CN103275976B - 一种海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海洋咔啉生物碱（marincarbolines，MCBs）的生物合成基因簇及其应用。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1-4222位所示，包含3个基因：负责MCBs酰胺键合成的基因，即mcbA；负责MCBs Pictet-Spengler反应的基因，即mcbB；负责MCBs脱羧的基因，即mcbC。本发明所提供的包含MCBs生物合成相关的所有基因和蛋白信息，可以帮助人们理解小分子生物碱家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

Description

一种海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇及其应用

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种海洋咔啉生物碱（marinacarbolines，MCBs）的生物合成基因簇及其应用。

背景技术：

β-咔啉化合物是一类自然界中广泛存在的吲哚生物碱，这类化合物具有共同的β-咔啉三环骨架系统，根据β-咔啉吡啶环饱和程度的不同，可简单分为四氢系列、二氢系列和全芳香型系列。全芳香型的β-咔啉三环骨架系统是一个完全的平面分子，具有不同的酸碱性，因此，这类化合物的存在形式受pH值和β-咔啉环上取代基的性质和位置的影响。对其研究及药理学探索发现，β-咔啉类衍生物具有重要的抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎和作为一些酶的抑制剂等多方面生物活性，相应的具体机制正在深入研究之中。海洋咔啉生物碱（marinacarbolines，MCBs）是从拟诺卡氏菌科（Nocardiopsaceae）放线菌新属新种Marinactinospora thermotoleransSCSIO00652发酵物中分离得到的四个新的β-咔啉生物碱类化合物，其结构式如图1（1-4）所示，药理活性研究表明，这些化合物无细胞毒活性，但对疟原虫Plasmodium falciparum多重耐药株Dd2及敏感株3D7具有明显的抑制作用，显示出较好的抗疟活性，可将为抗疟药物研究开发的先导化合物（这四个化合物已经申请专利“β-咔啉生物碱类化合物及其在制备抗疟疾药物中的应用”，授权号为：ZL201110132680.9）。

迄今为止，有关深海放线菌来源的海洋咔啉生物碱编码基因簇和生物合成的研究国内外尚未见报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇。

所述的海洋咔啉生物碱，包括四个β-咔啉生物碱类化合物，其结构式如图1中的式1、2、3和4所示，这四个化合物已经申请专利“β-咔啉生物碱类化合物及其在制备抗疟疾药物中的应用”，授权专利号为：ZL201110132680.9。

本发明是以放线菌来源的海洋咔啉生物碱为目标分子，从筛选生物合成基因簇出发，采用分子生物学、微生物学、合成生物学、生物化学以及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过对其生物合成机制的研究，阐明了深海来源的β-咔啉生物碱MCBs形成的主要分子机制，对一些酶的体外反应的研究证实了其相应的催化功能，在此基础上应用酶学反应获得了一系列β-咔啉类似物，为利用组合生物合成的方法对MCBs的化学结构进行修饰和改造提供了依据，也为药物筛选提供了一些化合物实体。

本发明的海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇来源于放线菌Marinactinosporathermotolerans SCSIO00652，其特征在于，该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1-4222位的碱基序列所示，包含3个基因，具体为：

（1）负责海洋咔啉生物碱酰胺键合成的基因，即mcbA，位于基因簇核苷酸序列（SEQID NO.1，下同）第1-1488个碱基处，长度为1488个碱基对，酰胺键合成酶，495个氨基酸；

（2）负责海洋咔啉生物碱骨架合成的基因，即mcbB，位于基因簇核苷酸序列第1572-2516个碱基处，长度为945个碱基对，编码Pictet-Spengler反应酶，314个氨基酸；

（3）负责海洋咔啉生物碱脱羧的基因，即mcbC，位于基因簇核苷酸序列第2570-4222个碱基处，长度为1653个碱基对，编码脱羧酶，550个氨基酸。

SEQ ID NO.1（序列表）所示序列的第1-4222位的碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。且第1-4222位的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应（PCR）或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或DNA体外合成技术或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO.1所示序列的第1-4222位中DNA序列的重组DNA载体的途径。

本发明还提供了产生海洋咔啉生物碱生物合成基因被中断或其他基因改造的途径，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO.1所示序列的第1-4222位中的核苷酸序列。

本发明所提供的核苷酸列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应（PCR）的方法或包含本发明SEQ ID NO.1所示序列的第1-4222位的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与海洋咔啉生物碱的生物合基因簇相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有拟诺卡氏菌基因组中邻近区域未克隆的DNA。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内体外修饰或进行突变，包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、小单孢菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并了解它们在宿主代谢中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组载体以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得其他新型生物合成途径或者产生新的化合物。

包含DNA片段或基因可以用来提高海洋咔啉生物碱或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。

本发明还提供了海洋咔啉生物碱生物合成基因簇在制备海洋咔啉生物碱及其类似物中的应用。

本发明还提供一种酰胺键合成酶基因mcbA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1-1488位碱基所示。

上述酰胺键合成酶基因mcbA编码酰胺键合成酶McbA。

酰胺键合成酶McbA在催化如式（Ⅰ）所示的β-咔啉母核（化合物6）和芳香胺类化合物之间酰胺键的形成而产生β-咔啉生物碱类似物中的应用。

式（Ⅰ）

本发明还提供了一种Pictet-Spengler反应酶基因mcbB，其特征在与，其核苷酸序列如SEQID NO.1的第1572-2516位碱基所示。

上述Pictet-Spengler反应酶基因mcbB编码的Pictet-Spengler反应酶McbB。

Pictet-Spengler反应酶McbB在制备β-咔啉母核或β-咔啉衍生物中的应用。

所述的β-咔啉母核为如式（Ⅱ）所示的化合物6，β-咔啉衍生物为如式（Ⅱ）所示的化合物5或7。

式（Ⅱ）

总之，本发明所提供的包含MCBs生物合成相关的所有基因和蛋白信息，可以帮助人们理解小分子生物碱家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和理论基础。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物、基因或蛋白。

本发明的拟诺卡氏菌科（Nocardiopsaceae）Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652是新属新种，公开于非专利文献（深海放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652遗传操作系统的建立.李军，朱清华，张云，马俊英，田新朋，李文均，张长生，鞠建华.中国抗生素杂志.2012年.第2期第105-111页），申请人保证自本发明申请日起向公众提供。该菌现保存于中国广东省广州市中国科学院南海海洋研究所中国科学院海洋微生物研究中心（RNAM Center for Marine Microbiology，CAS），编号为：SCSIO00652，该菌株对外销售，任何人都可以从该保藏中心购买到。

附图说明：

图1是海洋咔啉生物碱的四个β-咔啉生物碱类化合物1-4的结构式和相关的中间体或衍生物5-14的化学结构式。

图2是Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652中海洋咔啉生物碱（MCBs）的生物合成基因簇。

图3是部分基因遗传改造Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652中MCBs生物合成基因簇得到的突变株在发酵培养基中发酵粗提物的HPLC分析图：I：野生型Marinactinosporathermotolerans SCSIO00652；II：突变株ΔmcbA；III：突变株ΔmcbB；IV：突变株ΔmcbC，图中阿拉伯数字表示MCBs或其中间体，其中1、3、6分别代表图1中的式1、式3和式6表示的化合物。

图4是mcbB、mcbAB和mcbABC在E.coli BL21（DE3）中的表达得到的菌株在LB中发酵的发酵产物的HPLC分析图：I：E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）；II：E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbB；III：E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbAB；IV：E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbABC，图中阿拉伯数字表示MCBs或其中间体，其中1、5、6、7分别代表图1中的式1、式5、式6和式7表示的化合物。

图5是β-咔啉母核6（图1中的式6表示的化合物）作为底物和芳香胺类化合物（即β-苯乙胺的不同取代物）在酰胺键合成酶McbA的催化作用下生成相应的β-咔啉类似物的HPLC分析图，I：对照；II：β-咔啉母核6和β-苯乙胺反应得到的产物1；III：β-咔啉母核6和酪胺反应得到的产物2；IV：β-咔啉母核6和4-甲氧基苯乙胺反应得到的产物3；V：β-咔啉母核6和色胺反应得到的产物4；VI：β-咔啉母核6和4-溴苯乙胺反应得到的产物8；VII：β-咔啉母核6和4-甲基苯乙胺反应得到的产物9；VIII：β-咔啉母核6和3-溴苯乙胺反应得到的产物10；IX：β-咔啉母核6和3-三氟甲基苯乙胺反应得到的产物11；X：β-咔啉母核6和2-甲基苯乙胺反应得到的产物12；XI：β-咔啉母核6和2-甲氧基苯乙胺反应得到的产物13；XII：β-咔啉母核6和2-溴苯乙胺反应得到的产物14，图中阿拉伯数字表示MCBs或其中间体，其中1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14分别代表图1中的式1、式2、式3、式4、式5、式6、式7、式8、式9、式10、式11、式12、式13和式14表示的化合物。

图6-8分别是化合物6的¹H，¹³C和HMBC的核磁共振谱的结果。

图9-11分别是化合物7的¹H，¹³C和HMBC的核磁共振谱的结果。

图12是化合物1-4，8-14的高分辨质谱及化合物5的低分辨质谱结果。I化合物1，HR-ESI-MS[M+Na]⁺：m/z380.1371，MF：C₂₂H₁₉N₃O₂；II化合物2，HR-ESI-MS[M+Na]⁺：m/z396.1321，MF：C₂₂H₁₉N₃O₃；III化合物3，HR-ESI-MS[M+Na]⁺：m/z410.1477，MF：C₂₃H₂₁N₃O₃；IV化合物4，HR-ESI-MS[M+Na]⁺：m/z419.1479，MF：C₂₄H₂₀N₄O₂；V化合物8，HR-ESI-MS[M+Na]⁺：m/z458.0474，MF：C₂₂H₁₈BrN₃O₂；VI化合物9，HR-ESI-MS[M+Na]⁺：m/z394.1526，MF：C₂₃H₂₁N₃O₂；VII化合物10，HR-ESI-MS[M+Na]⁺：m/z458.0474，MF：C₂₂H₁₈BrN₃O₂；VIII化合物11，HR-ESI-MS[M+Na]⁺：m/z448.1239，MF：C₂₂H₁₈F₃N₃O₂；IX化合物12，HR-ESI-MS[M+Na]⁺：m/z394.1524，MF：C₂₃H₂₁N₃O₂；X化合物13，HR-ESI-MS[M+Na]⁺：m/z410.1477，MF：C₂₃H₂₁N₃O₃；XI化合物14，HR-ESI-MS[M+Na]⁺：m/z458.0474，MF：C₂₂H₁₈BrN₃O₂；XII化合物5的低分辨质谱结果，[M+H]⁺：211.05。

图13是McbA的SDS-PAGE结果。

图14-15是化合物8的¹H和¹³C的核磁共振谱结果。

图16-17是化合物9的¹H和¹³C的核磁共振谱结果。

图18-19是化合物10的¹H和¹³C的核磁共振谱结果。

图20-21是化合物11的¹H和¹³C的核磁共振谱结果。

图22-23是化合物12的¹H和¹³C的核磁共振谱结果。

图24-25是化合物13的¹H和¹³C的核磁共振谱结果。

图26-27是化合物14的¹H和¹³C的核磁共振谱结果。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

1.放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652基因组序列扫描及MCBs的生物合成基因簇序列分析和功能分析。

通过对放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652进行全基因组扫描和注释，在其中找到了4 kb的marincarbolines的生物合成基因簇，包含了3个开放阅读框（open readingframes，ORFs）（表1）。根据生物信息学分析，其中mcbA、mcbB、mcbC负责MCBs的生物合成。

表1：MCBs生物合成基因簇的基因及其功能

a氨基酸数目；b括号中包含了同源蛋白的GeneBank登录号；c一致性/相似性（identity/similarity）。

2.MCBs的生物合成基因簇中各基因的功能分析。

在分析了完整的MCBs的生物合成基因簇，研究了各基因编码蛋白可能的功能的基础上，本发明对MCBs的生物合成机制进行了探讨，采用PCR-targeting技术针对3个生物合成基因，进行了灭活突变（检测引物参见表2，灭活引物参见表3），获得了相关突变株。

表2：构建突变株所需的检测引物名称和序列

表3：构建突变株所需的灭活引物名称和序列

3.mcbB在E.coli BL21（DE3）中异源表达得到的重组菌株的部分发酵产物的鉴定。

在获取MCBs生物合成基因簇的信息之后，分别将mcbABC、mcbAB和mcbB克隆到pET28a（+）的NdeI和HindIII位点并转化至E.coli BL21（DE3）以表达。对它们发酵粗提物的HPLC分析发现，E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbABC和E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbAB的发酵产物可以检测到化合物1，E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbB则可以产生中间体5、6和7。采用正相硅胶柱层析、反相中压液相色谱和高效液相色谱纯化后得到6和7，并采用了核磁共振波谱法进行鉴定（图6-11）。对化合物1的鉴定是采用的高分辨质谱法，对化合物5的鉴定是采用的低分辨质谱法（图12）。

4.McbA的体外酶反应和产物的鉴定。

在获取以上信息的基础上，将mcbA克隆到pET28a（+）的NdeI和HindIII位点并转化至E.coli BL21（DE3）以表达获得McbA粗酶液，通过镍亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳、Bradford含量测定、体外酶反应及产物鉴定证明，酶McbA负责左半部分β-咔啉母核6和右半部分芳香胺类化合物之间酰胺键的形成，所有产物（除去化合物5）均通过高分辨质谱鉴定，化合物8-14同时通过NMR鉴定（图5，图14-27）。

我们通过对突变株进行发酵和代谢产物的分析鉴定，阐明了部分生物合成基因的功能，为进一步通过对生物合成基因簇进行遗传修饰获得MCBs活性类似物提供了可能：（1）敲除了mcbA-酰胺键合成酶基因，获得的突变株ΔmcbA发酵不能生产MCBs，但是产生一个中间体6（1-酰基-3-羧基-β-咔啉，图1中的式6）；（2）敲除了mcbB-Pictet-Spengler反应酶基因，获得的突变株ΔmcbB发酵不能产生化合物MCBs或其中间体；（3）敲除了mcbC-脱羧酶基因，获得的突变株ΔmcbC发酵不能生产MCBs，但是产生一个中间体6（1-酰基-3-羧基-β-咔啉）（图3）。

以下进一步提供实施例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。

实施例1

MCBs产生菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652基因组DNA的提取：

将新鲜放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652的孢子按照5%的接种量接种于50mL的TSB培养基（胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，加水至1L，pH7.2-7.4）中，28-30℃，振荡培养约2d，4000r/min离心10min收集菌丝体。菌丝体用STE溶液（NaCl75mmol/L，EDTA25mmol/L，Tris-Cl20mmol/L，余量为水）洗涤两次，向洗涤后的菌丝体中加入30mL STE溶液和终浓度3mg/mL的溶菌酶，涡旋均匀，37℃温浴3h，加入至终浓度0.1-0.2mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃温浴10min，加入至终浓度1-2%的SDS，混匀，放入55℃水浴约1h，期间颠倒数次。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（V/V/V=25：24：1），混合均匀，置于冰上冷却30min。12000r/min，4℃离心10min，然后用剪过的大口径枪头小心吸取上清到新的离心管中，用同样的方法反复处理3次，然后用等体积的氯仿洗涤两次，12000r/min，4℃离心10min。用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管，加入1/10体积3mol/L NaAc（pH5.2），混匀后再加入等体积的异丙醇，混匀后冰上放置，沉淀DNA。小心地用玻璃棒将DNA纤维团转移至新的离心管中，用70%乙醇洗涤两次，将液体倾出，在37℃下略微烘干，加5mL TE溶解，并加入3-5U的RNA酶，由此得到放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652基因组DNA。

实施例2

Marincarbolines产生菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652基因组文库的建立：

首先通过一系列的稀释实验来确定限制性核酸内切酶Sau3A I的用量，在20μL体系中，含有17μL的链霉菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652基因组DNA，2μL的10×反应缓冲液和1μL不同稀释度的Sau3A I，其终止反应为4μL0.5mol/L EDTA和合适的上样缓冲液。通过摸索确定了0.025-0.05U的酶活单位比较合适。在此基础上通过大量部分酶切得到略大于40kb的基因组DNA片段，用去磷酸化酶进行去磷酸化处理。

用于构建文库的载体SuperCos l质粒先用限制性核酸内切酶Xba I从两个cos序列中间切开，然后进行去磷酸化处理，再从多克隆位点处用限制性核酸内切酶Bam HI切开，获得两个臂。处理后的载体与之前制备的部分酶切的约40kb的基因组DNA片段连接过夜，连接体系为10μL，含有1.25μg制备的基因组DNA片段和0.5μg处理后的SuperCos1质粒，1μL的10×Buffer，0.3U的连接酶。连接产物于65℃处理15min，使连接酶失活。从-80℃冰箱中取出一管包装混合物（50μL）置于冰上，将包装混合物在指间迅速融化，小心吸取一半包装混合物（25μL）至一个新的离心管中，加入10μL热处理后的连接产物，其余包装混合物于-80℃保存。小心混匀，30℃温浴90min，加入另外一半包装混合物（25μL），30℃温浴继续90min。加入500μL噬菌体稀释缓冲液（100mmol/L NaCl，10mmol/L MgCl₂，10mmol/L pH8.3Tris-HCl，余量为水），再加入25μL氯仿，轻轻混匀，得包装液，于4℃保存。

将冻存于-80℃的菌株E.coli LM392涂布在LB培养基上复苏。包装反应前一天，挑取单克隆接种于LB培养基中（添加0.2%麦芽糖和10mmol/L MgSO₄），37℃振荡培养过夜，包装反应当天，取5mL过夜培养的菌液加入到50mL新鲜的LB培养基中（添加0.2%麦芽糖和10mmmol/L MgSO₄），37℃，200r/min振荡至培养物OD₆₀₀达到0.8-1时，得宿主菌液，4℃保存备用。取100μL如上处理的宿主菌液和100μL适度稀释的包装液轻轻混匀，于37℃温浴15min，然后涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。将长出来的单个克隆子，用无菌牙签点种于25块含以上上述抗生素的LB培养基的96孔板上，37℃培养过夜，加入终浓度为20%的甘油，混合均匀，置于-80℃保存。

从Marincarbolines产生菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652基因组文库中筛选含有海洋咔啉生物碱的生物合成基因簇的阳性克隆子；

通过对放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652进行全基因组扫描和注释，从上述基因组文库中进行筛选，在其中找到了4kb的克隆子，确定为包含marincarbolines的生物合成基因簇的克隆子，命名为cosmid MCBs，并进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中marincarbolines的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第1-4222位的碱基序列所示，包含了3个开放阅读框（open reading frames，ORFs）（表1）。根据生物信息学分析，其中mcbA、mcbB、mcbC负责MCBs的生物合成。

实施例3

MCBs产生菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652遗传转移系统的建立及基因中断突变菌株的获得，以敲除mcbC脱羧酶基因获得突变菌株ΔmcbC为例：

利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。根据获得的MCBs的生物合成基因簇序列，参照文献报道的PCR-targeting系统，设计一对mcbC基因的敲除引物，引物序列见于表3中的mcbC灭活引物。然后参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒然后转入到接合转移的供体菌中。具体步骤如下：（1）将含有MCBs的生物合成基因簇的cosmid质粒（cosmidMCBs）转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中获得含有目的质粒的E.coli BW25113/pIJ790/MCBs菌株，用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ-red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用。（2）用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773，回收其中约1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用mcbCdelF和mcbCdelR（表3所示）引物通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μL的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer5μL，dNTPs0.5mmol/L，DMSO2.5μL，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水补至50μL。PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。（3）将PCR产物电转入（1）步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，涂布于LB筛选平板（含100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL卡那霉素，50μg/mL阿泊拉霉素）上，37℃过夜培养。从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，重组质粒命名为delmcbC，该质粒中的mcbC基因的部分片段被转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。（4）将构建好的重组突变质粒delmcbC转化到E.coli ET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/delmcbC，作为接合转移的供体菌。

野生型放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652菌株在M-ISP4培养基（可溶性淀粉10g，酵母提取物0.5g，蛋白胨1g，NaCl1g，MgSO₄·7H₂O1g，（NH₄）₂SO₄2g，K₂HPO₄1g，CaCO₃2g，海盐30g，微量元素适量，加水至1L，pH7.2）平板中划线培养3-5d，长出的孢子用无菌棉签收集于的TSB培养基中，涡旋振荡，使孢子分散。过滤分离菌丝体和孢子，孢子悬浮于5mL的TSB培养基中，50℃热激10min，然后于28℃萌发2-4h，作为接合转移的受体菌。供体菌E.coli ET12567/pUZ8002/delmcbC在50mL含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和50μg/mL阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD₆₀₀值约为0.8时，离心收集菌体（4000r/min，10min），用LB清洗菌体3遍，悬浮于300μL LB培养基中，作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μL和供体菌100μL混合均匀，涂布于不含任何抗生素的M-ISP4固体培养基上，吹干后，于28℃培养18-20h。然后将平板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为35μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于28℃培养箱中，培养3-4d后观察。

当接合转移平板上长出小菌落后，用无菌牙签将其转接到含有35μg/mL阿泊拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶的M-ISP4平板上，28℃培养2-3d后，抽取各个突变株的基因组DNA，利用检测引物（引物序列见于表2中的mcbC的检测引物序列）通过PCR检测获得阳性克隆，即获得mcbC-脱羧酶基因敲除双交换突变菌株（ΔmcbC）。

其他各个基因的灭活引物和检测引物参见表3和表2，参照上述方法，利用PCR-targeting技术获得各个基因敲除的突变菌株。

敲除了mcbA-酰胺键合成酶基因，获得的突变株ΔmcbA，敲除了mcbB-pictet-spengler反应酶基因，获得的突变株ΔmcbB。

实施例4

MCBs及其中间体的生物发酵与检测：

将放线菌Marinactinospora thermotolerans SCSIO00652野生菌或突变株（ΔmcbA、ΔmcbB或ΔmcbC）活化后，按5%的接种量分别接入到250mL三角瓶的50mL M-ISP4液体发酵培养基（不添加微量元素）中，于28℃培养6d后，加入等体积的丁酮，超声5min破碎细胞，然后静置分层。将丁酮萃取液与水相分离，用旋转蒸发仪将丁酮蒸干，残留物溶解于甲醇形成样品，进行HPLC检测，检测条件为：Alltima C18（250×4.6mm，5μm）反相柱，流动相A相为15%乙腈，含0.1%乙酸，流动相B相为85%乙腈，含0.1%乙酸；流速为1mL/min，检测波长为285nm和375nm。HPLC程序：0-20min，20%-100%B相；20-25min，100%B相；25-25.01min，100%-20%B相，25.01-30min为20%B相。

具体结果如图3所示，敲除了mcbA-酰胺键合成酶基因，获得的突变株ΔmcbA发酵不能生产MCBs，但是产生中间体6（1-酰基-3-羧基-β-咔啉）；（2）敲除了mcbB-pictet-spengler反应酶基因，获得的突变株ΔmcbB发酵不能产生化合物MCBs或其中间体；（3）敲除了mcbC-脱羧酶基因，获得的突变株ΔmcbC发酵不能生产MCBs，但是产生中间体6（1-酰基-3-羧基-β-咔啉）（图3）。

实施例5

mcbABC（SEQ ID NO.1所示1-4222的序列）、mcbAB（SEQ ID NO.1的1-2516的序列）和mcbB（SEQ ID NO.1的1572-2516的序列）在E.coli BL21（DE3）中的表达和检测：

按照常规方法分别将mcbABC、mcbAB和mcbB分别克隆至pET28a（+）的NdeI和HindIII位点以得到pET28a（+）/mcbABC，pET28a（+）/mcbAB和pET28a（+）/mcbB，然后转化至E.coli BL21（DE3）以表达，分别得到转化菌株E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbABC、E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbAB和E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbB。将得到的转化菌株分别挑取单克隆过夜培养后按1%的接种量接入到250mL三角瓶的50mL LB培养液体，于28℃摇床180r/min培养至OD₆₀₀约为0.6时，往培养液中加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。于28℃继续培12h后，往发酵物加入适量1mol/L的HCl以调节其pH值至5，加入二倍体积的乙酸乙酯，超声5min破碎细胞，然后静置分层。将乙酸乙酯萃取液与水相分离，用旋转蒸发仪将乙酸乙酯蒸干，残留物溶解于甲醇形成样品，进行高效液相色谱（HPLC）检测，检测条件为Phenomenex（150×4.6mm，5μm）反相柱，流动相A相为15%乙腈，含0.1%乙酸，流动相B相为85%乙腈，含0.1%乙酸；流速为1mL/min，检测波长为215nm和285nm。HPLC程序：0-20min，0%-70%B相；20-21min，70%-100%B相；21-26min，100%B相；26–26.01min，100%-0%B相，26.01-30min为0%B相。

以转有空载体pET28a（+）的E.coli BL21（DE3）重组菌E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）作为对照。

结果如图4所示，从图4可以看出，E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbABC和E.coliBL21（DE3）/pET28a（+）/mcbAB的发酵产物可以检测到化合物1（其NMR数据见表4），E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbB则可以产生中间体5、6和7。采用正相硅胶柱层析、反相中压液相色谱和高效液相色谱纯化后得到6和7，并采用了核磁共振波谱法进行鉴定（图6-11）。对化合物1的鉴定是采用的高分辨质谱法，对化合物5的鉴定是采用的低分辨质谱法（图12），化合物1、5、6和7的结构式如图1中的式1、5、6和7所示，其中化合物1是β-咔啉生物碱类化合物，属于海洋咔啉生物碱。

表4：化合物1-3的NMR数据（500/125MHz,TMS为内标,ppm）

表5：化合物4的NMR数据（500/125MHz,TMS为内标,ppm）

实施例6

E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbB的扩大发酵和部分产物的分离和鉴定：

Pictet-Spengler反应酶编码基因mcbB在E.coli BL21（DE3）的表达和扩大发酵见实施例5。最后经乙酸乙酯萃取得到粗提物。粗提物首先通过正相硅胶柱层析方法，经氯仿-甲醇体系梯度洗脱（氯仿：甲醇=100：0，98：2，96：4，94：6，92：8，9：1，8：2）后，顺序得到AFr.1-AFr.7共7个馏分，通过TLC结合HPLC追踪分析得到含有目标化合物的馏分。

AFr1主要含有化合物5，AFr2-AFr7再分别通过反相HPLC制备得BFr1、BFr2、BFr3三个馏分。反向制备用HPLC为KNAUER LC3000型高效液相色谱仪，制备柱为YMC C18250×20mm5μm，A流动相为100%ddH₂O+0.1%乙酸，B流动相为100%乙腈+0.1%乙酸，制备条件：30%-80%流动相B，20min；80-100%流动相B，2min；100%流动相B，5min；0%流动相B，3min；流速8mL/min，由此分别得到BFr1（保留时间5-15min）、BFr2（保留时间18-22min）、BFr3（保留时间23-30min）三个馏分。

AFr1、BFr1、BFr2、BFr3最后再分别通过反向半制备HPLC制备得到化合物5和6。反向制备高效液相色谱仪为日立半制备型，制备柱为YMC C18250×10mm5μm，A流动相为100%ddH₂O+0.1%乙酸，B流动相为100%乙腈+0.1%乙酸，制备条件：30%-80%流动相B，20min；80-100%流动相B，2min；100%流动相B，5min；0%流动相B，3min；流速2mL/min，由此分别得到化合物5馏分（保留时间21-22min）和化合物6馏分（保留时间18-19min）。制备出来的馏分经旋转蒸发仪减压加热蒸馏后得到化合物5和6，用氯仿-甲醇转移至小的玻璃瓶中，干燥后称重并转移至核磁管中，备用。AFr2主要含有化合物7，通过反相中压液相色谱得到目标物，再经日立半制备高效液相色谱仪制备，制备柱为YMC C18250×10mm5μm，A流动相为100%ddH₂O+0.1%乙酸，B流动相为100%乙腈+0.1%乙酸，制备条件：30%-80%流动相B，20min；80-100%流动相B，2min；100%流动相B，5min；0%流动相B，3min；流速2mL/min，由此分别得到化合物7馏分（保留时间13-15min），制备出来的化合物7馏分经旋转蒸发仪减压加热蒸馏后得到纯品化合物7。

化合物5、6和7的结构鉴定参见图6-11和图12，化合物5、6和7的结构如图1的式5、6、7所示。

实施例7

酰胺键合成酶McbA的表达、亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳、Bradford法含量测定、体外生化反应及产物鉴定：

按照常规方法将基因mcbA（SEQ ID NO.1的第1-1488个碱基处）克隆至pET28a（+）的NdeI和HindIII位点以得到pET28a（+）/mcbA，然后转化至E.coli BL21（DE3）以表达，得到转化菌株E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbA。

将E.coli BL21/pET28a（+）/mcbA过夜培养后，按1%的接种量接入到1L三角瓶（共计15个）的300mL LB培养液体，于28℃摇床200r/min培养至OD₆₀₀约为0.6时，往培养物中加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。再于28℃150r/min继续培6-8h，4000r/min离心10min收集菌体，用50mmol/L Tris-HCl洗涤菌体两次，最后重悬于15-20mL的Binding Buffer中（20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，5mmol/Limidazole，pH8.0），0℃超声裂解菌体。待菌体裂解后，4℃、10000r/min离心40min。然后按照以下过程纯化蛋白：（1）装柱：上清加入Ni-NTA亲和柱中，收集滤液；（2）洗涤：加入5-15mL Binding Buffer（大约5-15柱体积），收集滤液加入10-20mL Washing Buffer（大约15-20柱体积，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0，500mmol/L NaCl，50mmol/L imidazole）洗去与Ni-NTA柱相结合的杂蛋白；（3）洗脱：加入3.5mL的Elution Buffer1（20mmol/LTris-HCl，pH8.0，500mmol/L NaCl，250mmol/L imidazole）把目的蛋白从Ni-NTA柱上洗脱下来，为防止目的蛋白与Ni-NTA柱过度结合，继续用1mL Elution Buffer2（20mmol/LTris-HCl，pH8.0，500mmol/L NaCl，1mol/L imidazole）洗涤；（4）浓缩：将Elution BufferI洗脱下来的3.5mL滤液转入15mL10kD超滤管中，2500r/min、4℃离心20min，浓缩至小于2.5mL；（5）脱盐：将浓缩后的蛋白转入PD-10脱盐柱脱盐，用2.5mL的Storage Buffer洗脱（30%glycerol，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0）把目的蛋白冲洗下来，再用10kD超滤管浓缩，浓缩后的目的蛋白于-80℃或-20℃保存备用，由此得到基因mcbA编码的蛋白McbA。

纯化后的蛋白McbA取出2-20μL，补水至20μL，加入5μL5×SDS PAGE Loading Buffer，充分混匀后沸水煮10-15min，取3-8μL上样SDS PAGE电泳（Tris-Glycin缓冲液系统），同时，纯化后的蛋白分别稀释1倍、2倍、10倍，补水至20μL，加入1mL1×Bio-Rad Protein Assay试剂，反应5-60min，测定595nm下的吸光度，通过和Bradford标准蛋白含量曲线比较，计算酰胺键合成酶McbA的浓度。

蛋白McbA的SDS-PAGE如图13所示，纯化后得到的McbA蛋白的浓度约为25μM。

酰胺键合成酶McbA的体外反应如下：

0.2mmol/L化合物7+1mmol/L底物（见图5附图说明）+3mmol/L ATP+0.15μmol/L酶McbA+50mmol/L pH7.5磷酸盐缓冲液，37℃反应1h，用2倍体积0℃的甲醇终止反应后，用Vrian ProStar Workstation V6.41HPLC分析产物，通过高分辨质谱确定产物。HPLC检测条件为Phenomenex（150×4.6mm，5μm）反相柱，流动相A相为15%乙腈，含0.1%乙酸，流动相B相为85%乙腈，含0.1%乙酸；流速为1mL/min，检测波长为215nm和285nm。HPLC程序：0-20min，2%-80%B相；20-21min，80%-100%B相；21-26min，100%B相；26–26.01min，100%-0%B相，26.01-30min为0%B相。

结果如图5所示，图5中，I：对照；II：β-咔啉母核6和β-苯乙胺反应得到的产物1；III：β-咔啉母核6和酪胺反应得到的产物2；IV：β-咔啉母核6和4-甲氧基苯乙胺反应得到的产物3；V：β-咔啉母核6和色胺反应得到的产物4；VI：β-咔啉母核6和4-溴苯乙胺反应得到的产物8；VII：β-咔啉母核6和4-甲基苯乙胺反应得到的产物9；VIII：β-咔啉母核6和3-溴苯乙胺反应得到的产物10；IX：β-咔啉母核6和3-三氟甲基苯乙胺反应得到的产物11；X：β-咔啉母核6和2-甲基苯乙胺反应得到的产物12；XI：β-咔啉母核6和2-甲氧基苯乙胺反应得到的产物13；XII：β-咔啉母核6和2-溴苯乙胺反应得到的产物14，图中阿拉伯数字表示MCBs或其中间体，其中1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14分别代表图1中的式1、式2、式3、式4、式5、式6、式7、式8、式9、式10、式11、式12、式13和式14表示的化合物，式1-14的分离可以从HPLC制备得到，然后进行高分辨质谱鉴定，化合物6和7的¹H，¹³C和HMBC的核磁共振谱的结果如图6-11所示，化合物1-4，8-14的高分辨质谱及化合物5的低分辨质谱结果如图12所示，化合物1-4的NMR数据如表4和表5所示，化合物8-14核磁共振波谱如图14-27所示。由此鉴定化合物1-14的结构如图1中的式1、式2、式3、式4、式5、式6、式7、式8、式9、式10、式11、式12、式13和式14所示。

由图5可以看出，酶McbA负责左半部分β-咔啉母核6和右半部分芳香胺类化合物之间酰胺键的形成。

实施例8化合物9-14的放大制备、分离以及NMR鉴定：

称取实施例7中的E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）/mcbA菌体3g，加入50mM pH7.5磷酸盐缓冲液，超声破碎，加入7.5-15mg化合物6（根据转化率不同，加入的量不同，最大转化率80%的加入约7.5mg，最低转化率35%的加入15mg），足量的ATP，X（分别加4-甲基苯乙胺、3-溴苯乙胺、3-三氟甲基苯乙胺、2-甲基苯乙胺、2-甲氧基苯乙胺、2-溴苯乙胺，分别对应相应的产物化合物9、10、11、12、13和14），37℃反应2小时，加入30mL乙酸乙酯萃取三次：浸膏溶于2-3mL DMSO，HPLC制备，色谱仪为日立半制备型，制备柱为YMC C18250×10mm5μm，A流动相为100%ddH2O+0.1%乙酸，B流动相为100%乙腈+0.1%乙酸。方法为：30%-80%流动相B，20min；80-100%流动相B，3min；100%流动相B，10min；0%流动相B，5min；流速为2mL/min。

由此分别得到化合物9（保留时间21.6min），化合物10（保留时间22.4min），化合物11（保留时间22.1min），化合物12（保留时间21.4min），化合物13（保留时间19.9min）和化合物14（保留时间22.3min）。

Claims (3)

1.如SEQ ID NO.1的第1-4222位的碱基编码的酶在制备β-咔啉生物碱中的应用所述的β-咔啉生物碱的结构式为：

2.如SEQ ID NO.1的第1-1488位碱基编码的酰胺键合成酶McbA在催化如式(Ⅰ)所示的β-咔啉母核和芳香胺类化合物之间酰胺键的形成而产生β-咔啉生物碱中的应用

3.如SEQ ID NO.1的第1572-2516位碱基编码的Pictet-Spengler反应酶McbB在制备β-咔啉母核或β-咔啉衍生物中的应用，所述的β-咔啉母核为如式(Ⅱ)所示的化合物6，β-咔啉衍生物为如式(Ⅱ)所示的化合物5或7