CN101367001B - 在植物修复中使用表达源自植物酰基辅酶a结合蛋白的转化植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了使用遗传转化的植物对铅进行植物修复的方法。在许多生物中，只有10kDa的ACBPs被鉴定，与此不同的是，模式植物拟南芥中存在一个含六个ACBPs的家族。除了在植物脂代谢中介导酰基辅酶A酯转运的功能外，所有六个拟南芥ACBPs都能够结合重金属铅，因此可应用于植物修复。通过在被污染的环境中种植过表达ACBP的遗传转化植物，这些植物修复方法提供了去除土壤/水/环境中铅污染的廉价、简单且有效的方法。同时也提供了从受污染的水中去除铅的方法。

Description

在植物修复中使用表达源自植物酰基辅酶A结合蛋白的转化植物的方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2007年4月11日提交的系列号为60/922,847的美国临时申请的权益。

技术领域

本发明一般地涉及生物修复的方法，更具体地，涉及使用遗传转化的植物对铅和其它金属污染物进行植物修复(phytoremediation)的方法。

背景技术

植物修复是使用植物从环境中去除污染物如重金属的过程。植物的根从环境中“吸收”污染物，这些污染物可以被储存在植物体内。植物依靠光合作用生长，因此植物修复是一种太阳驱动、环境友好、低成本和原地发生修复的过程。

重金属，采矿业和制造业等工业以及农业产生的不想要的产物，通过污染河流、泥沙、淤泥、地下水和土壤造成环境污染。转基因植物已被成功地用于使土壤中的一些重金属，如汞、镉、砷和硒解毒(Kramer，Curr.Opin.Biotech.16：133-141，2005)。这些对人和动物都具有毒性的重金属对人神经系统有很坏的影响，并能诱发癌症。已知这些污染物也胁迫生长在污染土壤中的野生型植物的生长和发育。含有能够使污染物“解毒”的异源基因(1个或多个)的转基因植物可以耐受这种重金属胁迫，同时清理环境。毒素将被吸收并聚集在植物组织内，例如叶和茎。随后，这些植物(如果毒素还没有被降解)可以被收获然后安全地烧毁。这特别适用于难于降解的金属污染物，包括砷、镉和汞(Powell，Nature doi：10.1038/news021001-14，2002)。

基因工程使得将非源自植物的基因转移到植物中表达成为可能。在植物修复中，表达非植物基因的遗传转化植物的例子包括表达在转基因拟南芥(Arabidopsis)植物中分解砷化合物的细菌酶的那些植物(Dhankher等，Nature Biotech..20：1140-1146，2002)以及其它使汞解毒的植物(Kramer，Curr.Opin. Biotech.16：133-141，2005)。使硒解毒的转基因拟南芥和芸苔(Brassica)植物的产生也有相关报道(Kramer，Curr.Opin.Biotech.16：133-141，2005)。

编码能够结合铅的蛋白的植物基因明显缺乏。通过表达酵母菌YCF1蛋白已经产生能够潜在地对铅进行植物修复的转基因植物(Song等，Nature Biotech.21：914-919，2003)。因为能够去除铅的细菌P型ATP酶在植物细胞内铅的积聚方面不能达到顶点(culminate)，所以它们被视为不适合用于植物修复(Song等，Nature Biotech.21：914-919，2003)。铅的毒性与人体健康极其相关，特别是儿童的健康(http://www.epa.gov/seahome/leadenv.html)，所以植物修复将提供一个有用的策略用以消除铅积聚以及其在食物链中的浓缩。因此，在铅的生物修复中，该方法对人类健康及全世界的环境保护来讲其价值是无法估计的。

先前已经报导，从人体肾脏组织中分离的两个低分子量的细胞质蛋白被观察到在体内以高亲和力结合生理铅。这两个人类蛋白已被鉴定为分子量为5kDa的胸腺素beta-4和分子量为9kDa的酰基辅酶A结合蛋白(Smith等，Chemico-Biological Interactions 115：39-52，1998)。这些已知在哺乳动物中高度保守的小分子蛋白被认为是暴露于环境的人的铅特异性分子靶点(Smith等，Chemico-Biological Interactions 115：39-52，1998)。

9kDa的人ACBP与牛的10kDa细胞质ACBP(地西泮结合抑制剂/enzepine)同源。这些10kDa的ACBPs在许多生物体(Kragelund等，Biochim Biophys Acta 1441：150-161，1999中综述)包括人(Swinnen等，DNA Cell Biol.15：197-208，1996)中被很好地鉴定。已经证实10kDa的牛ACBP和10kDa的大鼠ACBP可以结合棕榈酰辅酶A和油酰辅酶A(Rasmussen等，Biochem.J.265：849-855，1990)。10kDa的ACBP涉及通过结合长链酰基辅酶A酯介导细胞内的酰基辅酶A的转运(Kragelund等，Biochim Biophys Acta 1441：150-161，1999综述)。这些长链酰基辅酶A酯不仅是脂类代谢的中间产物，而且也涉及蛋白运输、小泡运输和基因调节(Faergman和Knudsen，Biochem.J.323：1-12，1997综述)。

Engeseth等已报导在模式植物拟南芥中的10kDa的ACBP(GenBank登记号码为NP_174462)与先前鉴定的人和牛的ACBPs同源(Arch.Biochem.Biophys. 331：55-62，1996)。然而，我们最近的工作显示在拟南芥中存在着其他形式的ACBPs(Leung等，Plant Mol.Biol.55：297-309，2004)。拟南芥完整ACBP基因家族中六个成员编码具有92-668个氨基酸的蛋白，每个含有保守的酰基辅酶A结合结构域(Leung等，Plant Mol.Biol.55：297-309，2004)。具体而言，它们是拟南芥ACBP6(10kDa的ACBP，GenBank登记号码为NP_174462，Engeseth等，Arch.Biochem.Biophys.331：55-62，1996)、膜相关的ACBP1(GenBank登记号码为AAD03482，Chye等，PlantJ.18：205-214，1999)、膜相关的ACBP2(GenBank登记号码为NP_194507，Chye等，Plant Mol.Biol.44：711-721，2000；Li和Chye，Plant Mol.Biol.51：483-492，2003)、ACBP3(GenBank登记号码为NP_194154，Leung等，Planta 223：871-881，2006)以及两个含有kelch基序的ACBPs：ACBP4(GenBank登记号码为NP_187193，Leung等，Plant Mol. Biol.55：297-309，2004)和ACBP5(GenBank登记号码为NP_198115，Leung等，Plant Mol.Biol.55：297-309，2004)。

其它生物中鉴定的许多ACBPs是10kDa的牛ACBP的10kDa同源物，由86-104个氨基酸组成，或者是由第一外显子的选择性使用产生的变体(Nitz等，Int.J.Biochem.Cell Biol.37：2395-2405，2005)。拟南芥ACBP1(338个氨基酸组成)和ACBP2(354个氨基酸组成)的膜结合结构域定位在N末端，并且都含有C末端的锚蛋白重复序列。ACBP1与ACBP2具有76.9％的氨基酸同一性。高度保守(81.4％同一性)的ACBP4和ACBP5都含有C末端的kelch基序。锚蛋白重复序列和kelch基序是能够潜在地介导蛋白-蛋白相互作用的区域，这表明这些拟南芥ACBPs能够与蛋白配偶体发生作用(Leung等，Plant Mol.Biol.55：297-309，2004)。

因此，根据结构域的存在，拟南芥ACBP家族可以被分为四类：(1)92个氨基酸的较小10kDa的ACBP6；(2)含有N末端膜结合结构域和C末端锚蛋白重复序列的ACBP1(338个氨基酸)和ACBP2(354个氨基酸)；(3)362个氨基酸的ACBP3；以及(4)含有kelch基序(motif)的较大ACBP4(668个氨基酸)和ACBP5(648个氨基酸)。为了研究每一个酰基辅酶A结合结构域在结合酰基辅酶A酯中的重要性，以重组(His)-标记蛋白形式在大肠杆菌中表达拟南芥ACBPs用于进行体外结合分析，并且在酰基辅酶A结合结构域中对结合所必需的氨基酸残基通过点突变将其鉴定出来(Chye等，Plant Mol.Biol.44：711-721，2000；Leung等，Plant Mol.Biol.55：297-309，2004；Leung等，Planta 223：871-881，2006)。拟南芥ACBPs对不同酰基辅酶A酯的不同结合亲和力表明它们可能有着不同的细胞功能。

因为转化植物中表达植物来源的基因可能通常更容易被公众所接受，所以我们在此提供了一种通过在转化植物中表达或过表达源自植物的酰基辅酶A结合蛋白(ACBPs)对铅及其它金属进行植物修复的方法。

发明内容

本发明的一个方面是基于如下发现：表达酰基辅酶A结合蛋白(acyl-CoA-binding proteins(ACBP))的基因修饰植物及其后代能够被应用于对例如铅(Pb(II))的重金属的植物修复。本发明提供的是含有编码ACBP的核酸序列的植物转化载体，这些载体可以通过细胞核转化或者质体转化用于产生基因转化的植物。由此产生的过表达ACBPs的植物，本文以拟南芥ACBPs示例，被赋予了在含有重金属污染物，例如铅、铜和镉的环境中生长的能力。这些植物可以吸收这些金属并将它们储存于植物的组织内，因此，它们可以用于铅及其它金属的植物修复。

因为拟南芥的所有六个酰基辅酶A结合蛋白(ACBPs)都能够结合重金属铅以及其它以二价阳离子存在的金属污染物(例如铜和镉)，因此过量表达这些ACBPs的基因转化植物在生长中将从环境中吸收这些污染物。随后，这些植物可以被收获，这样就去除了污染。在特定的实施方案中，介绍了使用植物转化载体产生过量表达拟南芥ACBPs的转基因植物。

本发明的另一个方面提供了含有编码ACBP多肽的片段、衍生物、类似物或者变体的多核苷酸的植物转化载体。在特定的实施方案中，本发明提供了转化植物，例如转基因拟南芥和转质体(transplastomic)的烟草植物。本发明提供了含有ACBP多肽、或其具有与ACBP多肽类似活性的片段、衍生物、类似物或变体的修饰植物。本发明还提供了产生该修饰植物的方法，包括用含有至少一个编码ACBP的多核苷酸，或其片段、衍生物、类似物或变体的质体和/或核转化载体转化植物。

在另一个特定的实施方案中，植物转化载体被工程化以生产植物，该植物能够用于植物修复源自污染土壤/水环境中的重金属，特别是以二价阳离子存在的重金属例如铅。本发明的一个方面涉及通过种植拟南芥测试植物并检测铅Pb(II)(通过观察编码ACBP1至ACBP5的mRNAs的mRNA诱导来检测铅)来检测样品中铅(Pb(II))的方法。样品可以是来自环境中的液体或固体(例如土壤)。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了含有至少一个编码ACBP、或编码ACBP的片段、衍生物、类似物、或变体的多核苷酸的质体转化载体。在另一个具体实施方案中，本发明提供了含有至少一个编码ACBP、或编码ACBP的片段、衍生物、类似物、或变体的多核苷酸的核转化载体。在另一个实施方案中，本发明提供了表达至少一个ACBP多肽、或其具有与ACBP多肽类似铅结合活性的片段、衍生物、类似物、或变体的核转化载体。在一个特定的实施方案中，本发明提供了通过示例性核转化载体pAT31和pAT314产生转基因植物的方法。

含有包括编码具有ACBP活性的多肽的多核苷酸的载体的植物细胞也是本发明的一个方面。本发明提供了含有表达ACBP多肽、其衍生物、类似物、或其变体的细胞的修饰植物的植物部分，例如果实，叶子，块茎，种子，花，茎或根。所述植物部分包括从完整植物上分离的或相连于完整植物上的部分。

在特定的实施方案中，核转化载体用于引起一种或多种ACBPs的表达，包括ACBP多肽、或其与拟南芥ACBP多肽具有类似铅结合活性的片段、衍生物、类似物、或变体。在特定的实施方案中，质体转化载体用于引起一种或多种ACBPs的表达，包括ACBP多肽、或其与拟南芥ACBP多肽具有类似铅结合活性的片段、衍生物、类似物、或变体。在一个特定的实施方案中，本发明提供了通过示范性的质体转化载体pAT385产生转基因植物的方法。在特定的实施方案中，质体转化载体和核转化载体用于表达一种或多种ACBPs，包括ACBP多肽、或其与ACBP多肽具有类似铅结合活性的片段、衍生物、类似物、或变体。这些核和质体转化载体可以单独使用或者与其它能够增强用其转化的植物的植物修复能力的重组载体联合使用。

本发明提供了在植物中产生ACBPs、或其具有与ACBP多肽类似铅结合活性的片段、衍生物、类似物、或变体的方法。所述方法包括用含编码一个或多个ACBP多肽的多核苷酸的载体转化植物。此载体也可以任选地包括与编码序列可操作连接的启动子和终止子以及其它调控元件。此载体也可被设计以引入异源多肽，这样其表达将受控于植物自己的内源启动子，例如Hahn和Kuehnle教导的假基因技术(US2003-003362641)。可选择的，或额外的，载体可以包含与编码ACBP的多核苷酸可操作地连接的组成型和/或诱导型和/或组织特异性的启动子。包含载体的植物细胞也是本发明的一个方面，其中载体包含一个或多个核酸序列，该核酸序列编码ACBPs，包括多肽或其与ACBP多肽具有类似铅结合活性的片段、衍生物、类似物、或变体。可选择地，植物细胞可以包含本发明的一个或多个载体。每个载体也可以包含编码一个具有ACBP铅结合活性多肽的外源序列，或者任选地可以包含编码多于一个该ACBP多肽的操纵子。本发明提供了植物部分，例如修饰植物的果实、叶片、块茎、种子、花、茎、根和所有其它的解剖部分。

因为从拟南芥中分离天然形式的ACBPs更难实现和更难于大量积累用于体外分析，所以首先测试了拟南芥ACBP蛋白的铅结合，使用了大肠杆菌表达的重组His-标记蛋白，以达到高产量，并辅助纯化组氨酸标记的ACBPs用于体外铅结合分析。随后，我们证明体外翻译的ACBP2也结合铜与镉，因此期望在这里所述的ACBPs不仅用于结合铅、铜和镉，还可以结合其它二价阳离子形式的金属。

在使用铅结合分析证明所有六个拟南芥ACBPs能够结合铅的基础上，我们进一步研究在转基因植物中过量表达ACBP是否赋予对植物生长培养基中的铅的耐受性。构建包含编码ACBPs的核酸的质体构建体用于植物转化。随后，我们比较了过量表达ACBP的转基因株系和野生型拟南芥的生长。在含有铅的培养基中，过量表达ACBP的株系比野生型生长得更好，这表明ACBP赋予结合铅和耐受生长环境中铅存在的能力。在转化植物中引入ACBP转基因提供了植物对生长环境中铅胁迫更高的耐受性。

为了确定这些过量表达ACBP的植物可以植物修复环境中的铅，测定了这些植物的枝条与根中铅的浓度，并与在含铅的培养基上生长的野生型进行了比较。结果证明过量表达ACBP的植物在枝条(shoots)中聚集铅，因此表明它们可以对环境中的铅进行植物修复，并且期望它们也能够对环境中的其它二价阳离子金属进行植物修复。

附图说明

图1显示根中拟南芥ACBP(ACBP1-5而非ACBP6)转录物的铅Pb(II)-诱导的增加的反转录聚合酶链式反应分析(RT-PCR)。在存在(+)或不存在(-)1mM Pb(NO₃)₂处理的情况下，从连续光照24小时的3周大Col-0拟南芥幼苗的根中提取总RNA。使用18SrDNA的转录物用作加样对照(图底部)。

用于ACBP6的RT-PCR分析的引物是ML750(SEQ ID NO：1)和ML751(SEQ ID NO：2)；ACBP1，ML179(SEQ ID NO：3)和ML759(SEQ ID NO：4)；ACBP2，ML194(SEQ ID NO：5)和ML205(SEQ ID NO：6)；ACBP3，ML783(SEQ ID NO：7)和ML784(SEQ ID NO：8)；ACBP4，ML849(SEQID NO：9)和ML850(SEQ ID NO：10)；ACBP5，ML352(SEQ ID NO：11)和ML353(SEQ ID NO：12)；18S，18S-F(SEQ ID NO：13)和18S-R(SEQ IDNO：14)。

图2A-2D比较了(His)₆-ACBPs和体外翻译的ACBPs对Pb(II)、Cd(II)和Cu(II)的结合。(A)荧光分析下的(His)₆-ACBPs与Pb(II)的结合。丹酰化的(His)₆-ACBP在缺少和存在不同浓度(1，2，3，4，5，7和9μM)的Pb(II)及在激发波长是360/40nm和发射波长是530/25nm下测定荧光强度。在减去自身的空白后得到每一个ACBP的相对荧光。相对荧光的最高值被设定为1，其它荧光值与最高值比较之后得到相对荧光百分比。每一点表示的是三次独立试验的平均值和标准误差。柱代表SE(n＝3)。(B)用金属螯合亲和层析法测定的体外翻译ACBPs与Pb(II)的结合。左板(Input)显示等量的加入了[³⁵S]甲硫氨酸标记的ACBP1，ACBP2，ACBP6蛋白。右板显示了放射标记的蛋白与Pb(II)的体外结合。Pb(II)平衡基质与[³⁵S]甲硫氨酸标记的蛋白培养后，洗三次，用2％SDS，50mM DTT溶液提取前用咪唑洗提缓冲液洗脱。洗脱下的蛋白放射自显影后用SDS-PAGE分析。(C)用金属螯合亲和层析测定的体外翻译的ACBPs与Pb(II)、Cd(II)和Cu(II)的结合。左面第一板(Input)显示等量加入了[³⁵S]甲硫氨酸标记的ACBP2和ACBP6。相邻板显示了所示放射标记的蛋白与重金属的体外结合。Pb(II)、Cd(II)或Cu(II)平衡基质与[³⁵S]甲硫氨酸标记的蛋白培养后，洗三次，用2％SDS，50mM DTT溶液提取前用咪唑洗提缓冲液洗脱结合的蛋白。洗脱下的蛋白放射自显影前用SDS-PAGE分析。ACBP2与Pb(II)、Cd(II)和Cu(II)的结合可以被金属螫合剂乙二胺四乙酸(EDTA，终浓度50mM)抑制，这表明其结合依赖于二价阳离子。(D)拟南芥ACBPs的酰基辅酶A结合域的比较。点表示与ACBP6一致。“Con”(Conserved，保守的)，代表拟南芥ACBPs中高度保守的氨基酸残基。所有拟南芥ACBPs(ACBP1-6)显示了在13个氨基酸残基(图2D的“Con”序列中用星号标记)上的100％保守。在酰基辅酶A结合域中，10个其它氨基酸残基(图2D的“Con”序列中用下划线标记的氨基酸)在ACBP1-5中保守，但是不在ACBP6中保守。这10个氨基酸残基(“Con”中下划线标记的氨基酸)当中，在9kDa人类ACBP(GenBank登记号码为NM_020548)中进一步保守的三个氨基酸残基被用圆圈标记；在人类ACBP以及ACBP1-5中保守的这三个氨基酸残基可能在结合Pb(II)中起到重要的作用。在“Con”下面，显示了在ACBPs中相同的“Com”(Common，共有)氨基酸。“Com”列出了在ACBP1-5中的酰基辅酶A结合域内的氨基酸，它们在这五个ACBPs(ACBP1-5)中的至少两个中是相同的(common)。在两个或者更多ACBPs内有两个不同的残基出现的位置，两个残基都被显示，其中一个被放于另一个的下面。

图3A-3B显示植物转化载体pAT31(35S::ACBP1)和pAT314(35S::ACBP3-GFP)的构建。(A)质粒pAT31中35S：ACBP1构建体，在这里ACBP1cDNA通过花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子表达。ACBP1全长cDNA被克隆到二元载体pBI121(Clontech)的SmaI位点。此pBI121衍生物被用于建立过量表达ACBP1的拟南芥植株。(B)质粒pAT314中35S：ACBP3-GFP构建体。ACBP3全长cDNA被克隆到二元载体pBI-GFP的BamHI位点，pBI-GFP是通过用eGFP基因替换掉pBI121中的GUS基因而得到的pBI121的衍生物(Shi等，Plant Cell 17：2340-2354，2005)。ACBP3与GFP移位融合(translationallyfused)，并由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子表达。用于对转化植物进行基因分型的引物35SB(SEQ ID NO：15)位于CaMV35S启动子区域内部。

图4A-4E显示过量表达ACBP1的拟南芥植物以及它们对Pb(II)胁迫改进的耐受性的分析。(A)使用ACBP1 cDNA探针对野生型拟南芥(Col-0)和3个独立的过量表达ACBP1的拟南芥转基因株系ACBP1 ox-2，ox-3和ox-5中ACBP1转录物水平的RNA胶印迹分析。在印迹下面的用溴化乙锭染色的rRNA显示加样的总RNA的相对量。(B)使用ACBP1特异性抗体对野生型拟南芥(Col-0)和过量表达ACBP1的拟南芥转基因株系ACBP1 ox-3和ACBP1 ox-5中ACBP1蛋白水平的Western印迹分析(Chye，Plant Mol.Biol.38：827-838，1998)。底部，考马斯亮蓝染色的等量加样的胶显示了RuBisCO大亚基(星号)的54kDa的条带。(C)在MS培养基和含有0.75mM Pb(NO₃)₂的MS培养基中生长的两周的野生型(Col-0)，ACBP1 ox-3和ACBP1 ox-5幼苗的表型。(D)图4C中显示在含有0.75mM Pb(NO₃)₂的MS培养基中生长的拟南芥植物相对根长的比较。柱(bars)代表SE(n＝10)。由Student’s t检验得^*P＜0.05。(E)图4C中显示在含有0.75mM Pb(NO₃)₂的MS培养基中生长的拟南芥植物枝条和根的相对鲜重的比较。柱代表SE(n＝10)。根长与鲜重被表达为获自生长在MS培养基(100％)的幼苗的相对值。^*Student’s t检验得^*P＜0.05。

图5A-5E显示过量表达ACBP3的拟南芥植物以及它们对Pb(II)处理的增强耐受性的分析。(A)野生型拟南芥(Col-0)和3个独立的过量表达ACBP3的拟南芥转基因株系ACBP3 ox-2，ox-9和ox-11中ACBP3-GFP转录物水平的RNA胶印迹分析。在印迹下面用溴化乙锭染色的rRNA显示了加样的总RNA的相对量。(B)使用GFP特异性抗体对野生型拟南芥(Col-0)和过量表达ACBP3的拟南芥转基因株系ACBP3 ox-2，ACBP3 ox-9和ACBP3 ox-11中ACBP3-GFP融合蛋白水平的Western印迹分析。底部，考马斯蓝染色的等量加样的胶显示了54kDa的RuBisCO大亚基(星号)的条带。(C)生长在MS培养基和含0.75mMPb(NO₃)₂的MS培养基中的三周龄的野生型(Col-0)和转基因(ACBP3 ox-2，ACBP3 ox-9和ACBP3 ox-11)幼苗。(D)图5C中显示的生长在含和不含Pb(II)的MS培养基中的植物根长分析。(E)图5C中显示的生长在含和不含Pb(II)的MS培养基中的植物鲜重分析。柱代表SE(n＞10)。Student’st检验得^*P＜0.05。

图6A和6B显示野生型拟南芥(Col-0)和转基因拟南芥ACBP1 ox-3和ACBP1 ox-5中Pb(II)的含量。拟南芥植物在MS培养基上生长2到3周后被转移到1mM Pb(NO₃)₂溶液中48h。分别收集枝条和根用于Pb(II)含量测定。样品用11N HNO₃在200℃消化过夜。在依据Lee等的描述(Plant Physiol.138：827-836，2005)用0.5N HNO₃稀释后，样品用原子吸收光谱(PERKIN ELMER-AASpectrometer 3110)进行分析。每一个植物株系，测定六个重复，每一个重复含有5株植物。Pb(II)含量以每株植物(图6A)或每个鲜重(图6B)为基础标准化，ACBP1 ox-3和ACBP1 ox-5与野生型之间的显著性差异用Student’s t检验确定(^*P＜0.05，^**P＜0.001)。柱代表SE(n＝30)。

图7A和7B显示野生型拟南芥(Col-0)和拟南芥转基因株系ACBP3 ox-11中Pb(II)含量的比较。每一个植物株系，测定六个重复，每一个重复含有5株植物。Pb(II)含量以每株植物(图7A)或每个鲜重(图7B)为基础标准化。ACBP3ox-11与野生型之间的显著性差异用Student’s t检验确定(^*P＜0.05)。柱代表SE(n＝30)。

图8显示质体转化载体pAT385的限制性图谱。以ML916(SEQ ID NO：16)和ML917(SEQ ID NO：17)为引物对通过RT-PCR产生了1.1kb ACBP1 cDNA片断，然后将其克隆到pGEM-T EASY载体(Promega)。然后经限制性内切酶ApaI和SacI酶切后获得ACBP1片断，然后将其插入到质体转化载体(plastidtransformation vector)pMLV-HisA(图8A；Li等Exp.Biol.Med.231：1346-1352，2006)的ApaI-SacI位点生成pAT385(图8B)。rbcLT，编码叶绿体RuBisCO大亚基的烟草基因；psbARPro，光系统(PSII)反应中心的除草剂结合D1蛋白的水稻启动子；psbARTer，光系统(PSII)反应中心的除草剂结合D1蛋白的烟草终止子；rrnRPro，rRNA操纵子的水稻启动子；aadA，氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶(aminoglycoside 3’-adenylyltransferase)；rbcLRTer，叶绿体RuBisCO大亚基的水稻终止子；accDT，编码叶绿体乙酰辅酶A羧化酶亚基的烟草基因。

图9A-9D显示质体转化以及用质粒pAT385转化的烟草的鉴定。(A)轰击一个月后，质体转化烟草后在含有500mg/l奇霉素二盐酸化物的诱导枝条培养基(RMOP培养基)中枝条的再生。(B)在含有500mg/l奇霉素的MS培养基中培养了一个月的生长了根的转质体烟草(Transplastomic tobacco)。(C)显示pAT385驱动的DNA通过同源重组整合进入烟草叶绿体基因组的示意图。在质体转化后，使用PCR扩增所用的引物ML347(SEQ ID NO：18)、ML916(SEQID NO：16)、ML917(SEQ ID NO：17)检测重组DNA的插入物。(D)pAT385转质体株系的PCR分析。使用引物对ML347/ML917和ML916/ML917扩增从野生型(图9D，泳道1)，pMLV-HisA株系(图9D，泳道2)以及pAT385转质体株系(图9D，泳道3)中提取的总DNA样品。从pAT385转质体株系中得到了预期的1.3kb和1.1kb的条带。

序列简述

SEQ ID N0：15’-ATATGGATCCCACGCGTTGTCCTCGTCTTCT-3’

SEQ ID NO：25’-AATATATCATCTTGAATTCAACTG-3’

SEQ ID NO：35’-CGGGATCCGAAAATGTCAATCTTTGGTTTGATCTTCGC-3’

SEQ ID NO：45’-GTCTACAATTGGAATCCTTCTTCTC-3’

SEQ ID NO：55’-TCAAGGGGAGAGTTTCC-3’

SEQ ID NO：65’-CGTCACCCAGAGGAGTC-3’

SEQ ID NO：75’-CTCTCGAGATGGTGGAGAACGATTTGAGT-3’

SEQ ID NO：85’-ACGAGCTCACATCATACTCTTAGGGAATACCA-3’

SEQ ID NO：95’-AGCTCGAGATGGCTATGCCTAGGGCAAC-3’

SEQ ID NO：105’-CGGAGCTCAATGGCATTACCGGACCAAA-3’

SEQ ID NO：115’-CGGATCCAATGGCTCACATGGTGAGAGCAG-3’

SEQ ID NO：125’-CGAATTCTCATGGGCACTCATGTTTTAGGC-3’

SEQ ID NO：135’-GCTCGAAGACGATCAGATACC-3’

SEQ ID NO：145’-AGAAAGAGCTCTCAGCTCGTC-3’

SEQ ID NO：155’-CAATCCCACTATCCTTCGCAAGACC-3’

SEQ ID NO：165’-TGGGGCCCATGGCTGATTGGTATCAGC-3’

SEQ ID NO：175’-GCATCGATCTTTGACACACAATTTTAAAG-3’

SEQ ID NO：185’-CACACAAATCGGTAGAGCTTAT-3’

SEQ ID NO：19 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly

Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Arg Trp Ile Arg Pro Arg Asp Leu

Gln Leu Val Pro Trp Asn Ser Arg

SEQ ID NO：205’-CGGGATCCGAAAATGTCGCTAATCTCTATCCTCCTCG-3’

SEQ ID NO：215’-ATGGGTGATTGGGCTCAACT-3’

SEQ ID NO：225’-TTAGTCTGCCTGCTTTGCAG-3’

SEQ ID NO：235’-TTCTCCGTCTTACACCGATT-3’

SEQ ID NO：245’-CTTGATGAGGCATTTAGTGC-3’

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发明详述

本文所用的术语“修饰的植物或植物部分”指植物或植物部分，无论其与完整植物相连还是分离。它还包括通过有性或无性繁殖产生的所述修饰植物或植物部分的后代。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文可互相转换使用，是指任何长度的核苷酸，核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸的聚合形式。因此，此术语包括但不局限于单链、双链或者多链的DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体、或者包含嘌呤和嘧啶碱基、或者其它天然的、化学或生化修饰的、非天然的、或者衍生的核苷酸碱基的聚合物。

本文所用的术语“操纵子”和“单一转录单元”在本文可互相转换使用，是指一个或多个控制元件(例如启动子)协同调节的两个或者更多连续编码区域(编码基因产物，例如RNA或蛋白的核苷酸序列)。本文所用的术语“基因产物”指由DNA编码的RNA(反之亦然)或由RNA或DNA编码的蛋白，其中基因通常包含编码蛋白的一个或多个核苷酸序列，并且也可能包括内含子和其它非编码的核苷酸序列。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文可互相转换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合形式，可包括编码的和非编码的氨基酸，化学或生化修饰或衍生的氨基酸，以及含有修饰肽骨架的多肽。

本文所用的术语“天然存在的”当用于核酸、细胞或生物时，指在自然界中被发现的核酸、细胞或生物。例如，可以从自然界的来源中分离的，没有在实验室里被人为修饰的，存在于生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列，是自然存在的。

本文所用的术语“异源核酸”指以下至少一处是正确的核酸：(a)这个核酸对于给定的宿主微生物或宿主细胞而言是外来的(“外源的”，也就是说在其中没有天然发现)；(b)这个核酸包含在给定的(例如“内源于”)宿主微生物或宿主细胞中发现的核苷酸序列(例如这个核酸包含内源于宿主微生物或宿主细胞的核苷酸序列)，然而，在异源核酸的上下文中，与内源发现的相同的核苷酸序列在细胞中以非天然的数量(例如比预期的多或者比自然发现的要多)产生，或者包含了与内源核苷酸序列在序列上不同但编码的蛋白与内源发现的蛋白相同(有相同或基本相同的氨基酸序列)的核苷酸序列的核酸在细胞中以非天然的数量(例如比预期的或者自然发现的要多)产生；(c)这个核酸包含了两个或更多不以在自然中相同的相互关系存在的核苷酸序列，例如这个核酸是重组的。异源核酸的一个例子是编码ACBP的核苷酸序列，其可操作地连接到内源(自然存在)ACBP编码序列正常不会与之可操作连接的转录控制元件(例如，启动子)。异源核酸的另一个例子是包含编码ACBP的核苷酸序列的高拷贝数质粒。异源核酸的另一个例子是编码ACBP的核酸序列，其中用编码ACBP的核酸遗传修饰正常不会生成ACBP的宿主细胞；因为编码ACBP的核酸在宿主细胞中不是自然发现的，因此这个核酸对于遗传修饰了的宿主细胞是异源的。

本文所用的术语“重组”指特定的核酸(DNA或者RNA)是克隆、限制和/或连接步骤的各种组合的产物，产生了具有与在天然系统中发现的内源核酸不同的结构性编码或非编码序列的构建体。通常，编码结构编码序列的DNA序列可以由cDNA片段和短的寡核苷酸接头或者一系列合成的寡核苷酸组装以提供能够由包含于细胞或者无细胞的转录和翻译系统的重组转录单元表达的合成核酸。这样的序列可以不被内部非翻译序列或内含子打断的开放读码框形式提供，内含子一般存在于真核基因中。包含这些相关序列的基因组DNA也可以用于形成重组基因或者转录单元。非翻译的DNA序列可能存在于开放读码框的5’末端或3’末端，在那里，这些序列不干扰编码区的操作或表达，并且可能通过不同的机制(请见下面时“DNA调节序列”)作用以调节所需产物的生产。

因此，例如，术语“重组”多核苷酸或核酸是指一种不是自然存在的，例如通过人的干扰人工地组合两个本来分开的序列节段从而产生的多核苷酸或核酸。这个人工重组经常通过化学合成的方法，或者通过对分离的核酸节段进行人工操作，例如基因工程技术而实现。经常进行这种操作以使用编码相同或保守氨基酸的冗余密码子代替一个密码子，同时典型地引入或去除序列识别位点。可选择的，也可以进行这种操作以将具有所需功能的核酸节段连接起来生成所需功能的组合。该人工组合经常通过化学合成的方法，或者通过对分离的核酸节段进行人工操作，例如基因工程技术而得以实现。

术语“构建体”指重组的核酸，通常是重组DNA，其产生是为了表达特定的核苷酸序列，或者是用于构建其它重组核苷酸序列。

本文所用的术语“外源核酸”指不会常规或自然地在给定细菌、生物体或细胞中天然发现和/或产生的核酸。本文所用的术语“内源核酸”指通常在给定的细菌、生物体或细胞中天然发现和/或产生的核酸。“内源核酸”也指作为“天然的核酸”或者对于给定细菌、生物体或细胞是“天然的”核酸。例如，在实施例3中编码ACBPs的核酸代表对于大肠杆菌的外源核酸。这些核酸是从拟南芥中克隆到的。在拟南芥中，位于染色体上它们的天然位置的编码那些ACBPs的基因序列是“内源”核酸。

术语“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”在本文可互相转换使用，是指在宿主细胞中提供和/或调节编码序列表达和/或编码的多肽产生的转录和翻译控制序列，例如启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号等。

在本文术语“转化”或“转化的”可与“遗传修饰”或“遗传修饰的”互相转换使用，是指在导入新的核酸(也就是说外源于细胞的DNA)后，在细胞内诱导产生的永久或瞬时的基因改变。基因改变(“修饰”)可通过将新DNA并入宿主细胞的基因组或者瞬时或稳定地作为游离元件保持新DNA而实现。当细胞是真核细胞时，永久的基因改变通常通过将新DNA并入宿主细胞的基因组而实现。在原核细胞中，永久的改变可以引入到染色体中或通过染色体外元件引入，例如质粒或表达载体，它们可以包含一个或多个帮助它们在重组宿主细胞中保持的选择性标记。

“可操作地连接”是指并列，其中所描述的成分处于允许它们以预期的方式行使功能的关系。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么这个启动子就是可操作地连接到编码序列。本文所用的术语“异源启动子”和“异源控制区”是指在一般不与自然中特定的核酸序列相关联的启动子和其它控制区。例如，“异源于编码区的转录控制区”是在自然中通常不与编码区相结合的转录控制区。

本文所用的术语“宿主细胞”指在体内或者体外的真核细胞、原核细胞或者作为单细胞实体培养的来源于多细胞生物(例如细胞株系)的细胞，这些真核或原核细胞可以被或已经被作为核酸(例如，包含编码一个或多个基因产物如ACBPs的核苷酸序列的表达载体)的接受体，且包括已经被该核酸基因修饰的原始细胞的后代。可以理解，由于天然的、偶然的或故意的突变，一个单细胞的后代在形态、基因组或总DNA互补等方面可能并不一定与起始亲代完全相同。“重组宿主细胞”(也称为“基因修饰的宿主细胞”)是指已经引进异源核酸、如表达载体的宿主细胞。例如，通过在合适的原核宿主细胞中引进异源核酸，例如外源于(在自然中一般不会被发现的)原核宿主细胞的外源核酸或者在原核宿主细胞中一般不会被发现的重组核酸，使得主题原核宿主细胞(a subjectprokaryotic host cell)成为遗传修饰的原核宿主细胞(例如细菌)；通过在合适的真核宿主细胞中引进异源核酸，例如外源于该真核宿主细胞的外源核酸或者在真核宿主细胞中一般不会被发现的重组核酸，使得主题真核宿主细胞成为遗传修饰的真核宿主细胞。

本文所用的术语“分离的”用于描述存在于不同于其天然发生的环境中的核酸、多肽或细胞。一个分离的遗传修饰的宿主细胞可能存在于遗传修饰的宿主细胞的混合群体中。

可以制备表达盒，包含转录起始或转录控制区(例如启动子)，目的蛋白的编码区以及转录终止区。转录控制区包含在遗传修饰的宿主细胞中提供目的蛋白过量表达的那些区域；以及提供可诱导表达的区域，从而当在培养基中加入诱导试剂时，目的蛋白的编码区的转录被诱导或被提高到比诱导前更高的水平。

当单链形式的核酸在适当的温度和溶液离子强度条件下能够与其它的核酸退火时，这个核酸与另一个核酸例如cDNA，基因组DNA或RNA是“可杂交的”。杂交和洗涤条件是众所周知的，例如参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor(1989)，特别其中的章节11和表格11.1；以及Sambrook，J.和Russell，W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ThirdEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(2001)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格度”。严格度条件可以被调节用以筛选中等相似片段，例如来源于种间距离较远的生物体的同源序列，到高度相似片段，例如来源于种间距离较近的生物体的复制功能性酶的基因。杂交条件和杂交后的洗涤对于获得预期的杂交严格度条件是有用的。一套示例性杂交后洗涤是一系列的洗涤，从用6x SSC(SSC是0.15M氯化钠和15mM柠檬酸盐缓冲溶液)，0.5％SDS于室温下洗涤15分钟开始，接着用2x SSC，0.5％SDS在45℃下重复30分钟，接着用0.2x SSC，0.5％SDS在50℃下重复两次，每次30分钟。其它严格条件通过使用更高的温度而获得，在这种条件下，除了用0.2x SSC，0.5％SDS进行的最后两个30分钟洗涤的温度提高到了60℃外，其它条件与上面相同。另一套高严格条件用0.1x SSC，0.1％SDS在65℃下洗涤两次。另一个严格杂交条件的例子是在50℃或更高温度下，在0.1x SSC(15mM氯化钠/1.5M柠檬酸钠)中进行杂交。另一个严格杂交条件的例子是在含有50％甲酰胺，5xSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt′s溶液、10％硫酸右旋糖苷、20μg/ml变性平端鲑鱼精子DNA的溶液中在42℃孵育过夜，接着在0.1x SSC中在约65℃洗涤滤器。严格杂交条件和杂交后洗涤条件是和上面表示的条件至少同样严格的杂交条件和杂交后洗涤条件。

杂交要求两个核酸含有互补序列，尽管依赖于杂交的严格度，但是碱基间的错配是可能的。核酸杂交的适合严格度决定于核酸的长度和互补的程度，这是众所周知的变量。两个核酸序列之间的相似度或同源性越高，含有这些序列的核酸的杂交体的熔化温度(Tm)越高。核酸杂交的相对稳定性(对应更高的Tm)依照下面的顺序下降：RNA：RNA，DNA：RNA，DNA：DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已经有计算Tm的公式(参照Sambrook等，同上，9.50 9.51)。对于长度更短核酸的杂交，也就是寡核苷酸，错配的位置变得更加重要，并且寡核苷酸的长度决定了它的特异性(参照Sambrook等，同上，11.7 11.8)。通常，可杂交核酸的长度至少是10个核苷酸。例举的可杂交核酸的最小长度是：至少约15个核苷酸，至少约20个核苷酸和至少约30个核苷酸。并且，熟练的技术人员将认识到必要时可以根据如探针的长度的一些因素调整温度和洗涤溶液盐浓度。

术语“保守氨基酸置换”指蛋白中含有相似侧链的氨基酸残基的可置换性。例如，含有脂肪族侧链的氨基酸组由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸构成；含有脂肪族羟基侧链的氨基酸组由丝氨酸和苏氨酸构成；具有含酰胺侧链的氨基酸由天冬酰胺和谷氨酰胺构成；含有芳香族侧链的氨基酸组由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸构成；含有碱性侧链的氨基酸组由赖氨酸、精氨酸和组氨酸构成；以及含有含硫侧链的氨基酸组由半胱氨酸和甲硫氨酸构成。例举的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。

“合成核酸”可以由用本领域技术人员公知的方法化学合成的寡核苷酸构建块装配。这些构建块被连接和退火形成基因片段，然后酶促组装以构建完整基因。涉及DNA序列的“化学合成”是指组成核苷酸是体外装配。可通过建立好的方法完成DNA的手工化学合成，或者使用一些商业可得机器中的一种进行DNA的自动化学合成。根据优化核苷酸序列以反映宿主细胞密码子偏爱的原则可以修饰核酸的核苷酸序列以获得最佳的表达。如果密码子的使用偏向于宿主喜爱的密码子，那么熟练的技术人员将知道成功表达的可能性。优选密码子的确定可依据源自宿主细胞的基因的考察，宿主细胞的序列信息是可获得的。全长蛋白的片段可由众所周知的技术制备，这些技术例如创建编码所需部分的合成核酸；或者使用Bal 31核酸外切酶制备较长核酸的片段。

多核苷酸或多肽与另一个多核苷酸或多肽有一定百分比的“序列同一性”，这是指当比较这两个序列并对准时，在相同的相对位置上相同碱基或氨基酸所占的百分数。有许多不同的方式用于确定序列的相似性。为确定序列同一性，可用包括可在互联网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上得到的BLAST等方法和计算机程序对序列进行排列，参照例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。另一个排列算法是FASTA，可以从来源于美国威斯康星麦迪逊的GeneticsComputing Group(GCG)包中得到，它是Oxford Molecular Group，Inc.完全拥有的附属物。其它的排列技术在Methods in Enzymology，vol.266中有所描述：Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996)，ed.Doolittle，Academic Press，Inc.，a division of Harcourt Brace&Co.，San Diego，Calif.，USA。特别感兴趣的是那些允许序列中的缺口存在的排列程序。Smith-Waterman是一种允许在序列排列中出现缺口的排列程序。参见Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)。另外，使用Needleman和Wunsch排列方法的GAP程序也可被用于排列序列。参见J.Mol.Biol.48：443-453(1970)。

本文所用的术语“变体”指自然存在的ACBP的遗传突变体或重组制备的ACBP变异体，其中每一个含有一个或多个DNA突变。术语“变体”还指给定多肽的自然存在的变异体，或给定多肽或蛋白质的重组制备的变异体，其中一个或多个氨基酸残基通过氨基酸的取代，添加，或缺失而被修饰。优选所述变体包括相对于所述拟南芥ACBPs少于25个，少于20个，少于15个，少于10个，少于5个，少于4个，少于3个，或少于2个氨基酸的取代，重排，插入，和/或缺失。在这方面，术语“变体”可包括拟南芥ACBPs的片段、衍生物和类似物。

为了产生主题遗传修饰的宿主细胞，使用已成熟的技术，包括但不局限于电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖苷介导的转染、脂质体介导的转染、粒子轰击等方法，将一个或多个核酸稳定或暂时转入亲本宿主细胞，其中所述核酸包含编码一个或多个可以减轻铅富集诱导的生长抑制的ACBP多肽的核苷酸序列。对稳定的转化而言，核酸通常还需要含有选择标记，例如几个众所周知的选择标记，如新霉素抗性、氨苄青霉素抗性、四环素抗性、氯霉素抗性、卡那霉素抗性等之一。

当亲本宿主细胞被遗传修饰以产生两个或多个ACBPs时，编码两个或多个ACBPs的每一个核苷酸序列在一些实施方案中可以位于分开的表达载体上。在遗传修饰宿主细胞以产生一个或多个ACBPs时，编码一个或多个ACBPs的核苷酸序列在一些实施方案可以位于单个表达载体上。在一些实施方案中，编码一个或多个ACBPs的核苷酸序列包含在单个表达载体中，该核苷酸序列将可操作地连接于共同的控制元件(例如启动子)上，因此这个共同的控制元件控制该单个表达载体中所有ACBP编码核苷酸序列的表达。

在一些实施方案中，编码ACBP的核苷酸序列包含在单个表达载体中，该核苷酸序列将可操作地连接于不同的控制元件(例如启动子)，因此不同的控制元件控制该单个表达载体中每一个ACBP编码核苷酸序列的表达。

主题筛选方法可以包括导入外源核酸进入宿主细胞以产生测试细胞，其中当铅(或者另一个二价阳离子金属，例如铜或镉等)以生长抑制量存在于生长培养基中时，宿主细胞表现出生长抑制。当包含编码ACBP的核苷酸序列的外源核酸导入宿主细胞时，测试细胞的生长抑制被减轻。因此，生长抑制的减轻表明外源核酸编码ACBP，其中编码的ACBP以一定水平产生和/或者具有减轻铅聚集诱导的生长抑制的活性。生长抑制的减轻包括至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或者更多的生长抑制的减轻。在一些实施方案中，外源核酸编码的ACBP减轻了生长抑制，这样，细胞的生长速度还原到了没有生长抑制量的铅存在的条件下生长的宿主细胞的细胞生长速度。

在一些实施方案中，例如外源核酸是多个外源核酸(例如cDNA文库、基因组文库、或每个编码具有不同氨基酸序列的ACBP的核酸的群体，等)，这些外源核酸导入到多个宿主细胞，形成多个测试细胞。在一些实施方案中，这些测试细胞在铅以生长抑制和/或死亡诱导量存在的培养条件下生长；那些包含有编码ACBP的核苷酸序列的外源核酸的测试细胞比不包含含有编码ACBP的核苷酸序列的外源核酸的测试细胞生长的快，或者那些包含含有编码ACBP的核苷酸序列的外源核酸的测试细胞将生存，然而不包含含有编码ACBP的核苷酸序列的外源核酸的测试细胞将死亡或受到不利地影响。

在一些实施方案中，方法进一步包括从测试细胞中分离外源核酸，其中外源核酸在主题筛选方法中减轻生长抑制。从测试细胞中分离外源核酸的方法是众所周知的。适用的方法包括但并不局限于该领域标准的许多碱裂解法。

在一些实施方案中，主题筛选方法还包括进一步表征候选基因产物。在这些实施方案中，含编码ACBP的核苷酸序列的外源核酸从测试细胞中分离；在细胞和/或体外的无细胞转录/翻译系统中表达基因产物。在一些实施方案中，对外源核酸进行核苷酸序列分析，并且从核苷酸序列推导基因产物的氨基酸序列。在一些实施方案中，基因产物的氨基酸序列同公开的氨基酸序列数据库中的其它氨基酸序列进行了比较，以确定是否存在任何与已知蛋白的氨基酸序列的显著氨基酸序列同一性。另外，在细胞中和/或体外无细胞的转录/翻译系统中表达基因产物；并分析基因产物对代谢途径中间体或其它代谢产物的影响。

适合于导入宿主细胞以产生测试细胞的外源核酸包括但不局限于从细胞中分离的自然存在的核酸；在从细胞中分离之前或之后被修饰(例如突变)的自然存在的核酸；合成的核酸，例如在实验室中用核酸化学合成标准方法合成的核酸，或者是用重组方法产生的核酸；在体外、细胞内或无细胞系统中扩增的合成或自然存在的核酸；等等。

适合于被导入宿主细胞的外源核酸包括但不局限于基因组DNA；RNA；分离自细胞的mRNA的互补DNA(cDNA)拷贝；重组DNA；体外合成的DNA，例如使用标准的无细胞体外DNA合成方法合成的DNA。在一些实施方案中，外源核酸是从细胞，原核生物细胞或真核生物细胞中制备的cDNA文库。在一些实施方案中，外源核酸是由细胞原核生物细胞或真核生物细胞制备的基因组DNA文库。

在一些实施方案中，核酸在被导入宿主细胞前被突变。突变核酸的方法是众所周知的，包括良好建立的化学突变方法、辐射诱导的突变，和在合成中突变核酸的方法等。突变DNA的化学方法包括暴露DNA于化学诱变剂，例如甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-亚硝基脲(ENU)、N-甲基-N-硝基-N′-亚硝基胍，4-硝基喹啉N-氧化物，硫酸二乙酯、苯并芘、环磷酰胺、博来霉素、三乙基蜜胺，丙烯酰胺单体、氮芥、长春新碱、双环氧烷烃(例如双环氧丁烷)、ICR-170、甲醛、盐酸甲基苄肼、环氧乙烷、二甲基亚硝胺，7，12-二甲基苯并蒽、苯丁酸氮芥、六甲基磷酸酰胺、双硫酸酐，等。辐射突变诱导试剂包括紫外线、γ-射线、X-射线和快中子轰击。使用例如三甲基补骨脂素和紫外线也可向核酸中导入突变。随机地或靶向地插入可移动的DNA元件，例如转座子，是产生突变的另一个适合的方法。例如使用聚合酶链反应(PCR)技术，如易错PCR可以在无细胞系统中在扩增中向核酸中引入突变。可使用DNA重排(shuffling)技术(例如外显子重排、区域交换等)在体外将突变引入核酸。突变也可以由于细胞中DNA修复酶的缺少而被引入核酸，例如，细胞中编码突变DNA修复酶的突变基因的存在可期望在细胞基因组内产生高频率的突变(即约1个突变/100个基因至1个突变/10,000个基因)。编码DNA修复酶的基因的例子包括但不局限于Mut H、Mut S、Mut L和Mut U，以及其它物种内的同源物(例如MSH 16、PMS 12、MLH 1、GTBP、ERCC-1等)。核酸突变的方法是众所周知的，并且任何一个已知的方法都将适用。参见如Stemple(2004)Nature 5：1-7；Chiang等(1993)PCR Methods Appl2(3)：210-217；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751和美国专利号6,033,861和6,773,900。

在许多实施方案中，外源核酸被插入到表达载体中。适合原核生物和真核生物宿主细胞的表达载体在本领域是已知的，并且可以使用任何适当的表达载体。适合的表达载体如上文所述。

如上所述，在一些实施方案中，外源核酸从其自然环境中的细胞或生物体中分离。在一些实施方案中，细胞或生物体中的核酸在被从细胞或生物体中分离之前被突变。在其它的实施方案中，外源核酸在体外无细胞系统中合成。

在一些实施方案中，外源核酸是合成的核酸。在一些实施方案中，合成的核酸包含编码变体ACBP的核苷酸序列，例如，在氨基酸序列上与自然存在的ACBP或其它亲本ACBP有一个或多个氨基酸不同的ACBP。在一些实施方案中，变体ACBP与自然存在的亲本ACBP在氨基酸序列上有1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、或更多氨基酸不同。在一些实施方案中，变体ACBP与自然存在的亲本ACBP在氨基酸序列上有约10-约15个氨基酸、约15-约20个氨基酸、约20-约25个氨基酸、约25-约30个氨基酸、约30-约35个氨基酸、约35-约40个氨基酸、约40-约50个氨基酸、约50-约60个氨基酸不同。

在一些实施方案中，变体ACBP由在严格杂交条件下与编码已知ACBP的核酸杂交的核酸编码。在另外一些实施方案中，变体ACBP由在温和杂交条件下与编码已知ACBP的核酸杂交的核酸编码。

在一些实施方案中，包含编码自然存在的ACBP的核苷酸序列的核酸通过任何良好建立的方法突变来产生包含编码ACBP变体的核苷酸序列的核酸。适当的突变生成方法包括但不局限于以上所述的化学突变方法、辐射诱导的突变形成和合成中突变核酸的方法。因此，例如，将包含编码自然存在的ACBP的核苷酸序列的核酸暴露于以上所述的化学诱变剂，或经受辐射突变，或经受易错PCR，并且将突变的核酸导入如上述基因修饰的宿主细胞中。使用“增变”(mutator)细菌株产生随机突变的方法在本领域是众所周知的，可用于产生变体ACBP。参见例如Greener等，“An Efficient Random Mutagenesis Technique Usingan E.coli Mutator Strain”，Methods in Molecular Biology，57：375-385(1995)。使用PCR的饱和突变技术也是众所周知的并且也可使用。参见例如美国专利号6,171,820。包含编码变体ACBP的核苷酸序列的核酸由减轻铅导致的生长抑制的能力鉴别。

编码ACBPs的核苷酸序列在本领域是已知的，并且任何已知的编码ACBP的核苷酸序列可以被改变以产生在主题方法中使用的合成核酸。

本发明的一个实施方案提供了含发明的载体的宿主细胞。其它实施方案包括含有编码拟南芥ACBPs的核苷酸序列的植物质体转化载体或核转化载体，例如含有全长ACBPs、或其变体、或其片段用以表达ACBPs、ACBP多肽或与全长ACBPs具有相似铅结合活性的变体。这些植物载体可以含有产生嵌合ACBP多肽的其他序列，其可能包含ACBP多肽的突变、缺失或插入。

在进一步描述本发明之前，应该理解的是本发明并不局限于所描述的特定的实施方案，当然也有可能不同。还应该理解的是，这里使用的术语仅仅为了描述特定的实施方案，并不是想限制，因为本发明的范围将仅由附加的权利要求书所限定。

在提供数值范围时，应该理解的是除非上下文另外有清楚的相反规定，每一个居间数值，至下限单位的十分之一，在该范围的上限和下限之间的及任何其他的在该规定范围内的说明的或居间数值都包含于发明中。这些更小范围的上下限可以独立地被包含于该更小的范围内，也被包含于本发明内，服从于所规定的范围内任何特别地被排除的端值。当规定的范围包括端值中的一个或两个时，排除那些被包括的端值中的一个或两个的范围也包含于发明中。

除非另外有定义，这里所使用的所有技术和科学术语同本发明所属的技术领域中普通的技术人员通常理解的意思相同。尽管任何与在这里描述的材料和方法相同或相似的材料和方法也可用于本发明的实施或测试，但下文描述了优选的材料和方法。这里提及的所有出版物通过援引并入本文用来揭示和描述与被引用出版物相关的材料和/或方法。

需要注意的是，除非上下文中另有清楚的相反规定，在这里和随附的权利要求书中使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数的对象。因此，例如提及“遗传修饰的宿主细胞”包括许多此类宿主细胞，又如提及“该ACBP”包括一个或多个拟南芥ACBPs和本领域技术人员阅读本文后会知道的它的等同物，等等。尤其需要注意的是，权利要求书可被草拟用以排除任何任选的(optional)元素。因此，本陈述意欲作为在述及权利要求的元素时，使用排除性术语如“唯一的”、“仅仅”等，或使用“否定性”限定时的在先基础。

实施例

下面的实施例在这里提出用来提供给本领域普通的技术人员关于如何制备和使用本发明的完整的公开和描述，但并不是为了限制本发明人认为是他们发明的范围，也不表示以下的实验是所进行的全部或仅有的实验。我们已经努力去保证所用数字(如数量、温度等)的准确性，但一些实验误差和偏差也应当予以考虑。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是或者接近是大气压。可使用标准简称如bp，碱基对；kb，千个碱基对；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千个碱基对；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内的(地)；i.p.，腹膜内的(地)；s.c.，皮下的(地)；等。

实施例1-植物材料、生长条件和处理方法

拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Columbia(生态型(ecotype)Col-0)、过量表达ACBP1和ACBP3的转基因植物(生态型Col-0)在21℃、黑暗下8h和23℃、光照下16h循环下生长。为了对Pb(II)可诱导的基因表达进行分析，将在连续光照下生长3周的拟南芥幼苗用1mM Pb(NO₃)₂或水(对照)处理，处理24个小时后分别收集根和枝条样品。为了对Pb(II)敏感性进行测试，将拟南芥幼苗表面灭菌并种植于含2％蔗糖、含或不含0.75mM Pb(NO₃)₂(Sigma-Aldrich，St.Louis)的Murashige and Skoog培养基(Physiol.Plant.15：473-497，1962)中生长2-3周。

实施例2-铅(II)处理诱ACBP转录物

为了测定拟南芥ACBPmRNAs的调节是否对Pb(II)胁迫有反应，我们在1mM Pb(NO₃)₂处理后用根组织RNA进行了逆转录PCR(RT-PCR)。为进行RT-PCR，依据厂商提供的方法，使用TRIzol(Invitrogen)试剂在1mM Pb(NO₃)₂存在或不存在下(以水为对照)从3周龄的野生型拟南芥(Col-0)幼苗的根中提出总RNA。参照厂商(Invitrogen Cat No.12371-019)的方法进行RT-PCR分析。根据mRNA的序列设计了特异性的引物。用于ACBP6的RT-PCR分析的引物有ML750(SEQ ID NO：1)和ML751(SEQ ID NO：2)；ACBP1，ML179(SEQ ID NO：3)和ML759(SEQ ID NO：4)；ACBP2，ML194(SEQ ID NO：5)和ML205(SEQ ID NO：6)；ACBP3，ML783(SEQ ID NO：7)和ML784(SEQ ID NO：8)；ACBP4，ML849(SEQ ID NO：9)和ML850(SEQ ID NO：10)；ACBP5，ML352(SEQ ID NO：11)和ML353(SEQ ID NO：12)；18S，18S-F(SEQ ID NO：13)和18S-R(SEQ ID NO：14)。

RT-PCR分析(图1)中观察到ACBP1-5的mRNA表达在Pb(II)处理后24h的根中有增加。令人吃惊的是编码人9kDaACBP的同源物的ACBP6的转录物被暗示是体内Pb(II)的分子靶点(Smith等，Chemico-Biological Interactions 115：39-52，1998)对铅处理显示极小的变化(图1)。这些结果表明拟南芥ACBP1-5比ACBP6在Pb(II)胁迫中起到更大的作用。

实施例3-在大肠杆菌BL21DE3细胞中重组ACBPs的表达

依据Invitrogen设定的方法，编码拟南芥ACBPs的六个cDNA的每一个被克隆到质粒pRSET(Invitrogen)中用于在大肠杆菌中表达为(His)₆标记的ACBP重组蛋白，该蛋白随后被用于证明这些(His)₆-ACBPs在体外是否结合Pb(II)。使ACBP-pRSET的衍生物在细菌细胞中(大肠杆菌BL21DE3)表达和随后依据Leung等(Planta 223：871-881，2006)描述的方法收获用于纯化(His)₆标记蛋白。然后使用Pb(II)结合试验测试这些纯化的ACBP重组蛋白的铅结合能力(Funaba和Mathews，Mol.Endocrinol.14：1583-1591，2000)。

用表达重组ACBP6(10-kDa ACBP)和ACBP1-5的六个质粒每一个转化大肠杆菌BL21(DE3)Star pLysS(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。转化细胞被培养至OD_600nm＝0.4，由紫外分光光度计测定(Shimadzu Model UV-1206，Japan)，然后用1mM IPTG诱导。在IPTG诱导后3个小时，收获每一个(His)₆-ACBP，依据Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)描述的方法提取可溶和不可溶的蛋白。每个重组ACBP的纯化的详细方法先前已经针对ACBP1描述(Chye，Plant Mol. Biol.38：827-838，1998)，ACBP2(Chye等，Plant Mol.Biol.44：711-721，2000)，ACBP3(Leung等，Planta 223：871-881，2006)以及ACBP4和ACBP5(Leung等，Plant Mol.Biol.55：297-309，2004)并且在以下被简单的描述。依据Laemmli(Nature227：680-685，1970)的方法在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分析收集的蛋白样品。

如(Chye，Plant Mol.Biol.38：827-838，1998)所描述，使用质粒pAT 61在大肠杆菌中表达重组(His)₆-ACBP1融合蛋白。质粒pAT 61是通过将1.1kbEcoRI片段上的ACBP1 cDNA的ExoIII缺失衍生物框内克隆到pRSET B载体的EcoRI位点而产生(Chye，Plant Mol.Biol.38：827-838，1998)。重组(His)₆-ACBP1融合蛋白缺少ACBP1的N末端的前40个氨基酸(Chye，Plant Mol.Biol.38：827-838，1998)。

通过将EcoRI片段上的1.3kb ACBP2 cDNA符合框架结构地克隆到pRSET C载体(Invitrogen Xpress系统)的EcoRI位点产生质粒pACBP2，从而实现重组(His)₆-ACBP2融合蛋白在大肠杆菌中表达。这个1.3kb的cDNA在5’末端是不完全的，缺少0.19kb的5’非翻译区和甲硫氨酸起始密码子。为确定这个1.3kb的cDNA被符合框架结构地(in-frame)与(His)₆标记融合，跨越EcoRI位点的pACBP2 DNA序列被随后验证。pRSET C载体中EcoRI位点位于驱动重组(His)₆-ACBP2融合蛋白表达的T7启动子的下游。在该重组蛋白的N末端，由pRSET C编码的被命名为SEQ ID NO：19的肽序列(MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWIRPRDLQLVPWNSR)融合到了ACBP2肽的氨基酸残基Gly-2上。使用GCG分析包(Genetics ComputerGroup)预测这个重组蛋白的预期分子量。培养由pACBP2转化的大肠杆菌细胞，且通过1mM IPTG诱导(His)₆-ACBP2融合蛋白的表达；根据Invitrogen所描述的方法提取可溶和不可溶的蛋白。依据Bradford(Anal.Biochem.72：248-254，1976)的方法来测定这些蛋白提取物的蛋白浓度。依据Invitrogen描述的方法，蛋白诱导的最适时间是IPTG诱导后4h。在加入1mM IPTG后不同时间点取出的可溶蛋白提取物和不可溶蛋白提取物的蛋白样品(10μg)依据Laemmli(Nature 227：680-685，1970)的方法在SDS-PAGE上进行分析。

在源于pRSET B(Invitrogen)的载体pAT223中克隆的重组(His)₆-ACBP3依据Leung等(Planta 223：871-881，2006)描述的方法由大肠杆菌BL21(DE3)StarpLys(Invitrogen)转化体制备。将转化细胞培养至OD_600nm＝0.4，通过紫外分光光度计测定(Shimadzu Model UV-1206，Japan)，然后用1mM IPTG诱导。在IPTG诱导后3个小时，收获(His)₆-ACBP3，依据Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)描述的方法提取可溶和不可溶蛋白。

如Leung等(Plant Mol.Biol.55：297-309，2004)所述，分别由pRSETB(Invitrogen)衍生的载体pAT184和pAT185表达的重组(His)₆-ACBP4和(His)₆-ACBP5通过大肠杆菌BL21(DE3)Starp Lys(Invitrogen)转化体制备。

在pRSETB(Invitrogen)衍生的载体pAT335中克隆的重组(His)₆-ACBP6(包含His标记的重组蛋白的大小是18.9kDa)通过大肠杆菌BL21(DE3)Starp Lys(Invitrogen)转化体制备。使用命名为SEQ ID NO：1的引物ML750(5’-ATATGGATCCCACGCGTTGTCCTCGTCTTCT-3’)和命名为SEQ ID NO：2的引物ML751(5’-AATATATCATCTTGAATTCAACTG-3’)，通过RT-PCR得到由编码拟南芥ACBP6的全长cDNA构成的0.65kb的PCR片段。这个0.65kb的片段被克隆到pGEM-T EASY载体(Promega)。通过DNA测序分析验证插入后，对应于编码区域的SacI-EcoRI片段被符合框架结构地克隆到pRSETB(Invitrogen)载体中产生质粒pAT335。使用GCG程序(Genetics ComputerGroup，Wisconsin Software Version 10.2)预测，这个质粒表达的(His)₆标记的ACBP的分子量为18.9kDa。将质粒pAT335导入大肠杆菌BL21(DE3)Star pLys(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，然后培养至OD_600nm＝0.4，由紫外分光光度计测定(Shimadzu Model UV-1206，Japan)，随后用1mM IPTG诱导。IPTG诱导3个小时后，收获表达(His)₆-标记的ACBP的细胞，依据Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)描述的方法提取不可溶蛋白。使用Bradford(Anal Biochem 72：248-254，1976)的方法测定细菌粗提物中的蛋白浓度。随后，用15％的聚丙烯酰胺凝胶分离10μg的每种蛋白样品并使用Trans-Blot cell(Bio-Rad)电转移到ECL膜上(Amersham，Buckinghamshire，UK)或者用考马斯亮兰染色。

细菌粗提物的蛋白浓度依据Bradford(Anal.Biochem.72：248-254，1976)的方法测定，依据Laemmli(Nature 227：680-685，1970)的方法在SDS-PAGE上分析在不同时间点收获的样品(10μg)。随后用考马斯亮兰对10％的聚丙烯酰胺凝胶染色或依据厂商的说明书、使用

(Bio-Rad)将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶电转移到ECL膜上(Amersham，Buckinghamshire，UK)用于western印迹分析(Sambrook等：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，SecondEdition.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，pp 18.60-18.73，1989)。依据厂商的说明书，使用QIAexpress Ni-NTA共轭物(Qiagen，Valencia，CA，USA)检测(His)₆标记的ACBP蛋白的表达。

实施例4-从大肠杆菌转化体中纯化重组的(His) ₆ 标记的ACBPs

如先前描述(Leung等，Plant Mol.Biol.55：297-309，2004；Leung等，Planta 223：871-881，2006)以及根据厂商提供的说明书，重组(His)₆标记的ACBPs通过Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Valebcia，CA，USA)的亲和柱纯化。

(His)₆-ACBP1表达于大肠杆菌提取物的可溶部分并且依据生产商的说明书，通过Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Valencia，CA，USA)亲和柱纯化。

在变性的条件下进行(His)₆-ACBP6、(His)₆-ACBP2、(His)₆-ACBP3、(His)₆-ACBP4和(His)₆-ACBP5的批量提取。(His)₆-ACBP2融合蛋白在缓冲溶液E(8M尿素、0.1M磷酸二氢钠、0.01M Tris，pH4.5、5％甘油)中被洗脱出来。(His)₆-ACBP3、(His)₆-ACBP4和(His)₆-ACBP5融合蛋白在缓冲溶液D(8M尿素、0.1M磷酸二氢钠、0.01M Tris，pH5.9、5％甘油)和缓冲溶液E(8M尿素、0.1M磷酸二氢钠、0.01M Tris，pH4.5、5％甘油)中被洗脱出来。在含有50mM HEPES钠盐、200mM NaCl、2mM MgCl₂、5mM EDTA、10％甘油、0.005％(v/v)Tween-20、pH7.9的溶液中、4℃下透析和重折叠后，依据生产商的说明书，通过Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Valencia，CA，USA)亲和柱纯化每一个重组蛋白。

每一个纯化的(His)₆标记的重组融合蛋白使用Centricon-10(Amicon)离心柱浓缩并随后用于体外结合分析。纯化的(His)₆-ACBPs的浓度通过称量冷冻干燥的重组蛋白和测量280nm下的吸收来测定(Layne，Meth.Enzymol.3：447-454，1957)。

实施例5-铅结合分析

铅结合分析和荧光测定依据经过小修改后的Funaba和Mathews(Mol. Endocrinol.14：1583-1591，2000)的方法进行。简单的说，3.2μM的每一个纯化的、平衡于含200mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.2)的(His)₆-ACBP蛋白用8μl 200mM的丹酰环乙亚胺(dansyl aziridine)(Molecular Probes，Cat.No.D151)标记，并在1.5ml的Eppendorf管中、在室温下反应2h。丹酰化的(His)₆-ACBP蛋白被分到96孔微滴定板(Nunc Cat.No.236105)的8个孔中。加入不同浓度(0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.0和9.0μM)的Pb(NO₃)₂(Aldrich，Cat.No.203580)溶液，然后在室温下孵育反应1h。

使用BIO-TEK FL600荧光平板读数仪(BIO-TEK Instrument，INC，USA)，在激发波长360/40nm和发射波长530/25nm的条件下测定荧光值。在结合铅之前，丹酰环乙亚胺偶合的(His)₆-ACBP重组蛋白易于发生构象上的改变。结合Pb(II)分子后，丹酰化的(His)₆-ACBP重组蛋白将改变它们的构象并且染料将显示荧光激发的增加。因此，存在和不存在铅分子时荧光的不同表明(His)₆-ACBP重组蛋白与Pb(II)的结合。每一个实验被重复三次以确认结果。

我们的结果显示重组ACBPs可以在体外结合Pb(II)。在存在1-9μM的Pb(II)时以剂量依赖的模式增加的(His)₆-ACBPs的相对荧光强度表明了与Pb(II)的结合(图2A)。观察到(His)₆-ACBP4和(His)₆-ACBP1的相对荧光强度比其它重组ACBPs的高许多。

实施例6-使用金属螯合亲和层析的重金属结合分析

为构建用于体外转录/翻译中使用的pGEM-T EASY(Promega)衍生物，由RT-PCR产生ACBP1、ACBP2和ACBP6的编码区域。RT-PCR中所用的引物如下：ACBP1(ML190(SEQ ID NO：20)和ML917(SEQ ID NO：17))，ACBP2(ML902(SEQ ID NO：21)和ML903(SEQ ID NO：22))和ACBP6(ML812(SEQ ID NO：23)和ML751(SEQ ID NO：2))。依据厂商的说明书，为了使用

偶联的小麦胚提取系统(Promega)进行体外转录/翻译，将PCR产物随后克隆到pGEM-T EASY载体(Promega)。为进行金属结合分析，通过除掉Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)中的镍然后用0.1M Pb(NO₃)₂(Aldrich)、CdCl₂(Aldrich)或CuCl₂(Aldrich)重新平衡来制备Pb(II)^-、Cd(II)^-、Cu(II)^-平衡基质。将20μlPb(II)^-、Cd(II)^-、Cu(II)^-平衡基质，545μl的50mM KH₂PO₄、300mM NaCl、pH7.4以及[³⁵S]甲硫氨酸标记的蛋白加入到微离心管中(Dykema等，Plant Mol. Biol.41：139-150，1999)并且在4℃下轮子上旋转培养1h。随后，用1.0ml的50mM KH₂PO₄、300mM NaCl、pH7.5的溶液洗基质3次。用200μl的50mMKH₂PO₄、300mM NaCl、500mM的咪唑、pH4.5下洗脱结合的蛋白，随后用200μl的2％SDS、50mM DTT提取，在85℃下加热3min，然后SDS-PAGE分析，然后进行放射自显影。

我们的结果表明体外翻译的ACBP1和ACBP2比ACBP6(图2B)更好地结合Pb(II)。而ACBP1比ACBP2稍好一点的结合(图2B)。我们的结果(图2C)进一步显示体外翻译的ACBP2比ACBP6结合Cd(II)和Cu(II)要好。ACBP2和Pb(II)、Cd(II)和Cu(II)的结合被金属螯合剂EDTA抑制，表明结合依赖二价阳离子(图2C)。

体外翻译的ACBP2(图2B)和(His)₆-ACBP2(图2A)之间在铅结合上的不同可能是由于不同的蛋白制备方法造成的。与体外翻译的ACBP2不同，(His)₆-ACBP2是从大肠杆菌的不可溶提取物在变性条件下制备并随后被再折叠(Chye等，Plant Mol.Biol.44：711-721，2000)。与此相对照，(His)₆-ACBP1直接从大肠杆菌的可溶性提取物中制备(Chye，Plant Mol.Biol.38：827-838，1998)。尽管是人ACBP，体内Pb(II)的分子靶点(Smith等，Chemico-Biological Interactionsl 15：39-52，1998)，的更近的同源蛋白，但是(His)₆-ACBP6(图2A)和体外翻译的ACBP6(图2B)结合Pb(II)似乎不如ACBP1好。由于拟南芥ACBPs的更大同源蛋白在人类中没有被鉴定，因此更小的ACBP可能是在人类中唯一可得的结合Pb(II)的ACBP。与拟南芥ACBPs酰基辅酶A结合区域的比较显示在图2D中。在酰基辅酶A结合区域中，在ACBP1-5中保守，但是不在ACBP6中保守10个氨基酸残基被鉴定(图2D“Con”序列中用下划线标记)。在人类9kDaACBP(GenBank登记号码为NM_020548)中进一步保守的三个保守氨基酸残基被用圆圈标记；在人类ACBP以及ACBP1-5中保守的这三个氨基酸残基可能在结合铅中起到重要的作用。

其它源自植物衍生的ACBPs可通过使用本领域技术人员公知的技术搜索已知数据库中的与拟南芥ACBPs1-6中的任何一个有同源性的序列而被鉴定。可选择地，为了获得其它源自植物衍生的ACBPs，本技术领域中的普通技术的人员可以获得并用常规的技术和探针基于拟南芥ACBPs1-6之一来获得和探测感兴趣植物物种的DNA文库来鉴定随后可以被分离和表达的同源序列。这些蛋白表达产物可以随后被检测来确认它们是否能结合酰基辅酶A酯。

所有拟南芥ACBPs(ACBP1-6)显示了另外13个氨基酸残基(图2D中“Con”序列中用星号标记)的100％保守。在这些残基上保守的源自植物的ACBPs和ACBP变体，在推定的酰基辅酶A结合区域中，应当保留这13个保守残基中的至少7个残基。虽然前两个保守残基(用星号标记)“F”和“V”可以以不同方式隔开(3-6个残基的间隔)，但是后11个保守残基是特别的LxxLxxxAxxGxxxxxxPxxxxxxxxxKWxxWxxxxxxxxxEAM.，在这里x代表任何氨基酸残基。在ACBP变体或其它源自植物的ACBPs中，保留这13个保守残基中的至少7个残基，这个区域的存在可以进一步被检测来确认它是否提供结合酰基辅酶A酯的能力。

图2D还显示了在“Con”(Conserved，保守的)氨基酸下面、在酰基辅酶A结合区域中出现的“Com”(Common，共同的)氨基酸残基。通过定义，“Com”列出了在ACBP1-5的酰基辅酶A结合区域内、在这五个ACBPs(ACBP1-5)任一个至少出现两次的氨基酸残基。图2D显示在ACBP1-5的酰基辅酶A结合区域中氨基酸高度保守；因此编码这个区域的核苷酸序列可以用PCR扩增并用作杂交探针来鉴定其它生物体中拟南芥ACBP1-5的同源物。

例如，在ACBP1中编码酰基辅酶A结合区域的核苷酸序列(氨基酸94-180)可以通过使用正向引物5’-CTTGATGAGGCATTTAGTGC-3’(被命名为SEQ IDNO：24)和反向引物5’-TGGGTAAAGCTGAGTAACAAG-3，(被命名为SEQ IDNO：25)来制备，以生成一个0.26-kb的DNA片段，当这个DNA片段被用作杂交探针来筛选DNA文库时，它应当可以检测其它源自植物的编码酰基辅酶A结合区域的核苷酸序列。对于ACBP1内酰基辅酶A结合区域的PCR扩增，每个25μl的PCR反应包括25ng质粒pAT31 DNA、10pmol的每种引物SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25、lU的Taq聚合酶(Perkin Elmer)、2.5μl 10×PCR缓冲溶液、1.5μl的25mM MgCl₂和0.5μl的10mM每种dATP、dGTP、dTTP和³²P标记的dCTP。PCR扩增以95℃变性3min起始，然后是94℃1min、55℃1min和68℃4min的40个循环，以及在72℃延伸10min。

这个0.26kb的PCR产生的放射标记探针可用来筛选DNA文库来鉴定编码ACBP同源物的杂交克隆。杂交和洗涤条件被大家所熟知并举例于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(1989)，特别是里面章节11和表格11.1；以及Sambrook，J.和Russell，W.，Molecular Cloning： A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor(2001)。使用这个0.26kb的编码ACBP1酰基辅酶A结合区域的核苷酸序列作为询问序列对NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行的BLAST搜索产生了56个从其它物种得到的“Blast命中”，这证明了它作为杂交探针筛选DNA文库的可行性。这些“Blast命中”(％DNA同一性显示在括号内)包括GenBank登记号：AM476905(葡萄(Vitis vinifera)；75％同一性)；AC189237(芜菁(Brassica rapa)；75％)；CT831642(水稻(Oryza sativa)；73％)；NM_001060827(水稻；73％)；DQ908250(棉花(Gossypium hirsutum)；81％)和EF086012(云杉(Picea sitchensis)；69％)。我们先前使用ACBP1抗体对来源于芥菜型油菜(Brassica juncea)、茄子(Solanum melongena)、莴苣、胡萝卜和西红柿的总植物蛋白进行的Western印迹分析表明存在分子量与拟南芥ACBP1相似的交叉反应条带，这表明ACBP1同源蛋白在许多不同的植物物种中存在(Chye等，Plant J.18：205-214，1999)。

在分离其它源自植物的ACBPs时，这些ACBPs中功能性酰基辅酶A结合区域的存在可以使用His标记的ACBPs和放射标记的酰基辅酶A酯在体外通过Lipidex分析检测，其中His标记的ACBPs和放射标记的酰基辅酶A酯包括但并不局限于先前所描述的¹⁴[C]油酰辅酶A、¹⁴[C]棕榈酰辅酶A、¹⁴[C]花生烯酰辅酶A(Chye等，Plant Mol.Biol.44：711-721，2000；Leung等，Plant Mol.Biol.55：297-309，2004；Leung等，Planta 223：871-881，2006)。非放射标记的酰基辅酶A酯可以和放射标记的酰基辅酶A酯联合起来使用来测定结合，如Leung等，Planta 223：871-881，2006所述。His标记的蛋白可以依据实施例3和4所述制备。在Lipidex分析中使用这些His标记的ACBPs的方法已经针对拟南芥ACBP1-5进行详细的描述(Chye等，Plant Mol.Biol.44：711-721，2000；Leung等，Plant Mol.Biol.55：297-309，2004；Leung等，Planta 223：871-881，2006)。

实施例7-过表达ACBP1和ACBP3的转基因拟南芥的制备

将图3A-3B中所示的植物转化载体pAT31(35S：ACBP1)和pAT314(35S：ACBP3)通过三亲杂交方法从E.coli引入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404中(Roger等，Plant Molecular Biology Manualpp.A2：1-12，1988)，随后使用植物浸渍(floral dip)方法将其导入野生型拟南芥植物(ecotype Columbia)中(Clough和Bent，Plant J.16：735-743，1998)。转化的T₀代种子在含有50mg/mL卡那霉素的植物生长培养基上进行筛选，然后将得到的阳性转化体转移到土壤中获得T₁群体。利用35S启动子特异的正向引物35SB(SEQ ID NO：15)和基因特异的反向引物ML759(SEQ ID NO：4；用于35S：ACBP1)和ML784(SEQ ID NO：8；用于35S：ACBP3)，通过PCR扩增进一步确证阳性转化体。根据生产商提供的方案使用Digoxigenin Northern印迹试剂盒(Roche)进行的RNA凝胶印迹分析如Xiao等所述(PlantCell16：1132-1142，2004)。简言之，从T₂转化体中提取总RNA，在含6％甲醛的1.5％琼脂糖凝胶上分离30μg总RNA，然后转移到Hybond N 膜(Amersham)上。使用ACBP1-和ACBP3-特异性cDNA探针进行Northern(RNA)印迹分析以检测35S：ACBP1和35S：ACBP3转录物。为制备Northern(RNA)印迹分析所用的探针，将特异性的引物ACBP1(ML179，SEQ ID NO：3和ML759，SEQ ID NO：4)及ACBP3(ML783，SEQ ID NO：7和ML784，SEQ ID NO：8)用于PCR扩增。参照生产商的说明书(Roche，德国)，使用PCR Digoxigenin探针合成试剂盒标记这些片段。杂交和检测均按照生产商(Roche)建议的标准步骤进行。Western印迹分析按照Chye(Plant Mol.Biol.38：827-838，1998)的描述进行。从已有果荚的成熟植物中提取植物总蛋白。用Bio-Rad蛋白分析试剂盒(Bradford，1976)测定蛋白浓度。每个孔上样10μ总蛋白于SDS-PAGE凝胶。用Trans-Blot cell(Bio-Rad)将蛋白从SDS-PAGE凝胶电转移到Hybond-C膜(Amersham)上。Western印迹分析中使用亲和柱纯化的ACBP1特异性抗体(Chye，Plant Mol.Biol.38：827-838，1998)或GFP特异性抗体(Invitrogen)。参照生产商的说明使用ECL Western印迹检测试剂盒(Amersham)检测交叉反应条带。

测试T₃稳定转化体对Pb(II)的敏感性以及Pb(II)含量。为了测定过表达ACBP1的转基因拟南芥中Pb(II)的含量，将植物生长在MS培养基中2到3周，然后转移到含有1mM Pb(NO₃)₂的溶液中48小时。称重和收获用于测定Pb(II)含量的植物枝条和根。为测定过表达ACBP3的转基因拟南芥中Pb(II)的含量，从萌发并生长在含0.75mM Pb(NO₃)₂的培养基中的幼苗收集2周的拟南芥枝条。根据文献(Lee等，Plant Physiol.138：827-836，2005)的描述，样品在11 NHNO₃中200℃消化过夜。样品用0.5N HNO₃稀释后，用原子吸收光谱仪(PERKINELMER-AA Spectrometer 3110)分析。从30株独立的植株，分作6组(每组包括5株植物)收获枝条样品测定每个植物株系，即每个植物株系包含6个重复，每个重复包含5株植物。从三次独立实验中得到每个植物株系的平均值。

实施例8-过表达ACBP1的转基因植物比野生型具有更强的Pb(II)胁迫耐性

为证实ACBP1是否赋予Pb(II)抗性，通过农杆菌(Agrobacterium)转化制备过达表ACBP1的转基因植物(Clough和Bent，Plant J.16：735-743，1998)。为此，ACBP1全长的cDNA序列被克隆到二元载体pBI121中，从而使ACBP1由CaMV35S启动子表达。使用农杆菌(Agrobacterium)介导的转化方法，通过植物浸渍途径将得到的植物转化载体pAT31(图3A)导入野生型拟南芥植物(Col-0)中(Clough和Bent，Plant J.16：735-743，1998)。RNA凝胶印迹分析中鉴定三个独立的T₂转基因株系中过量生产ACBP1 mRNA(图.4A)。其中，生长在含选择性抗生素卡那霉素的生长培养基的T₂群体中的两个株系(分别命名为ACBP1 ox-3和ACBP1 ox-5)显示了3∶1(抗性/敏感)分离比，这显示它们仅含有一个拷贝的35S::ACBP1转基因。使用ACBP1特异性的抗体(图4B)，Western印迹分析进一步证实野生型，ACBP1 ox-3和ACBP1 ox-5中的ACBP1蛋白质水平，这样选择了用于Pb(II)处理的所得到的T₃代稳定转基因植物。

野生型(Col-0)和T₃35S::ACBP1转基因植物(ACBP1 ox-3和ACBP1 ox-5)萌发后生长在MS培养基上3天，然后转移到MS培养基及含有0.75mM Pb(NO₃)₂的MS培养基垂直生长。如图4C所示，尽管萌发后17天生长在MS(Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15：473-497，1962)培养基上的野生型和T₃代转基因植物生长速率相似(图4C)，但在添加了0.75mM Pb(NO₃)₂的MS培养基上，野生型的生长落后于ACBP1转化株系的生长。数据(图4D)表明在含有Pb(II)的培养基中生长的两个转基因株系(ACBP1 ox-3和ACBP1 ox-5)的相对根长度分别是生长在MS培养基上的相似植物的40.0±2.0％和36.2±2.3％。这些值显著性地(P＜0.05)高于野生型(23.7±2.1％)的值。同时，生长在含有Pb(II)的培养基中的ACBP1 ox-3和ACBP1 ox-5转基因株系的相对鲜重(图4E)相对于野生型分别为枝条中1.6，1.5倍及根中1.8，1.4倍。表示为生长在没有Pb(II)的培养基中的植株的百分比的鲜重改变是显著的(P＜0.05)。

实施例9-过表达ACBP3的转基因植物比野生型具有更强的Pb(II)胁迫耐性

为证实ACBP3是否赋予Pb(II)抗性，通过农杆菌(Agrobacterium)转化制备过达表ACBP3的转基因植物(Clough和Bent，Plant J.16：735-743，1998)。为此，ACBP3全长cDNA被克隆到二元载体pBI-GFP中得到质粒pAT314(图3B)，pBI-GFP是通过将GUS基因替换为eGFP基因获得的pBI121衍生物，质粒pAT314中ACBP3由CaMV 35S启动子表达(Shi等，Plant Cell 17：2340-2354，2005)。然后，使用农杆菌(Agrobacterium)介导的转化方法，通过植物浸渍途径将植物转化载体pAT314(图3B)导入野生型拟南芥植物(Col-0)中(Clough和Bent，Plant J.16：735-743，1998)。利用RNA凝胶印迹分析鉴定三个独立的T₂转基因株系中过量生产ACBP3-GFP mRNA(图.5A)。其中，生长在含选择性抗生素卡那霉素的生长培养基上的T₂群体中所有三个株系(分别命名为ACBP3ox-2，ACBP3 ox-9和ACBP3 ox-11)显示3∶1(抗性/敏感)的分离比，这显示它们仅含有一个拷贝的35S::ACBP3转基因。使用GFP特异性的抗体进行的Western印迹分析进一步证实野生型，ACBP3 ox-2，ACBP3 ox-9和ACBP3 ox-11中的ACBP3-GFP融合蛋白水平(图5B)，这样选择了用于Pb(II)处理的它们产生的T₃代稳定转基因植物。

尽管生长在MS培养基上的野生型(Col-0)和T₃ 35S::ACBP3转基因植物(ACBP3 ox-2，ACBP3 ox-9和ACBP3 ox-11)的生长相似，但在含有0.75mMPb(NO₃)₂的培养基上培养3周后，只有野生型的生长受到了抑制(图5C)。在经过Pb(NO₃)₂处理后，ACBP3 ox-2，ACBP3 ox-9和ACBP3 ox-11转化植物明显表现比野生型更好的生长(图5C)。定量分析也表明在MS培养基中，野生型，ACBP3 ox-2，ACBP3 ox-9和ACBP3 ox-11转化植物的根长(图5D)及鲜重(图5E)没有显示显著性的差异，但是三个独立的转基因株系的根长(分别是16.8±0.12，17.8±0.12和14.8±0.12mm)都比野生型(7.2±0.08mm)的要长。而且在含有Pb(II)的培养基中ACBP3 ox-2，ACBP3 ox-9和ACBP3 ox-11转化株系的鲜重与野生型相比，分别为1.1，1.2及1.27倍(图5E)。

实施例10-过表达ACBP的转基因植物中更多地富集铅

我们进一步探究ACBP介导的对Pb(II)的抗性是由于像过表达AtPDR12拟南芥植物一样将Pb(II)排出体外(Lee等，Plant Physiol.138：827-836，2005)，还是像转基因植物中过表达AtATM3和YCF1那样，转移位置而导致Pb(II)在植物细胞内富集(Kim等，Plant Physiol.140：922-932，2006；Song等，Nat.Biotech. 21：914-919，2003)。

为了检测过表达ACPB1转基因植物中Pb(II)的含量，野生型(Col-0)，ACBP1ox-3和ACBP1 ox-5株系在MS培养基上生长3周后，将幼苗转移使根浸渍到1mM Pb(NO₃)₂中48小时。植物用蒸馏水洗3次后用滤纸吸干。称重根和枝条样品，随后用11NHNO₃在200℃消化过夜。样品用0.5NHNO₃稀释后，用原子吸收光谱仪(PERKIN ELMER-AA Spectrometer 3110)分析。如图6A所示，当野生型和转基因株系内Pb(II)的含量以每株植物为基础标准化后，ACBP1ox-3和ACBP1ox-5株系显示枝条Pb(II)含量分别增加为野生型的3.4和2.9倍(P＜0.001)，而根部含量差异很小。当野生型和转基因拟南芥内Pb(II)的含量以每个鲜重为基础比较后，显示ACBP1 ox-3和ACBP1 ox-5株系枝条Pb(II)含量分别增加到1.9和2.2倍(P＜0.05，图6B)，证实过表达ACBP1导致枝条中富集Pb(II)。

还检测了过表达ACBP3的转基因植物内Pb(II)的含量。野生型(Col-0)和ACBP3 ox-11株系萌发并在含0.75mM Pb(NO₃)₂的MS培养基上生长2周后，收获其枝条用于Pb(II)含量检测。图7A显示过表达ACBP3的ACBP3 ox-11株系(39.1±0.68ppm/l植物)比野生型(36.1±0.6ppm/l植物)内富集更多的Pb(II)。当野生型和转基因拟南芥内Pb(II)的含量以每个鲜重为基础进行比较时，显示ACBP3 ox-11枝条Pb(II)含量相比野生型增加到1.4倍(P＜0.05，图7B)，证实过表达ACBP3也可导致植物枝条富集Pb(II)。

实施例11-ACBP构建体应用于质体转化

用于质体转化的启动子包括质体表达中的强的和组成型启动子，包括增强表达的psbA启动子(psbA基因编码光系统II32kD蛋白质)和16S rRNA操纵子(rrn)启动子，或这些启动子的修饰体(Suzuki等，2003，Plant Cell 15：195-205)。在特定的实施方案中，每一个含ACBP编码序列的质体转化构建体被克隆到图8A显示的质粒转化载体pMLV-HisA中(Li等Exp.Biol.Med.231：1346-1352，2006)，得到比如pAT385的质体转化载体(图8B)，用于通过微粒枪轰击(particlegun bombardment)导入植物细胞(Staub和Maliga，Plant J.6：547-553，1994)。图9A-9B所示的是利用载体pAT385进行烟草质体转化的一个例子，图9C-9D所示的是对转化后的植物的分子分析。

实施例12-表达ACBP植物的制备

根据本发明的一个实施方案，用本发明的核酸构建体，通过本领域已知的多种转化方法，包括农杆菌介导的转化(Horsch等，Science227：1227-1231，1985)或质体转化(Staub和Maliga，Plant J.6：547-553，1994)，可以将多种植物和植物细胞系统工程化以获得本文所述的需要的生理学和农学特性。在优选的实施方案中，用于工程化的靶植物和植物细胞包括，但不限于，那些单子叶和双子叶植物，例如农作物包括谷类作物(例如小麦，玉米，稻，小米，大麦)，烟草，水果作物(例如番茄，苹果，梨，草莓，橙)，饲料作物(例如苜蓿)，根菜作物(例如胡萝卜，马铃薯，甜菜，薯蓣)，叶菜作物(例如莴苣，菠菜)，开花植物(例如矮牵牛花，玫瑰，菊花)，针叶树和松树(例如冷杉，云杉)；用于植物修复的植物(例如重金属积聚植物)；油料作物(例如向日葵，油菜籽)；和用于实验目的的植物(例如拟南芥(Arabidopsis))。

根据本发明另一个实施方案，需要的植物可以通过将一个或多个表达本文所述的ACBP的载体工程化到多种植物细胞类型中获得，植物细胞类型包括但不限于原生质体，组织培养细胞，组织和器官外植体，花粉，胚胎，以及完整植物。在本发明的一个实施方案中，用下述步骤和方法选择或筛选工程化的植物材料以获得转化体(那些掺入或整合了引入基因构建体的转化体)。通过有性或无性繁殖或生长将分离的转化体再生成植物及其后代(包括直接世代和后续世代)。或者，可将工程化的植物材料再生成植物后对衍生出的植物选择或筛选标记基因性状。在选择或筛选标记基因之前或之后，从植物细胞、组织或器官再生植物的步骤是本领域技术人员公知的。

根据本发明另一个实施方案，组织特异性的启动子可用于将ACBPs的表达靶向到植物的根或叶，使得植物可食用部分没有重金属积累。例如，组织特异性的启动子包括编码叶特异性表达的rbsC(Coruzzi等，EMBO J.3：1671-1697，1984)和根特异性表达的SAHH或SHMT(Sivanandan等，Biochimica et Biophysica Acta 1731：202-208，2005)的那些。Ekramoddoullah等在美国专利号7,285,656B2教导了另一个示例性根特异性启动子。而且，也有报道花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子在其启动子区域也具有根特异性和叶特异性的组件(modules)(Benfey等,EMBO J.8：2195-2202，1989)。其他组织特异性启动子是本领域技术人员公知和广泛可利用的。并且，很多组成型或诱导型启动子也是本领域技术人员公知和广泛可利用的。

转化的植物细胞，愈伤组织，组织或植物可以通过选择或筛选工程化的植物材料中由转化DNA上存在的标记基因编码的性状而被鉴别和分离。例如，选择可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂的培养基培养工程化的植物材料来进行，植物中的转化基因对所述抗生素或除草剂提供了抗性。进一步，转化的植物和植物细胞还可以通过筛选本发明的载体中可能存在的任何可见标记基因(例如β-葡糖醛酸酶，荧光素酶，B或Cl基因)的活性被鉴别。这种选择和筛选方法是本领域技术人员公知的。

物理和生化方法还可以用于鉴别含有本发明的基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不限于：1)用于检测和确定重组DNA插入物结构的Southern分析或PCR扩增；2)用于检测和检查所述基因构建体的RNA转录物的Northern印迹，S1 RNase保护，引物延伸或反转录酶-PCR扩增；3)用于检测酶活性的酶检测，其中该基因产物由所述基因构建体编码；4)蛋白质凝胶电泳(PAGE)，Western印迹技术，免疫沉淀，或酶联免疫检测，其中所述基因构建体产物是蛋白质。其它技术，例如原位杂交，酶染色，和免疫染色，也可以用于检测在特定植物器官和组织中所述重组构建体的存在或表达。进行所有这些检测的方法是本领域技术人员公知的。在一个特定的实施方案中，指定卡那霉素抗性的选择标记基因nptII在核转化中被使用。

植物的实例是单子叶植物，双子叶植物，作物植物(即为农业目的，为动物包括人的食物生产目的而培养的任何植物种，典型地以超过大约10株植物成群种植以收获完整植物或所述植物具有的植物部分，例如果实，花或作物的植物，例如烟草，谷物等)，树(即果树，为木材生产培养的树，为装饰培养的树等)，任何种类的花(即为装饰目的培养的植物，例如在收获之后)，仙人掌。其它ACBP可以被表达的植物的更多实例包括植物界(Viridiplantae)，链形植物(Streptophyta)，有胚植物(Embryophyta)，维管植物(Tracheophyta)，真叶植物(Euphyllophytes)，种子植物门(Spermatophyta)，木兰门(Magnoliophyta)，百合纲(Liliopsida)，鸭跖草亚纲(Commelinidae)，禾本目(Poales)，禾本科(Poaceae)，稻属(Oryza)，水稻(Oryza sativa)，玉蜀黍属(Zea)，玉米(Zea mays)，大麦属(Hordeum)，大麦(Hordeum vulgare)，小麦属，小麦(Triticum aestivum)，真双子叶植物(Eudicotyledons)，核心真双子叶分支(Core eudicots)，菊亚纲(Asteridae)，真菊分支(Euasterids)，蔷薇亚纲(Rosidae)，II类真蔷薇分支(EurosidsII)，十字花目(Brassicales)，十字花科(Brassicaceae)，阿布属(Arabidopsis)，木兰纲(Magnoliopsida)，Solananae，茄目(Solanales)，茄科，茄属(Solanum)，和烟草属(Nicotiana)。因此本发明的实施方案可应用于很多种植物中，包括，但不限于下述属的种：腰果(Anacardium)，花生(Arachis)，芦笋(Asparagus)，颠茄(Atropa)，燕麦(Avena)，芸苔(Brassica)，柑橘(Citrus)，西瓜(Citrullus)，辣椒(Capsicum)，红花(Carthamus)，椰子(Cocos)，咖啡(Coffea)，甜瓜(Cucumis)，南瓜(Cucurbita)，胡萝卜(Daucus)，油棕(Elaeis)，草莓(Fragaria)，大豆(Glycine)，棉(Gossypium)，向日葵(Helianthus)，Heterocallis，大麦(Hordeum)，天仙子(Hyoscyamus)，莴苣(Lactuca)，亚麻(Linum)，黑麦草(Lolium)，羽扇豆属(Lupinus)，番茄属(Lycopersicon)，苹果属(Malus)，木薯属(Manihot)，Majorana，苜蓿属(Medicago)，烟草属(Nicotiana)，木樨榄属(Olea)，稻属(Oryza)，稷属(Panieum)，Panneserum，鳄梨属(Persea)，菜豆属(Phaseolus)，Pistachia，豌豆属(Pisum)，梨属(Pyrus)，李属(Prunus)，萝卜属(Raphanus)，蓖麻属(Ricinus)，黑麦属(Secale)，千里光属(Senecio)，白芥(Sinapis)，茄属(Solanum)，高粱属(Sorghum)，Theobromus，胡芦巴属(Trigonella)，小麦属(Titicum)，蚕豆属(Vicia)，葡萄属(Vitis)，豇豆属(Vigna)，和玉蜀黍属(Zea)。

本说明书中提及的所有的专利，专利申请，临时申请和出版物在此以引用教导不符的程度。

虽然已经结合具体实施方式对本发明进行了描述，但本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变和等同物的替换。此外，可以进行许多修改以使特定的情形、材料、物质组合物、方法、一个或多个方法步骤适应于本发明的目的、精神和范围。所有这样的修改意欲包括在所附权利要求的范围内。。

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Claims (7)

1.一种对重金属污染的环境进行植物修复的方法，其中所述重金属是铅，所述方法包括：

选择被重金属污染的环境，以及，

在所述环境中栽培转化的生物体，该生物体表达编码源自植物的酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)的核酸，从而一定量的重金属从环境中除去，

其中所述ACBP是拟南芥ACBP，选自：ACBP1，GenBank登记号码为AAD03482，和ACBP3，GenBank登记号码为NP_194154。

2.根据权利要求1的方法，其中所述转化的生物体是转化的植物。

3.根据权利要求1的方法，其中所述核酸是在转化的植物的核内。

4.根据权利要求1的方法，其中所述核酸是在转化的植物的质体内。

5.根据权利要求2的方法，其中所述转化的植物是拟南芥。

6.一种监控/检测环境中污染金属存在的方法，其中所述金属是铅，所述方法包括：

选择待检测或监控污染金属存在的环境，

在所述环境中栽培被转化以表达结合所述污染金属的源自植物的ACBP的植物，以及，

在所述植物的至少一部分中检测污染金属的存在，

由此显示环境中存在或不存在所述污染金属，

其中所述ACBP是拟南芥ACBP，选自：ACBP1，GenBank登记号码为AAD03482，和ACBP3，GenBank登记号码为NP_194154。

7.一种被稳定转化以表达编码源自植物的酰基辅酶A结合蛋白的核酸的植物细胞，其中所述源自植物的酰基辅酶A结合蛋白是拟南芥ACBP，选自ACBP1，GenBank登记号码为AAD03482，和ACBP3，GenBank登记号码为NP_194154，其中所述植物细胞是拟南芥。