL)輸注的4個研究組的代表性GFP染色腦切片。代表性切片顯示腦的各種冠狀面以證明貫穿全腦從額葉皮質、紋狀體(輸注部位)、中腦、至皮質的枕部部分的GFP表現分佈。全部組顯示注射位點的(殼核和尾狀核)穩固GFP信號以及向皮質區和黑質的廣泛轉運。基於IHC染色，計算每隻猴的靶結構(紋狀體)和皮質區兩者中GFP表現的覆蓋率並總結於表7。

圖8顯示轉導的主要區域(PAT)與載體分佈(Vd)的比率。紋狀體中GFP表現的主要區域在來自GFP染色切片掃描上描繪且其值除以由釓信號的匹配MRI掃描獲得的值。比率>1.0指示輸注後GFP的表現程度超過了釓信號的邊界。來自用AAV載體輸注的猴的結果顯示AAV1在腦實質中比AAV2擴散得更好(1.21±0.1對0.74±0.04；p<0.007，以雙尾非配對t檢驗)。

圖9A-9H顯示用AAV1-eGFP和AAV2-eGFP轉導的NHP腦中GFP的表現。圖9A：受試者1號的用AAV1-eGFP(TT)轉導的靶結構尾狀核的高倍放大(40X)。藉由DAB染色的深棕色GFP+神經元對於陽性神經元纖維的密集染色網絡是可見的。在用通過TT和PCL兩種方法產生的AAV1-eGFP載體注射的全部猴中檢測到如此穩固的信號。圖9B：1號受試者前額葉皮質的片段(圖7)證明了載體AAV1-eGFP從注射位點(紋狀體)至皮質區的大規模轉運。基於GFP+細胞的形態學，在皮質中檢測到神經元和星形膠質細胞兩者。圖9C：圖9B中所示的框架的更高倍放大(40X)顯示多個表現GFP的皮層神經元。圖9D：來自1號受試者皮質的高倍(40X)放大顯示星形膠質細胞形態的GFP+細胞。圖9E：6號受試者的用AAV2-eGFP(TT)轉導的靶結構殼核的高倍放大(40X)。深棕色DAB信號顯示神經元中GFP的表現和其密集染色纖維網絡。圖9F：6號受試者的前額葉皮質片段(圖7)證明了載體AAV2-eGFP從紋狀體(注射位點)至皮質區的大規模轉運。大量GFP陽性細胞具有神經元形態(放大倍數2.5X)。圖9G：圖9F中所示的框架的更高倍放大(40X)顯示多個表現GFP的皮層神經元。圖9H：6號受試者內囊(internal capsule)的更高倍放大(20X)顯示具有星形膠質細胞形態的GFP+細胞。

圖10A-10E顯示注射入猴腦的AAV1-eGFP和AAV2-eGFP的細胞嗜性(tropism)。處理猴腦切片用於針對GFP和多種細胞標誌物的雙重免疫螢光染色以確定注射的載體的細胞嗜性。圖10A：來自1號受試者的用針對GFP(對於DyLight^TM 488染料為綠色通道；左側柱形圖)和神經元標誌物NeuN(對於DyLight^TM 549染料為紅色通道，中間柱形圖)的抗體染色的尾狀核(靶結構)的切片。來自兩通道的合併的照片(放大倍數20X；右側柱狀圖)顯示多個表現GFP的神經元，驗證了AAV1-eGFP的神經元嗜性。圖10B：對於來自1號受試者的前額葉皮質的切片實施了相同染色，顯示接收來自紋狀體的神經元突起的遠端大腦結構中的神經元轉導並且是AAV1-eGFP逆向轉運的證據。圖10C：來自1號受試者的用針對GFP(對於DyLight^TM 488染料為綠色通道；左側柱形圖)和星形膠質細胞標誌物S-100(對於DyLight^TM 549染料為紅色通道，中間柱形圖)的抗體染色的尾狀核(靶結構)的切片。來自兩通道的合併的照片(放大倍數20X；右側柱狀圖)顯示多個表現GFP的神經元，驗證了AAV1-eGFP也轉導星形膠質細胞。圖10D：來自6號受試者的用針對GFP(對於DyLight^TM 488染料為綠色通道；左側柱形圖)和神經元標誌物 NeuN(對於DyLight^TM 549染料為紅色通道，中間柱形圖)的抗體染色的尾狀核(靶結構)的切片。來自兩通道的合併的照片(放大倍數20X；右側柱狀圖)顯示多個表現GFP的神經元，驗證了AAV2-eGFP的神經嗜性。圖10E：來自3號受試者的用針對GFP(對於DyLight^TM 488染料為綠色通道；左側柱形圖)的抗體和小神經膠質細胞標誌物Iba-1(對於DyLight^TM 549染料為紅色通道，中間柱形圖)染色的尾狀核(靶結構)的切片。合併的照片(放大倍數20X；右側柱狀圖)中兩種標誌物共染色的缺乏指示AAV1不轉導小神經膠質細胞，且AAV2的情況也是如此(數據未顯示)。

圖11A-11C顯示用AAV1-eGFP和AAV2-eGFP注射的NHP紋狀體中神經轉導的效率。實施針對猴腦切片的GFP和神經標誌物NeuN的雙重免疫螢光染色以計算紋狀體(靶結構)和皮質區域內神經元轉導的效率。對於紋狀體，在GFP轉導的主要區域(PAT)計算轉導效率，其中信號穩固，具有密集分佈的GFP神經元(圖11A)。在GFP轉導的主要區域外的區中也檢測到神經元(OPAT；圖11C)。計數PAT(內陰影)和OPAT(外陰影)中GFP+神經元的技術方案示於圖11B。來自每隻猴的個體計數的數據和腦結構示於表8(PAT)和表9(OPAT)。

圖12A & 12B顯示載體相關的組織學發現。來自主要轉導區域(PAT)冠狀切面的蘇木精和伊紅(H&E)染色的獨立評估揭示全部實驗組中與套管插入相關的正常膠質細胞增生(gliosis)。H&E染色還揭示全部動物中的血管周圍細胞滲透，無論使用的載體為何。血管周圍袖套(perivascular cuff)的發生率和嚴重性在用AAV1注射的組中增加，特別是當載體通過TT方法製備時。圖12A：來自3號受試者的H&E染色的切片顯示用AAV1-eGFP(TT)轉導的左側殼核中多個血管周圍袖套。一條血管在右下角放大(5X)。圖12B：來自5號受試者的H&E-染色的切片顯示用AAV1-eGFP(PCL)轉導的左側尾狀核中僅幾處局部血管周圍袖套。幾個血管在左下角放大(5X)。

圖13A & 13B顯示將AAV1-eGFP注射入恒河猴尾狀核和殼核1個月後肝、脾、心、腎和肺樣品中eGFP mRNA表現的定量PCR(QPCR)分析。(圖13A)通過三重轉染(TT)方法製備的AAV1和AAV2-eGFP載體。(圖13B)通過生產細胞系(PCL)方法製備的AAV1和AAV2-eGFP載體。

實施例

通過參照下述實施例更充分地理解本發明。然而，它們不應解釋為限制本發明的範圍。應該理解的是：本文所述的實施例和具體實例僅出於說明目的，由其啟示的不同修飾或改變將建議給本領域的技術人員而且也包括在本申請的精神和範疇及所附請求項的範圍內。

實施例1：紋狀體AAV1載體遞送後廣泛地GFP表現

當經由對流增強遞送(CED)進行遞送時，評估了AAV1有效靶向恒河猴腦中紋狀體和皮質結構的能力。將包含在巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子控制下的GFP cDNA的AAV載體使用CED輸注入9只成年雄性恒河猴的尾狀核和殼核(參見例如Bankiewicz等，(2000)Exp.Neurol.164：2-14和WO 2010/088560)。

方法 手術遞送

將九隻成年雄性恒河猴(獼猴(Macaca mulatta)；8.9-11.9kg)包括在該研究中。全部動物接受AAV載體通過MRI-導向的CED方式尾狀核和殼核的雙側輸注(Richardson,R.M.等(2011)Neurosurgery 69：154-163； Richardson,R.M.等(2011)Stereotact.Funct.Neurosurg.89：141-151；Richardson,R.M.等(2011)Mol.Ther.19：1048-1057)。手術即刻前，用鹽酸氯胺酮(10mg/kg)麻醉動物，稱重、插管並保持在1-5%異氟醚。將頭安裝在立體框架，並將動物轉移至MRI(Siemens 3.0 T Trio MR單位)用於T1-加權計劃掃描。掃描後，將動物轉移至手術室並準備植入手術，且使用具有3-mm階梯尖的陶瓷定制設計的熔融石英抗返流套管用於輸注。臨時引導套管使用標準方法雙側植入(每半球一隻)。

動物接受用2種不同的產生方獲得的AAV1-eGFP或AAV2-eGFP載體雙側輸注入尾狀核和殼核：三重轉染(TT)或生產細胞系(PCL)。載體濃度和劑量描述於表5中。如前文所述對動物測試抗AAV1和抗AAV2中和抗體的存在，且如果其出現抗體滴度為<1：32則認為是血清陰性(Bevan,A.K.等(2011)Mol.Ther.19：1971-1980)。全部動物的生存時間為AAV遞送後1個月。

每隻動物接受多至三次微注射每半球以靶向尾狀核和殼核(前連合和後連合)區域，如表2所示。為在MRI過程中視覺化輸注分佈，將Prohance(2mM釓特醇(gadoteridol))添加至病毒。使用對流增強遞送(CED)方法將約30μl的AAV投予入尾狀核60μl投予入殼核(即90μL每半球)。輸注速率上升到最大5μL/分鐘。

第一批動物接受1.7 x 10¹¹vg的AAV1-eGFP(TT)(n=3)或AAV2-eGFP(TT)(n=2)每半球。第二批動物接受1.7 x 10¹¹vg的AAV1-eGFP(PCL)(n=2)或1.3 x 10¹¹vg的AAV2-eGFP(PCL)(n=2)。獲得系列MRI以監測每個靶位點內的輸注分佈並提供即時反饋至團隊。腦實質內給藥步驟即刻，將動物轉移至手術室，移除導向套管，並在解剖層封閉傷口部位。全部實驗依照美國國立衛生研究院指導和由機構性動物護理和使用委員會批准的方法實施。手術即刻，將動物轉移至MRI套件用於AAV給藥步驟。每個受試者關於給藥步驟的評論描述於下文表2中。

給藥步驟-治療組2(AAV1-eGFP TT)

1號受試者.將約60μL的輸注每半球經由兩條軌跡(30μL/沉積物(deposit))投予至每殼核。來自前殼核輸注的冠狀圖像顯示每個靶結構內大量的釓信號。在右側半球中，在腹側殼核中看到了輕微的血管周圍運輸和前連合內的分佈。

2號受試者.在0.127mL輸注入殼核和0.207mL輸注入丘腦後獲得T1 MRI。輸注後T1 MRI顯示右側丘腦內過量的輸注分佈，其測量約1cm前-後方向和1cm背腹方向。冠狀T1顯示靶位點內的釓分佈，其朝內囊內側延伸且朝背殼核優先延伸。大量輸注包含於殼核邊緣內，然而，經由血管周圍間隙的運輸也存在於內囊和前聯合的白質。分析揭示丘腦和殼核中釓輸注體積(Vi)與分佈體積(Vd)的比率為1：2。

生活中的觀察(In-life observation)

動物健康和神經症狀的詳細觀察在給藥後基於每日實施5天；隨後，每週一次實施詳細的觀察直至研究結束。實施了觀察和每日死亡率檢查。顱內給藥前、收集血液步驟時和在屍檢時實施體重評估。手術前的治療組和實體剖檢時之間未觀察到體重的顯著差異(圖1)。收集全血、血清和腦脊液(CSF)用於血液學、血清化學、AAV1和AAV2衣殼抗體測定法和eGFP mRNA水平分析。

生活中血液收集和處理

在注射前、約注射後72小時以及屍檢時，根據採血時間表(參見下文表3)收集血液(約5mL)。將約0.5-1.0mL的全血收集入EDTA管用於血液學分析。將約2.0mL的全血收集入血清分離管(具有凝膠，BD Microtainer)並處理至血清以獲得合適的血清用於化學分析和AAV1和AAV2衣殼抗體分析。

CSF收集和處理

在兩個不同的時間點收集CSF：顱內給藥前和屍檢時。在麻醉下通過頸椎脊椎穿刺使用置於俯臥位的動物實施CSF收集。測試製品投予前，收集1-2mL的CSF，在乾冰上冷凍，並在

-60℃保存。屍檢時(PBS輸注前)，收集2-4mL的CSF，通過0.8微米注射過濾器過濾入標記的收集管，且一式兩份(1mL等分試樣用於衣殼抗體分析且2-4mL等分試樣用於GFP分析)轉移至eppendorf管中，立即在乾冰上冷凍並保存在

-60℃。

屍檢和組織收集

在顱內給藥步驟後約30天處死全部動物。使用戊巴比妥鈉的靜脈投予處死每隻動物。處死並收集血液和CSF後，屍體反向用PBS輸注(在無RNA酶條件下)，隨後用PFA輸注。夾住下行主動脈以減少周邊組織的固定。使用該步驟以收集固定的腦組織以及新鮮的組織樣品用於通過QPCR的GFP分析。組織收集表列舉了收集的組織(表4)。PBS輸注過程中(4% PFA輸注初始前)，在無RNA酶的條件下用一次性無菌手術刀(對於每個個體的活檢使用新手術刀)將所選組織的活檢樣品(0.5-1.0cm³)(也列舉在組織收集表中)收集入無RNA酶的管中，並保存在

-60℃。

腦和脊髓處理

從動物小心移除整個腦部並在比例尺旁邊拍照。一旦從顱骨移開，將腦置於腦基質並冠向切成6mm塊。將冠狀塊保存於PFA並處理用於組織學。將包含額葉皮質和中腦區域的相關塊切片成自由浮動40微米切片。從動物小心移除完整脊髓。將脊髓區段保存在PFA中用於組織學。來自頸椎、胸椎、腰椎區域的代表性區段切片成自由浮動40微米切片。

用PBS-肝素隨後4%緩衝多聚甲醛(PFA)輸注後，使用一次性刀片和猴腦基質將動物腦部切割成6-mm塊(冠狀面)。將順序塊(11-12腦塊每動物)水平置於白板上並用順序分配的字母拍照。隨後將全部腦塊在4%緩衝PFA中後-固定24小時。對每個腦塊的固定質量進行視覺檢測(塊內未觀察到粉色)。PFA-後固定以後，藉由在PBS中沖洗3X並在30%蔗糖(冷凍)浸沒而處理成自由浮動的切片，然後切割成40-μm自由浮動切片。

AAV載體的產生

臨床評估前，通常經由標準三重轉染方法(TT)產生AAV載體，其中HEK293細胞與兩種或三種編碼對於載體包裝所需的順(載體基因組)和反(AAV rep和cap基因；腺病毒輔助基因E2A、E4和VA)元件的質體共轉染(Hauck等，(2009)Mol.Ther.17：144-152)。由於質體DNA的輸入可容易地並迅速地修飾，該方法允許基於不同血清型的載體評估並攜帶多種表現盒。雖然該轉染方法具有靈活性和相對快的周轉時間，涉及其可擴展性則呈現出挑戰性，這限制了該方法用於大量rAAV載體產生用於臨床用途的適用性。

在目前的時間，臨床級rAAV經由無輔助病毒的瞬時轉染、重組桿狀病毒或單純皰疹病毒為基礎的生產系統或包裝/生產細胞系方法大規模產生(Ayuso等，(2010)Curr.GeneTher.10：423-436)。腺相關病毒生產細胞系(PCL)是有效的用於大規模產生臨床級AAV載體的有效方法。在該系統中，包含三組分(載體序列、AAV rep和cap基因和可選擇的標記物基因)的單質體穩定轉染入HeLaS3細胞。然而，理想的是確定衍生自生產細胞系的AAV載體是否與經由其他方法生成的載體在效力上等同，例如，標準順勢轉染方法。

使用不同的兩種生產方法生成AAV病毒載體用於該研究：三重轉染(TT)和生產細胞系(PCL)。藉由(使用磷酸鈣)三重轉染人胚腎癌293細胞(HEK-293)產生重組AAV載體AAV1-GFP(TT)和AAV2-GFP(TT)(參照Xiao等，(1998)Journal of Virology 72：2224-2232)。簡言之，對於通過瞬時轉染的AAV載體的產生，使用聚乙烯亞胺(PEI)和1：1：1比率的三種質體(ITR載體、AAV2rep/cap2或AAV2rep/cap1和pAd輔助質體)轉染HEK293細胞。ITR載體編碼用於巨細胞病毒增強子/雞β肌動蛋任雜合啟動子(CBA)的EGFP下游的cDNA。使用的pAd輔助為pHelper(Stratagene/Agilent Technologies,Santa Clara,CA)。

使用AAV生產細胞方法產生重組AAV載體AAV1-GFP(PCL)和AAV2-GFP(PCL)(參照Thorne等，(2009)Human Gene Therapy 20：707-714和Martin等，(2013)Human Gene Therapy Methods 24：253-269)。簡言之，通過用包含來自血清型2的rep基因和來自血清型1或2的衣殼基因、啟動子-異源核酸序列、側翼為AAV2反向末端重複(ITR)的載體基因組和嘌呤黴素抗性基因的質體穩定轉染Hela-S3細胞(ATCC LLC-2.2)生成產物特異性生產細胞系。載體基因組攜帶用於巨細胞病毒增強子/雞β肌動蛋白-雜合啟動子CBA的EGFP下游的cDNA。轉染的細胞在嘌呤黴素存在下生長以分離穩定的整合子。篩選生成的細胞系以選擇引導選殖。產物特異性細胞選殖隨後擴大至生產生物反應器，並用野生型腺病毒作為輔助病毒感染以初始AAV生產。感染72小時後收穫病毒，通過加熱失活腺病毒並通過陰離子交換法去除。

來自兩種生產平臺的AAV的生產如先前所述實施(Qu,G.等(2007)J.Virol.Methods 140：183-192)。所得的全部AAV1和AAV2-GFP載體的滴度示於表5中。在包含180mM氯化鈉、10mM磷酸鈉(5mM NaH₂PO₄．2 H₂O+5mM Na₂HPO₄．H₂O)和0.001%泊洛沙姆188(Lutrol F68),pH 7.5的水中製備全部載體。

免疫組織化學

用針對GFP的抗體(1：500,AB3080；Chemicon)的免疫染色在Zamboni固定的覆蓋全部額葉皮質並以向後方向延伸至紋狀體水平的40-μm冠狀切片上實施。GFP免疫陽性神經元的定位參照立體定向坐標中的恒河猴腦(The Rhesus Monkey Brain in Stereotactic Coordinates)(Paxinos,G.H.X.和Toga,A.W.(2000)San Diego,CA：Academic Press)分析以鑑定皮質和紋狀體中免疫染色的特定區域。

通過3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)的GFP染色：在PBST中洗滌切片(3個每6-mm塊：2mm間隔)3次每次5分鐘，然後用1% H₂O₂處理20分鐘。切片在Sniper封閉液(可在biocare.net/product/background-sniper/在線獲得)中於室溫溫育30分鐘，隨後與在Da Vinci Green稀釋劑(可在biocare.net/在線獲得)中1：1000稀釋的初級抗GFP抗體(可在www.lifetechnologies.com/在線獲得)過夜溫育。在包含0.1% Tween-20(PBST)PBS中沖洗3次每次5分鐘後，將切片在Mach 2 HRP多聚物(http：//biocare.net/)中溫育1小時，隨後洗滌3次並比色法顯色(DAB)。免疫染色的切片用甲酚紫複染並固定在載玻片上且用 Cytoseal®(可在www.thermoscientific.com/在線獲得)密封。

非人靈長類(NHP)腦GFP表現的覆蓋的計算：來自匹配的IHC-染色的系列切片的GFP染色投射到單獨的每隻猴腦部相應的MRI掃描上(冠狀面中的T1-加權MR成像)。GFP表現的分佈/覆蓋用OsiriX Imaging軟體版本3.1(The OsiriX Foundation,Geneva,Switzerland)實施。

用於載體嗜性和神經轉導效力的雙重免疫螢光：對於具有GFP的不同細胞標記物(NeuN、S-100、Iba1)的雙重螢光免疫染色，通過在具有20%的馬血清的PBST中在室溫溫育過夜將初級抗體的組合應用至切片作為初級抗體的混合物(cocktail)。如下使用初級抗體：抗GFP抗體(1：500，如上)；抗NeuN(1：500，可在www.emdmillipore.com/在線獲得)；抗S-100(1：300，可在biocare.net/在線獲得)、抗Iba1(1：500，可在biocare.net/在線獲得)；抗Olig2(1：50，可在www.emdmillipore.com/在線獲得)。在PBST中洗滌3次後，初級抗體藉由在暗處用合適的二級螢光染料綴合的標記抗體溫育2小時可視化：山羊抗小鼠DyLight 549和山羊抗兔DyLight 488(可在www.biocare.net/在線獲得)。全部二級抗體在螢光抗體稀釋劑(可在biocare.net/在線獲得)中1：1,000稀釋。此外，為淬滅自發螢光，將切片在0.1%蘇丹黑溶液(70%乙醇)中溫育。在PBS中最終洗滌後，將切片用Vectashield Hard Set Mounting Medium for Fluorescence(可在www.vectorlabs.com/在線獲得)覆蓋。對照切片在無初級抗體下處理，且在這些條件下未觀察到顯著的免疫染色。

將配備CCD彩色攝像機和成像分析系統的Zeiss Axioskop螢光顯微鏡(可在www.zeiss.com/在線獲得)(Axiovision Software，可在www.zeiss.com/在線獲得)用於確定雙重標記的細胞的存在(紅色和綠色通道中都為陽性)。用於雙重標記切片的顯微照片通過重疊來自兩個不同通道(紅色和綠色；共同定位呈現黃色)的圖像獲得而不改變切片的位置或聚焦(物鏡X 20)。對於GFP/NeuN雙重染色，從載體輸注位點選擇來自每隻猴在~4-mm間隔的3個切片。對於靶向的腦部區域(尾狀核和殼核)中AAV1-eGFP或AAV2-eGFP載體的神經元轉導效力的評估，將5個計數框(700μm x 550μm)隨機置於GFP+區域。轉導的初級主要區域(PAT)定義為覆蓋多於40%靶向結構的GFP-陽性區域("雲")。相似地，為評估PAT外(OPAT)神經轉導的效率，在超越靶向結構(尾狀核和殼核)中或在皮質中GFP-陽性"霧狀"的清晰邊緣選擇來自每切片的5個計數框(700μm x 550μm)(圖10C)。為確定GFP/NeuN-陽性細胞比例，每個計數框計數兩次，第一次用紅色通道計數NeuN+細胞的數目且第二次用組合的紅色和綠色通道計數共染色細胞(GFP+和NeuN+)的數目。對於所選3個切片的每個計數至少1,500 NeuN+細胞(每切片5個計數框)。最終，確定GFP+/NeuN+與總NeuN+的百分比。對於紋狀體的全部計算藉由添加來自每隻動物兩半球的結果並組合來自殼核和尾狀核的值進行，因為在每隻動物的兩結構中平均轉導效率相同。

即時定量PCR(TaqMan)

GFP mRNA水平通過即時定量PCR測量。肝、心、肺、腎和脾的樣品用於全部RT-PCR分析。使用QIAGEN miRNeasy迷你套組提取總RNA隨後逆轉錄並根據製造商的說明使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)擴增。實施定量RT-PCR反應並在QuantStudio12K Flex Real-Time PCR系統(Applied Biosystems)上分析。每個樣品一式兩份運行且相對的基因表現使用標準曲線確定。

MR成像數據分析

半定量分析(數碼MRIs Vd/Vi)：用OsiriX Imaging軟體版本3.1(The OsiriX Foundation,Geneva,Switzerland)實施分佈體積(Vd)分析。輸注位點、套管軌跡和套管尖以冠狀面在T1-加權MR成像上鑑定。界定感興趣的區域(ROI)以概述T1釓信號和靶位點(即殼核和尾狀核)。分析ROI和圖像序列的三維體積重建以估測輸注的體積分佈(Vd)和與輸注體積的比率(Vi)。

轉基因表現的組化分析：為評估轉基因表現，處理腦切片用於免疫組化分析(IHC)。用戊巴比妥鈉(25mg/kg靜脈內)深度麻醉動物並在投予載體後4周處死。移除腦部並冠向切割成6-mm塊。將該塊在緩衝多聚甲醛(4%)中後-固定24小時，在PBS中快速洗滌並在30%蔗糖/PBS溶液中調整用於冷凍保存。將福爾馬林固定的腦塊在在低溫恒溫器中切割成40-μm冠狀切片。系列收集跨越全腦的自由浮動的切片並保存在抗冷凍溶液中用於進一步IHC分析。

結果

如通過免疫組化所視，AAV1-GFP和AAV2-GFP載體驅動來自轉導的神經元的GFP的大量表現。將AAV1通過CED輸注入尾狀核和殼核後，在尾狀核和殼核(圖2C&D)以及黑質(圖2D)檢測到大量的GFP免疫染色。除紋狀體外，恒河猴腦部的大量皮質區域也被轉導(圖2A-D)。皮質GFP表現在前額葉皮層的關聯區域、初級感覺皮質區、主要運動皮質以及枕葉皮質的廣泛區域中最明顯(圖2A-D)。

作為位於皮質層IV中的錐體神經元形態鑑定的皮質內的大量GFP-陽性神經元，其軸突投射到覆層。GFP-陽性神經元的密度在額葉(圖3A & B)和枕葉皮質(圖3C&D)中特別高，其中轉導了大量的神經元(圖3B&D)以及星形膠質細胞(圖3A&C)。

實施例2：紋狀體內AAV2載體遞送後廣泛地GFP表現

當經由對流增強遞送(CED)進行遞送時，評估了AAV2有效靶向恒河猴腦中紋狀體和皮質兩結構的能力。將包含在巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子控制下的GFP cDNA的AAV載體根據上文實施例1中所述的方法使用CED輸注入8只成年恒河猴的尾狀核和殼核。

通過CED將AAV2輸注入紋狀體導致注射區域中(尾狀核和殼核)(圖4C)、黑質(圖4D)和恒河猴腦部的大量皮質區域(圖4A-D)GFP的表現。當與用AAV1載體的紋狀體覆蓋比較時，GFP在AAV2注射動物的紋狀體中的表現顯得稍微更受限制和局部化。GFP在NHP紋狀體內的表現是全面的但相對包含在靶向區域的灰質界限內，而無顯著的AAV2-GFP載體輸注相關的洩漏或回流至相鄰的非靶向區域的證據。皮質GFP表現在AAV1所見的相同區明顯。前額葉關聯皮質區、前運動皮質、初級體感皮質區和主運動皮質，以及枕葉皮質的廣泛區域都很好地轉導(圖4A-D)。

實施例3：通過三重轉染或生產細胞系方法製成紋狀體內AAV1和AAV2載體後GFP表現的可比性

至今大量臨床前研究利用由三重轉染隨後使用氯化銫梯度離心或柱層析純化製成的AAV載體。因此，為評估載體產生對體內生物分佈的影響，比較了三重轉染(TT)或生產細胞系(PCL)兩種載體產生的方法。通過這兩種不同製造平臺生成的AAV1和AAV2載體經由CED投予，且比較其在恒河猴腦部中的分佈。

當與通過生產細胞系方法生成的AAV1-GFP載體相比時，由三重轉染生成的AAV1-GFP載體的輸注獲得等同的GFP分佈和覆蓋。注射入恒河猴紋狀體30天后，GFP分佈在AAV1-GFP(TT)(圖5C&D)和AAV1-GFP(PCL)(圖5A&B)載體間是可比較的。

用AAV2-GFP載體看到相似的結果。GFP分佈相似且在AAV2-GFP(TT)(圖6C&D)和AAV2-GFP(PCL)(圖6A&B)注射的腦之間是可比較的。

為測量輸注表現，使用90μl的每種與釓造影劑(2mM Prohance；Bracco Diagnostics,Inc.)混合的載體將AAV1-eGFP(TT)；AAV2-eGFP(TT)；AAV1-eGFP(PCL)和AAV2-eGFP(PCL)輸注入每個紋狀體(60μl輸注入殼核且30μl輸注入尾狀核)。來自每輸注的磁共振圖像(MRI)確認了每套管的定位準確且輸注覆蓋了靶區域。全部輸注良好地包含在靶結構中。在MR成像上由釓信號生成的輸注分佈的三維重建顯示輸注的安置和分佈在全部動物中非常一致。此外，對於每次遞送計算分佈體積(Vd)和輸注體積(Vi)間的比率(Vd/Vi)，且數據在全部輸注中一致。Vd比Vi大約3倍(範圍2.1-4.6)(表6和7)。

的相應地MRI掃描上計算(BrainLab軟體)。

AAV1-eGFP和AAV2-eGFP(通過兩種產生方法TT和PCL製備)兩者雙側注射入NHP的紋狀體後，貫穿兩靶結構(殼核和尾狀核)以及投射區域(外部和內部蒼白球-GPe和GPi、黑質-SN、底丘腦核-STN、皮質區域-神經層IV和V)的eGFP穩固表現明顯(圖7)。

為評估釓(Gd)作為載體分佈標誌物的作用，計算了GFP表現區域(來自組化切片)與相應MR掃描上釓信號的區域的比率。對於用血清型AAV1輸注的猴，該比率為1.21±0.10，而對於AAV2為0.74±0.04(圖8)。1.0的比率表明由MRI確定的GFP表現和載體分佈間的完美匹配。該差異表明AAV1載體分佈超越Gd信號並實現比AAV2更好的轉導的主要區域中的傳播。

為評估輸注的AAV載體在腦內的分佈，來自每隻動物的代表性的自由浮動腦切片(3切片每塊；40-μm厚)用兔抗GFP抗體(Millipore；目錄號3850，1：500稀釋)染色。免疫組化評估揭示注射靶(右側和左側殼核和尾狀核)以及從注射區域投射的多重區域(皮質區域)內深褐色DAB信號。

通過將GFP表現的程度投射至每隻猴腦的MRI掃描上，計算皮質區域(HD相關的腦部區域)的覆蓋百分比(參見用於總結的表6和用於進一步詳述的表7)。在全部猴中，平均轉導了24%的紋狀體，其導致GFP在皮質中的大量表現(圖7)。皮質中GFP表現的程度不與使用的AAV血清型(AAV1對AAV2)或載體產生的方法(TT對PCL)相關。似乎在輸注位點(紋狀體)內輸注物更寬的分佈是皮質中轉導程度的核心驅動。一隻NHP(1號受試者；AAV1-eGFP[TT])顯示全腦(額葉和枕葉兩者-參見圖7)的皮質區域(層IV和V)中特別穩固的GFP表現。其他動物顯示與尾狀核和殼核內程度和定位的解剖區域中的變化相關的皮質表現的變化性。由於靶向了紋狀體的前和連合區域，在額葉和頂葉皮質區檢測到更多GFP但在枕葉皮質檢測到較少。每隻動物的組化分析總結於下文(通過治療組分組)。

治療組2(ssAAV2/1-CBA-eGFP TT)

全腦中eGFP表現的免疫組化評估揭示了靶向位點(殼核和尾狀核的核中)和投射結構(蒼白球、黑質、丘腦、底丘腦核和皮質區)中的穩固信號。

1號受試者。受試者顯示GFP表現至全腦(額葉和枕葉)的皮質區域(層4和5)的特別穩固的傳播。GFP-陽性細胞的形態學暗示神經元和星形膠質細胞轉導，其後來由雙重免疫染色得以確認(參見下文)。GFP表現覆蓋率的計算顯示轉導了全部皮質的91%(參見表7)(該計算通過將GFP信號的範圍投射至分析的猴腦的MRI掃描上完成)。

2號受試者.受試者顯示殼核和尾狀核中以及兩半球蒼白球和黑質的穩固轉導。GFP表現至皮質在1號受試者中投射不太明顯，且主要觀察在皮質的額葉區域。儘管GFP信號也在枕葉皮質中檢測到，GFP-陽性細胞密度顯著更低。皮質GFP表現覆蓋率占50%(表7)。與1號受試者相似的是，GFP-陽性細胞具有神經元和星形膠質細胞形態兩者，其由雙重免疫螢光確認。

3號受試者.受試者顯示殼核和尾狀核以及投射的結構(蒼白球、黑質、底丘腦核、丘腦和皮質)中的強GFP表現。儘管GFP信號在皮質的一些區域清楚檢測到，但GFP表現僅占其整體皮質覆蓋率的41%(全部測試的猴中最低；參見表7)。轉導了神經元和星形膠質細胞兩者。右側前放射冠的大部分也顯示了GFP-陽性信號，最可能作為套管穿透至紋狀體的載體溢出的結果。

治療組3(ssAAV2/2-CBA-eGFP TT)

6號受試者.受試者顯示兩靶向結構(殼核和尾狀核)中的強GFP信號。在這兩區中檢測到稠密散佈的陽性細胞。GFP表現還傳播至額葉皮質區域、蒼白球、黑質、底丘腦核和丘腦的一些部分。皮質中GFP表現覆蓋率占75%(表7)。GFP-陽性細胞具有大部分神經元形態，其後來通過雙重免疫螢光確認。星形膠質細胞形狀的GFP-陽性細胞在內囊以及數個皮質點和清晰可見的輸注套管軌跡緊密相鄰的白質區域中檢測到。

7號受試者.受試者在右側和左側紋狀體(殼核和尾狀核兩者)內都顯示GFP-陽性信號。當與其他輸注的猴比較時其分佈相當差且模式表現為“點狀”而不均勻。所以，全部投射的腦結構中的GFP信號也顯得較弱。皮質中GFP表現覆蓋率占47%(表7)。GFP-陽性細胞具有大部分神經元形態，其後來通過雙重免疫螢光確認。星形膠質細胞形狀的GFP-陽性細胞在內囊以及數個皮質點和清晰可見的輸注套管軌跡緊密相鄰的白質區域中檢測到。

治療組4(ssAAV2/1-CBA-eGFP PCL)

4號受試者.受試者顯示靶向結構殼核和尾狀核中非常穩固的GFP表現。GFP-陽性信號也在蒼白球、黑質、底丘腦核、丘腦和皮質區中檢測到。皮質中GFP表現覆蓋率占61%(表7)。放射冠的前部也顯示GFP-陽性信號，最可能作為套管穿透至紋狀體的載體溢出的結果。陽性細胞具有神經元和星形膠質細胞形態兩者，其後來通過雙重免疫螢光確認。

5號受試者.受試者顯示紋狀體(殼核和尾狀核兩者)中穩固的GFP表現。GFP-信號還在投射的結構(蒼白球、黑質、底丘腦核、丘腦和皮質區)中檢測到。皮質中GFP表現覆蓋率占68%(表7)。放射冠的前部也顯示 GFP-陽性信號，最可能作為套管穿透至紋狀體的載體溢出的結果。陽性細胞具有神經元和星形膠質細胞形態兩者。

治療組5(ssAAV2/2-CBA-eGFP PCL)

9號受試者.受試者在紋狀體(殼核和尾狀核兩者)中顯示非常穩固的GFP表現。GFP-信號還在投射的結構(蒼白球、黑質、底丘腦核、丘腦和皮質區)中檢測到。皮質中GFP表現覆蓋率占73%(表7)。GFP-陽性細胞具有大部分神經元形態，儘管星形膠質細胞形狀的GFP-陽性細胞也在白質(內囊)和套管軌跡附近檢測到。

8號受試者.受試者在紋狀體和投射的結構(蒼白球、黑質、丘腦、底丘腦核和皮質)中顯示穩固的GFP表現。皮質中GFP表現覆蓋率占50%(表7)。GFP-陽性細胞具有大部分神經元形態，儘管星形膠質細胞形狀的GFP+細胞也在白質(內囊、放射冠)內和套管軌跡附近檢測到。

雙重免疫螢光

對於用AAV1-eGFP載體(TT和PCL)轉導的兩組NHP，GFP-陽性細胞的形態表明神經元和星形膠質細胞的轉導(圖9A-9D)。這通過用針對GFP和NeuN(神經元標記物)或GFP和S-100(星形膠質細胞標誌物)的抗體的組合的雙重免疫螢光染色確認(圖10A-10C)。與之相反，AAV2-eGFP(TT和PCL兩者)主要指導神經元轉導(圖9E-9G和10D)。星形膠質細胞譜系的GFP-陽性細胞也在內囊(圖9H)以及其中輸注套管軌跡可見的白質的皮質區中檢測到。

基於雙重免疫螢光，對於全部NHP計算了紋狀體和皮質區神經元轉導的效率(在輸注位點的冠狀面)。圖11A總結了紋狀體中的發現。每隻動物的單獨計算示於下文表8。

通過MRI所示的主要轉導區域中紋狀體神經元轉導範圍為50%-65%。在用AAV1-eGFP(TT)輸注的NHP中觀察到最高轉導效率，具有64.2±5.9%的平均值；且在AAV2-eGFP(TT)組中最低，具有46.6±11.7%的平均值(p<0.05；2-向ANOVA)。這表明血清型AAV1在轉導神經元中相比AAV2具有~18%更高的效率。藉由PCL產生的AAV1-eGFP表明相比AAV2-eGFP(50.1±5.8%)朝向轉導更多神經元(59.7±8.1%)較弱的趨勢(p>0.05；2-向ANOVA)。

上述計算源自通過MRI定義的強GFP轉導區域，(轉導-PAT的主要區域)。此外，計算了PAT外區域中神經元紋狀體轉導的效率以看GFP-陽性細胞是否可以在強GFP信號的清晰邊界外檢測到("在轉導的主要區域外"-OPAT)，表明也許全部測試的載體以相同的方式傳播。如何選擇這些區域的方案(5個計數框的隨機選擇)示於圖11B。觀察到血清型AAV1和AAV2間OPAT中轉導效率估計的巨大差異(圖11C)，其中AAV1相比AAV2轉導多許多的神經元(8.1±3.8%對0.74±0.25%對於TT組且7.2±3.5%對2.16±1.8%對於PCL組；兩比較中p<0.05，2-向ANOVA；)。每隻動物的單獨計算示於下文表9。

此外，計算了投射至紋狀體的皮質區域中轉導的效率。由於皮質覆蓋率的程度在動物中有所不同，在具有相鄰的GFP-陽性紋狀體的切片中計數隨機的皮質區域。在動物中觀察到明顯差異(表8)，其與使用的血清型無明顯相關性。對於AAV1的平均神經元轉導效率為13.6±8.3%相對於AAV2的13.4±9.0%(p>0.97)。

如上文所述，AAV1-eGFP轉導比神經元多許多的星形膠質細胞(S-100標記物)。GFP-陽性星形膠質細胞在主要轉導位點(紋狀體)以及投射至紋狀體的皮質中檢測到。GFP-轉導的星形膠質細胞的實例示於圖10C。對於AAV2-eGFP載體，僅零星的GFP+星形膠質細胞可在輸注套管軌跡周邊檢測到。為確定載體是否轉導其他腦中的抗原呈遞細胞，來自全部猴的代表性腦切片用針對GFP和Iba-1(特異性針對小神經膠質細胞)的抗體共染色。這些動物都未顯示雙重標記的細胞，排除了這種可能性(圖10E)。反過來，在全部測試的猴中，針對Olig-2的染色(用於少突膠質細胞的標記物)顯示僅數個細胞對於GFP和Olig-2都為陽性。這些稀少的細胞主要在套管軌跡附近檢測到(數據未顯示)。

腦切片用蘇木精-伊紅(H&E)染色以確定這些抗體是否觸發了神經炎症。切片主要檢查了血管周圍袖套(即，淋巴細胞或血漿細胞在血管周圍以密集量積累)的存在。儘管在全部猴中檢測到不同程度的這些浸潤物，未觀察到其他載體/轉基因-相關的組化發現。然而，觀察到AAV1相比AAV2在轉導主要區域內引起巨噬細胞和淋巴細胞的稍微更顯著的浸潤(圖12A和12B)。而且，由三重轉染產生的載體相比由生產細胞系方法生成的載體看起來引起更廣泛的血管周圍袖套。值得注意的是，在轉導的投射區(皮質區域)中未檢測到浸潤物。

實施例4：中樞神經系統(CNS)外的外周組織中可檢測的GFP表現的缺乏

在屍檢時收集外周器官組織包括腎、肝、肺、心和脾以評估是否CED投予的AAV-GFP轉基因表現可在CNS外檢測。

結果

在任何收集的器官中未檢測到GFP的可檢測水平。AAV-GFP(TT)(圖13A)和AAV-GFP(PCL)(圖13B)載體未顯示可檢測的GFP外周表現。用AAV2/1-GFP(TT)載體注射的小鼠腦組織用作該試驗的陽性對照。

結論

治療蛋白向腦部的有效遞送對於實現臨床效力同時最小化副作用仍為嚴重的障礙。基因遞送的發展已提供了在腦實質中建立生物製劑生產的機會。該進步導致多項臨床試驗的初始，其中AAV載體已成為優選的用於治療神經病症的載體系統。儘管特定核的焦點靶向能夠可靠地通過立體定向神經外科輸注實現，人皮質的廣泛的錯綜複雜佈局通過病毒載體的直接輸注並不能容易地靶向。安全實現腦中廣泛基因表現的難度已阻礙需要皮質遞送的神經性疾病的潛在治療的開發。

如上文所述，AAV載體(例如AAV1和AAV2)能夠提供向全部靈長類動物紋狀體(尾狀核和殼核)的廣泛遞送以及向大腦皮質內顯著數量的細胞(包括額葉皮質、枕葉皮質和層IV)、丘腦和海馬區的遞送。報告蛋白GFP在大腦皮質無已知功能，將其應用於本文討論的研究中。使用CED遞送方法將AAV1和AAV2-GFP輸注入尾狀核和殼核導致在尾狀核和殼核兩者以及皮質的數個區域中GFP的高水平表現。額葉皮質中的GFP-陽性神經元位於距AAV-GFP輸注位點>20mm，由此證明GFP蛋白和AAV載體的軸突轉運。不希望收到理論限制，由於GFP仍在細胞質且其並不是分泌蛋白，認為皮質中GFP的存在指示直接的細胞轉導和AAV2載體的主動運輸沿單個軸突投射。亨廷頓氏病是例示性疾病，對其紋狀體遞送AAV(例如CED紋狀體遞送)可為有用的。亨廷頓氏病影響紋狀體和皮質區域且因此靶向兩區域的治療策略是理想的。

本文公開的發現強調遞送AAV載體(例如AAV1和AAV2)以轉導位於距紋狀體輸注位點相當距離的神經元的潛力。AAV載體(例如AAV1和AAV2)的紋狀體內投予因此在用於治療需要將治療分子遞送至紋狀體和皮質的CNS病症(包括但不限於亨廷頓氏病)中是理想的。此外，由於通過三重轉染方法和生產細胞系方法生成的AAV載體顯示可比較的轉基因表現模式和轉導水平，生成AAV載體的三重轉染和生產細胞系方法適用於本發明。

<110> 美商健臻公司(Genzyme Corporation)

<120> 病毒顆粒至紋狀體和皮質的增強遞送

<140> 105104342

<141> 2016-02-15

<150> US 62/114,544

<151> 2015-02-10

<150> US 62/220,997

<151> 2015-02-19

<160> 1

<170> 用於Windows 4.0版的FastSEQ

<210> 1

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的構築體

<400> 1

Claims

一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒用於製造供遞送rAAV至哺乳動物的中樞神經系統(CNS)之醫藥品之用途，其中該rAAV顆粒係配製以經由對流增強遞送(CED)投予至該哺乳動物的紋狀體，其中該rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，該異源核酸至少在該哺乳動物的大腦皮質和紋狀體的枕葉皮質和/或層IV中表現，其中rAAV顆粒係配製以投予至紋狀體每半球的尾狀核中的至少一處位點和殼核中的兩處位點。
一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒用於製造供治療哺乳動物中CNS病症之醫藥品之用途，其中有效量的該rAAV顆粒係配製以經由對流增強遞送(CED)投予至該哺乳動物的紋狀體，其中該rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，該異源核酸至少在該哺乳動物的大腦皮質和紋狀體的枕葉皮質和/或層IV中表現，其中rAAV顆粒係配製以投予至紋狀體每半球的尾狀核中的至少一處位點和殼核中的兩處位點。
如請求項2之用途，其中該CNS病症為亨廷頓氏病(Huntington’s Disease)。
如請求項3的用途，其中該異源核酸編碼靶向亨廷頓蛋白的miRNA，且其中該亨廷頓蛋白包含與亨廷頓氏病相關的突變。
如請求項2的用途，其中該CNS病症為帕金森氏病(Parkinson's Disease)。
如請求項1-5中任一項的用途，其中：(a)該rAAV顆粒包含AAV血清型1(AAV1)衣殼；或(b)該rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。
如請求項1-5中任一項的用途，其中該哺乳動物是人。
如請求項1-5中任一項的用途，其中將該rAAV顆粒投予至紋狀體的殼核和尾狀核，其中投予至殼核的rAAV顆粒與投予至尾狀核的rAAV顆粒的比例為至少2：1。
如請求項1-5中任一項的用途，其中：(a)該異源核酸在前額葉相關皮質區、運動前區皮質、初級軀體感覺皮質區、感覺運動皮質、頂葉皮質、枕葉皮質和/或初級運動皮質中表現；(b)該rAAV顆粒在大腦皮質中經歷逆行或順行轉運；及/或(c)該異源核酸進一步在丘腦、底丘腦核、蒼白球、黑質和/或海馬區中表現。
如請求項1-5中任一項的用途，其中該rAAV顆粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合、牛AAV或小鼠AAV衣殼rAAV2/HBoV1血清型衣殼。
如請求項1-5中任一項的用途，其中該rAAV載體包含側翼為一個或多個AAV反向末端重複(ITR)序列的異源核酸；其中：(a)該異源核酸側翼為兩個AAV ITR；及/或(b)該AAV ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
如請求項1-5中任一項的用途，其中：(a)該rAAV顆粒的ITR和衣殼源自相同的AAV血清型；或 (b)該rAAV病毒顆粒的ITR和衣殼源自不同的AAV血清型。
如請求項1-5中任一項的用途，其中該異源核酸可操作地與啟動子連接，其中：(a)該啟動子在CNS的細胞中表現該異源核酸；(b)該啟動子在神經元和/或神經膠質細胞中表現該異源核酸；(c)該啟動子是CBA啟動子、最小CBA啟動子、CMV啟動子或GUSB啟動子；及/或(d)該啟動子是誘導型。
如請求項1-5中任一項的用途，其中該rAAV載體包含一個或多個增強子、剪接供體/剪接受體對、基質附接位點或多聚腺苷酸化信號。
如請求項1-5中任一項的用途，其中該rAAV載體是自身互補的rAAV載體。
如請求項1-5中任一項的用途，其中該異源核酸編碼：(a)治療多肽；或(b)治療核酸，其中該治療核酸是siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。
如請求項16的用途，其中：(a)該治療多肽是酶、神經營養因子、在具有CNS相關病症的個體中缺失或突變的多肽、抗氧化劑、抗細胞凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎症因子、α-突觸核蛋白、酸性β-葡糖苷酶(GBA)、β-半乳糖苷酶-1(GLB1)、艾杜糖酸酸2-硫酸酯酶(IDS)、半乳糖神經醯胺酶(GALC)、甘露糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶(MAN2B1)、β-甘露糖苷酶(MANBA)、假芳基硫酸酯酶A(ARSA)、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶(GNPTAB)、酸性鞘磷脂酶(ASM)、尼曼-匹克C蛋白(NPC1)、酸性α-1,4-葡糖苷酶(GAA)、己糖胺酶β亞基、HEXB、N-硫代葡糖胺磺基水解酶(MPS3A)、N-α-乙醯葡糖胺酶(NAGLU)、肝素乙醯-CoA、α-葡糖胺酶N-乙醯轉移酶(MPS3C)、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶(GNS)、α-N-乙醯半乳糖胺酶(NAGA)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、己糖胺酶α亞基(HEXA)、亨廷頓蛋白(HTT)、溶酶體酸性脂肪酶(LIPA)、天冬胺醯葡糖胺酶、α-半乳糖苷酶A、棕櫚醯蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶體跨膜蛋白、半胱胺酸轉運蛋白、酸性神經醯胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、組織蛋白酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸、酸性β-半乳糖苷酶或α-神經胺酸酶；或(b)該治療多肽或治療核酸用於治療CNS的病症，其中：(i)該CNS的病症是溶酶體貯積症(LSD)、亨廷頓氏病、癲癇、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、中風、皮質基底節變性(CBD)、皮質基底神經節變性(CBGD)、額顳葉癡呆(FTD)、多系統萎縮(MSA)、進行性核上性麻痹(PSP)或腦癌；或(ii)該病症是選自下組的溶酶體貯積症：天冬胺醯葡糖胺尿症、法布裡病、小兒巴藤病(CNL1)、經典晚期小兒巴藤病(CNL2)、青少年巴藤病(CNL3)、Batten形式CNL4、Batten形式CNL5、Batten形式CNL6、Batten形式CNL7、Batten形式CNL8、胱胺酸貯積症、法伯氏病、岩藻糖苷貯積症、半乳糖苷唾液酸貯積症、高歇氏病1型、高歇氏病2型、高歇氏病3型、GM1神經節苷脂貯積症、亨特病、克拉伯病、α甘露糖苷貯積症、β甘露糖苷貯積症、馬-拉病、異染性腦白質營養不良症、莫爾丘病A、莫爾丘病B、黏脂貯積症II/III病、尼曼-匹克A病、尼曼-匹克B病、尼曼-匹克C 病、龐貝氏症、桑德霍夫病、聖菲利柏氏聖菲利柏氏病A型、聖菲利柏氏病B型、聖菲利柏氏病C型、Sanfillipo D病、辛德勒病、Schindler-Kanzaki、唾液酸貯積症、斯利氏病、泰-薩克斯病和沃爾曼病。
如請求項1-5中任一項的用途，其中該rAAV顆粒在組合物中，其中該組合物是包含藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。
如請求項1-5中任一項的用途，其中：(a)該rAAV顆粒通過將編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸三重轉染入宿主細胞而產生，其中該核酸至該宿主細胞的轉染生成能夠產生rAAV顆粒的宿主細胞；或(b)該rAAV顆粒藉由包含一個或多個編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸的生產細胞系產生。
如請求項1-5中任一項的用途，其中該rAAV顆粒使用CED遞送系統遞送。