CN104688719A - 绿原酸在制备治疗早衰症的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了绿原酸在制备治疗早衰症的药物中的用途。本发明绿原酸可以有效治疗早衰症，治疗效果比阳性药物雷帕霉素好，且绿原酸安全、副作用小，临床应用前景良好。

Description

绿原酸在制备治疗早衰症的药物中的用途

技术领域

本发明涉及绿原酸在制备治疗早衰症的药物中的用途。

背景技术

早衰症(儿童早老症)属遗传病，身体衰老的过程较正常快5至10倍，患者样貌像老人，器官亦很快衰退，造成生理机能下降。早衰症病童较常出现的症状包括：脱发、较晚长牙、身材矮小及皮下脂肪减少等。患病儿童一般只能活到7至20岁，大部分都会死于衰老疾病，如心血管病，现未有有效的治疗方法，只靠药物针对治疗。

已有文献报道，绿原酸具有对体内自由基进行有效清除，具有维持机体细胞正常的结构和功能，防止和延缓肿瘤、突变和衰老等现象的作用。但是早衰症不同于通常意义的衰老，早衰症(Hutchinson-Gilford Syndrome)，全称早年衰老综合症，是一种先天遗传性疾病，是一种罕见、致命的遗传疾病，患者自童年开始就快速地老化。早衰症研究基金会的研究人员认为，早衰症儿童细胞结构及功能逐渐退化的原因，是由于Lamin A蛋白质导致细胞功能的突变，细胞核膜的不稳定性引起，导致表皮萎缩，皮脂腺萎缩、动脉硬化、心血管疾病等各种综合病症发生。

目前尚无绿原酸治疗早衰症的相关文献报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供了绿原酸的新用途。

本发明提供了绿原酸在制备治疗早衰症的药物中的用途。

其中，所述的药物是上调LMNA基因的药物。 

其中，所述药物是上调核纤层蛋白A/C(Lamin A/C)的药物。

其中，所述的药物是由绿原酸为有效成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

其中，所述的药物制剂是口服制剂、注射制剂。

其中，所述的制剂每单位制剂含绿原酸1-1000mg；所述的制剂的临床使用剂量为：1-100mg/kg。

本发明绿原酸可以有效治疗早衰症，治疗效果比阳性药物雷帕霉素好，而且绿原酸已经被证明是一种安全的药物，副作用小，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。

附图说明

图1RT-PCR检测LMNA基因的表达情况

图2Wester-blot检测Lamin A/C蛋白的表达情况

具体实施方式

实施例1用绿原酸制备冻干粉针剂

1.绿原酸的提取：

本实施例中所用的绿原酸原料药，系由杜仲叶中提取、纯化得到，纯度为99.56％。

2.绿原酸冻干粉针剂的制备

2.1处方：

将以上处方加入注射用水，搅拌至完全溶解，调节pH后，用0.22μm的除菌微孔滤膜精滤，按照无菌冻干粉针剂的常规操作共制成2ml粉针剂2000支，每支含绿原酸50mg。

实施例2用绿原酸制备丸剂

1.绿原酸的提取 

本实施例中所使用的绿原酸，系由金银花中提取、纯化得到的，纯度为98.22％。

2.绿原酸丸剂的制备

2.1处方

2.2.制法：

取适量的聚维酮K30，用无水乙醇配制成溶液，再取处方量的绿原酸和淀粉，采用等量稀释法混合均匀之后，加入聚维酮K30的乙醇溶液中，充分搅拌后制得软材，采用搓丸法制得绿原酸丸剂1000粒，每粒丸剂含绿原酸1mg。

实施例3用绿原酸制备口服溶液剂

1.绿原酸的提取 

本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到，纯度为99.88％。

2.绿原酸口服溶液剂的制备

2.1处方

2.2制法

取处方量的绿原酸和焦亚硫酸钠，溶解于10L注射用水中，按照口服液的常规制备工艺，过滤后，无菌灌装成1000支口服液，每支口服液为10mL，含绿原酸300mg。

实施例4用绿原酸制备片剂

1.绿原酸的提取：

本实施例中所使用的绿原酸，系由金银花中提取、纯化得到，纯度为98.02％。

2.绿原酸片剂的制备

2.1处方：

2.2制法：

本实施例采用制湿颗粒压片法制备绿原酸片剂。(1)按处方量取羟丙甲纤维素制成水溶液；(2)取处方量的绿原酸、淀粉和甘露醇混合均匀后，加入羟丙甲纤维素水溶液，充分搅拌均匀后制成软材；(3)将制备好的软材按常规的湿法制粒的操作规程，过筛、干燥和整粒后得到大小均一的颗粒；(4)将制得的颗粒与硬脂酸镁混合均匀后压片，共制成1000片剂，每片含绿原酸100mg。

实施例5用绿原酸制备胶囊剂

1.绿原酸的提取：

本实施例中所使用的绿原酸，系由金银花中提取、纯化得到的，纯度为99.27％。

2.绿原酸胶囊剂的制备：

2.1处方：

2.2制法：

取处方量的绿原酸和糖粉，混合均匀，加入80％乙醇溶液制成软材，干燥，整粒后按照胶囊剂的常规制备工艺制备2000粒胶囊，每粒胶囊含绿原酸50mg。

实施例6用绿原酸制备颗粒剂

1.绿原酸的提取 

本实施例中所使用的绿原酸，系由杜仲叶中提取、纯化得到的，纯度为98.74％。

2.绿原酸颗粒剂的制备

2.1处方：

2.2制法：

取聚维酮K30，加入注射用水，制成溶液。取处方量的绿原酸、甘露醇和乳糖混合均匀之后，加入聚维酮K30溶液，制成软材。按照颗粒剂的常规制备工艺，对软材进行过筛、干燥和整粒之后，得到颗粒剂。在无菌条件下分装颗粒剂，制备400袋颗粒剂，每袋颗粒剂含绿原酸500mg。

实施例7用绿原酸制备散剂

1.绿原酸的提取：

本实施例所用的绿原酸原料药，系由杜仲叶中提取、纯化得到的，纯度为98.61％。

2.绿原酸散剂的制备：

2.1处方

纯度为98.61％的绿原酸1000g

2.2制法

取处方量绿原酸过筛后，按照散剂的常规制备工艺，无菌分装成含1000瓶/袋散剂，每瓶/袋散剂含绿原酸1000mg。

以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1：绿原酸对早衰症小鼠模型心肌细胞中的LMNA基因及其Lamin A/C蛋白的表达情况的影响。

1.实验材料

1.1动物

Zmpste24小鼠(Zmpste24基因敲除)30只，正常小鼠10只。

1.2实验药物及仪器

雷帕霉素，PCR仪，总RNA提取试剂盒，cDNA第一链合成试剂盒，电泳仪、电泳槽，凝胶成像仪；

2.实验方法

2.1实验分组

将早衰症模型Zmpste24小鼠30只，随机分为4组，每组10只小鼠。分别设置为模型对照组(control组，n＝10)、雷帕霉素治疗组(RAPA组，n＝10)、绿原酸治疗组(LYS组，n＝10)。同时，取未进行基因敲除的普通小鼠10只作为实验的正常对照组(NC组，n＝10)。

2.2给药方案

本实验采用灌胃给药的方式对各组小鼠进行给药治疗，其具体的给药方案如表1所示：

表1.实验分组、给药方式及给药量(注：所有给药组的给药体积相同)

2.3检测实验

2.3.1RT-PCR法检测各组小鼠心肌细胞中的LMNA基因的表达情况。

(1)心肌细胞总RNA的提取

利用RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(离心柱型)提取细胞内的总RNA，在整个提取过程当中应该预防和避免RNase污染，所用的离心管等均做无酶处理，及时更换手套，所有操作均在超净台上进行。 操作过程按说明书进行，具体提取步骤简述如下：

1.28天实验结束后，采用劲椎脱臼法处死，迅速打开胸腔摘取心脏，分组编号。每只老鼠的心脏被均匀的剪碎，之后，从每份心脏碎片中称取20mg样品，其余的样品冻存于-70℃冰箱内，备用；

2.向每份心肌组织中加入300μl的预先加有β-巯基乙醇的裂解液RL，用电动匀浆器彻底的研磨组织。向匀浆液中加入600μl的RNase-free ddH₂O和10μl的蛋白酶K,混匀后56℃处理20min；

3.将上述液体在12,000rpm条件下离心5min，小心吸取上清液使用；

4.向上清液中缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀后转移至吸附柱CR3中，12,000rpm离心1min，弃去废液，留吸附柱；

5.加入去蛋白液RW1至吸附柱中，去除蛋白，之后离心1min，弃去废液； 

6.加入DNase I工作液，去除柱体上的DNA；

7.用去蛋白液和漂洗液分别清洗吸附柱后，将吸附柱放于收集管中，充分挥干上面的残留液体；

8.向吸附柱中加入60μlRNase free ddH2O，放置2min后，12,000rpm离心2min，即得mRNA样品；

(2)mRNA的逆转录

利用cDNA第一链合成试剂盒和上述提取得到的RNA溶液合成对应的第一链cDNA。具体逆转录过程按照说明书操作，简述如下：

1.取200μl的无酶离心管置于冰浴上，并于其中加入下列溶液：

2.离心后，将离心管放置于PCR仪中，60℃孵育10min后，简短收集液体后，迅速将其转移到冰上冷却3min后补加如下试剂：

3.将离心管轻轻混匀并简短离心后，设置PCR仪45℃孵育60min，之后95℃加热10min。最后向得到的cDNA溶液中加入30ul RNase-Free ddH₂O稀释至50ul，记得第一链cDNA。

将得到的产物置于－20℃条件下保存。

(3)RT-PCR定量

EvaGreen荧光染料与双链的DNA结合会产生很强的荧光，通过检测最终的荧光强度，我们可以得到反应生成DNA的总量。在试管中加入荧光染料、(1)(2)步中所合成的cDNA产物、LMNA引物(上游引物5’-GCAAGATACACCCAAGAGCC-3’，下游引物5’-ACACCTGGGTTCCCTGTTC-3’),分组混合均匀后进行RT-PCR检测本体系使用RNase-free water代替cDNA products组为NC对照。

2.3.2Lamin A/C蛋白表达的分析

(1)Western Blot检测

①将之前冻存的生物样本取出，每份样品切取80mg左右的心肌组织，加适量PBS匀浆，弃去上清，加入5倍体积的细胞裂解液，冰上放置30min，10000rpm4℃离心1h，收集上清液；

②BCA法定量样品的蛋白浓度；

③把蛋白样品制成相同的浓度，加入样品缓冲液，沸水煮5min；

④按常规方法进行电泳；

⑤取下PVDF膜，TBS浸泡10min，5％脱脂奶粉封闭1h，TBS洗脱2次，加入一抗(1:300)，孵育2h后，TBST洗脱2次，再加入二抗(1:4000)1h，TBST洗脱2次，之后用Western-blue染液显色后观察结果。

3.实验结果

3.1RT-PCR法检测各组小鼠心肌细胞中的LMNA基因的表达情况

RT-PCR实验结果如图1所示：与NC组相比，control组的LMNA的表达均明显下调。LYS治疗组的LMNA水平显著上调,与阳性药物RAPA治疗组相比，其LMNA基因表达更显著的增高。

3.2Western Blot电泳试验结果

电泳试验结果如图2所示：与NC组相比，control组的lamin A/C蛋白的表达均显著降低。LYS治疗组的laminA有显著的提高，与阳性药物RAPA治疗组相比，其laminA蛋白的表达显著增高。该实验结果，与基因层面LMNA对应mRNA的表达水平结果基本一致。

4统计学处理 

连续型变量形式的实验数据以x±sd表示，2组数据间的比较用两样本t检验。采用SPSS13.0统计软件，P<0.05为有统计学意义。

5.结论

上述试验可以看出，从基因和蛋白两个层面检测了LYS用于治疗早衰症时，心肌组织中LMNA基因及其对应蛋白的表达情况。试验结果显示，绿原酸治疗早衰症可以显著的上调LMNA基因及其蛋白的表达，对于早衰症的治疗具有显著疗效，这一作用，与阳性药物雷帕霉素相比，具有显著性差异。对于绿原酸临床治疗早衰症提供了理论依据。

Claims (6)

1.绿原酸在制备治疗早衰症的药物中的用途。

2.根据权利要1所述的用途，其特征在于：所述的药物是上调LMNA基因的药物。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是上调核纤层蛋白A/C(Lamin A/C)的药物。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的用途，其特征在于：所述的药物是由绿原酸为有效成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的药物制剂是口服制剂、注射制剂。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的制剂每单位制剂含绿原酸1-1000mg；所述的制剂的临床使用剂量为：1-100mg/kg。